Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

Capture Hi-C maakt het mogelijk om de 3D-chromatine-organisatie van het genomische gebied van megabase-grootte met hoge resolutie te ontcijferen. Met Capture Hi-C worden een hogere resolutie en allelspecificiteit bereikt, terwijl de tijdseffectiviteit en betaalbaarheid van de techniek worden verbeterd. De toepassing van Capture IC op verschillende modelsystemen, celtypen en ontwikkelingsgereguleerde chromatinelandschappen in gezondheids- en pathologische omstandigheden zal waarschijnlijk ons begrip van de wisselwerking tussen genoomtopologie en genregulatie vergemakkelijken.

Probeer om te beginnen cellen van de controleplaat die speciaal is voorbereid voor celtelling met behulp van een geautomatiseerde celteller en tel deze cellen uit de controleplaat. Neem levensvatbaarheidskleuring op om het percentage levensvatbare cellen te bepalen. Schat op basis van dit celgetal het totale aantal cellen in de plaat dat is voorbereid voor crosslinking.

Verwijder het kweekmedium van de platen die zijn voorbereid voor crosslinking en vervang het door de fixatieoplossing. Fixeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur onder voorzichtig mengen op een shaker. Doof de vaste reactie door 2,5 molaire glycine PBS toe te voegen aan een eindconcentratie van 0,125 kiezen.

Voeg 530 microliter 2,5 molaire glycine PBS toe aan 10 milliliter in een plaat van 10 centimeter. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en meng voorzichtig op een shaker. Breng de platen over op ijs en incubeer nog eens 15 minuten op ijs terwijl je voorzichtig mengt op een shaker.

Verwijder de fixatieoplossing uit de cellen door deze in een bekerglas te gieten om een snelle hantering te garanderen. Spoel de plaat van 10 centimeter snel twee keer af met vijf milliliter koude 0,125 molaire glycine PBS om het puin en de dode cellen af te spoelen. Verwijder de vloeistof van de plaat door deze in een bekerglas te gieten om een snelle hantering te garanderen.

Voeg vijf milliliter koude 0,125 molaire glycine PBS toe aan de plaat van 10 centimeter. En schraap de cellen snel van de plaat met behulp van een plastic celschraper. Breng de celsuspensie over in een voorkoele conische centrifugebuis van 50 milliliter met behulp van een serologische pipet.

Spoel de plaat tweemaal af met vijf milliliter koude 0,125 molaire glycine PBS en voeg de celsuspensie toe aan de conische centrifugebuis. Draai 10 minuten op 480 G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant door te aspireren met een benchtop aspiratiesysteem.

Suspendien de cellen en aliquoteer 500 microliter van de celsuspensie in het berekende aantal microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Draai 10 minuten op 480 maal G bij vier graden Celsius en bewaar de droge celkorrels bij 80 graden Celsius. Ontdooi voor cellysis de bevroren pellets op ijs.

Bereid 1,5 milliliter lysisbuffer voor in water. Voeg 600 microliter van de koude lysisbuffer toe en resuspensie goed op ijs. Draai vijf minuten bij 2.655 G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant met behulp van een tafelaspiratiesysteem.

Resuspendie in 100 microliter van 0,5% SDS. Na incubatie bij 62 graden Celsius wervelend bij 1400 RPM gedurende 10 minuten, voeg 290 microliter water plus 50 microliter 10% Triton X 100 toe en meng goed, vermijd luchtbellen. Incubeer bij 37 graden Celsius met wervelen bij 1400 RPM gedurende 10 minuten voordat u 50 microliter 10 X DPN-buisbuffer toevoegt en de buis omkeert om te mengen.

Neem 50 microliter onverteerd DNA voor kwaliteitscontrole in een aparte buis. Vergeet niet om het onverteerde controlemonster te nemen. Voeg voor DPN2-vertering 10 microliter DPN2-hoge concentratie toe en meng door om te keren.

Incubeer de monsters en de onverteerde controle in een thermische mixer bij 37 graden Celsius, wervelend met 1400 rotaties per minuut gedurende meer dan vier uur. Neem voor ligatie en omkering van crosslinking 50 microliter van het geligeerde verteerde DNA voor kwaliteitscontrole in een aparte buis. Bewaar de onverteerde en niet-geligeerde controles bij 20 graden Celsius.

Voeg 800 microliter ligatiecocktail toe. Incubeer bij 16 graden Celsius, wervelend met 1000 rotaties per minuut 's nachts. Breng voor DNA-zuivering de monsters op ijs over naar voorkoelende conische centrifugebuizen van 15 milliliter en voeg twee milliliter water, 10,5 milliliter ijskoude ethanol en 583 microliter drie molair natriumacetaat toe.

Voeg 200 microliter ijskoude ethanol, 10,8 microliter natriumacetaat en één microliter van het coprecipitant toe aan de onverteerde en geligeerde kwaliteitscontroles. Incubeer bij min 80 graden Celsius gedurende ten minste vier uur tot 's nachts. Draai de 15 milliliter buizen op 2200 G bij vier graden Celsius gedurende 45 minuten.

Verwijder voorzichtig ethanol en droog de monsters en controles aan de lucht bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Niet te droog maken. Resuspendeer de monsters en controles in respectievelijk 100 microliter en 20 microliter water.

Voor kwaliteitscontrole van 3C-sjabloonvoorbereiding, laad 100 tot 200 nanogram van elk monster en elke controle op een 1% agros 1XTBE-gel. Om vervolgens doelverrijking uit te voeren voor pared end multiplex sequencing, neemt u vier microgram 3C-sjabloon en resuspenseert u deze in 130 microliter water voor elke vangstreactie. Soniceer het monster en ga verder met de bereiding met drie microgram van het geschoren DNA.

Om de bereide DNA-monsters te hybridiseren naar de doelspecifieke RNA-sondes, gebruikt u 750 nanogram DNA-monsters in een eindvolume van 3,4 microliter, wat resulteert in een beginconcentratie van 221 nanogram per microliter. Gebruik indien nodig snelheidsvacuümconcentratie om het uiteindelijke volume van 3,4 microliter te bereiken. Voor monsters die in 10 microliter worden gesuspendeerd, is een concentratie van 15 tot 20 minuten voldoende.

Incubeer het hybridisatiemengsel gedurende 16 tot 18 uur bij 65 graden Celsius met een verwarmd deksel bij 105 graden Celsius, volgens de instructies van de fabrikant. Om de beoogde ligatiefragmenten vast te leggen, voegt u streptivide in gekoppelde kralen toe aan het gehybridiseerde monster van de sonde. Ten slotte, om de monsters voor te bereiden op multiplex sequencing, zet het protocol voort volgens het doelverrijkingssysteem dat in deze studie wordt gebruikt voor gepaarde en gemultiplexte sequencing.

De resolutie van de Capture Hi-C interactiekaart maakt de identificatie mogelijk van twee kleinere domeinen in de Tsix-tad die de promotor van de Tsix locus bevat. Dit werd niet eerder bereikt met 5C. Bovendien zijn andere sub-tad-structuren, zoals contactlussen, duidelijk zichtbaar in de Capture Hi-C-gegevens, zoals de lus tussen Xist en FTX, eerder geïdentificeerd met Capture C en de lus tussen Xist en Xert die onlangs is geïdentificeerd met behulp van een vergelijkbaar protocol voor Capture Hi-C.

Andere contacten kunnen ook nauwkeuriger in kaart worden gebracht door de verhoogde resolutie van de Capture Hi-C-profielen, zoals die de bekende contacthotspots vormen binnen de Tsix-tad tussen de Linx-, Chic1- en Xite-loci. In vergelijking met de getoonde Hi-C-gegevens zorgde Capture Hi-C voor een viervoudige toename van de resolutie, maar het vereiste slechts een vierde van de sequencingdiepte. Het is erg belangrijk om niet te vergeten om 50 microliter onverteerde en niet-geligeerde DNA-monsters te nemen als kwaliteitscontrole voor de 3C-sjabloonvoorbereiding.