Creatie van een kniegewricht-op-een-chip voor het modelleren van gewrichtsaandoeningen en het testen van medicijnen

Ons vermogen om nauwkeurig te voorspellen hoe mensen reageren op geneesmiddelen tijdens klinische onderzoeken is beperkt vanwege het gebrek aan fysiologisch relevante preklinische modellen. Dit microfysiologische systeem kan die ongelijkheid aanpakken. Dit van menselijke cellen afgeleide systeem bootst nauwkeurig de hele gewrichtsziekte na aard van artrose in de menselijke knie, wat het mogelijk maakt om ziektemodificerende artrosegeneesmiddelen te testen voorafgaand aan klinische proeven, waardoor mogelijk miljoenen dollars worden bespaard.

Begin met het bereiden van methacrylaatgelatine, of GelMA, door 17 gram gelatine type B toe te voegen aan 500 milliliter gedestilleerd water. Meng het gedurende 30 minuten op een shaker op 37 graden Celsius en voeg 13 milliliter methacrylanhydride toe voordat je het een nacht mengt op een shaker. Bereid de volgende dag ongeveer 60 milliliter aliquots van de GelMA in dialysezakken.

Leg alle dialysezakjes zeven dagen in gedestilleerd water met een roerstaaf. Ververs het water meerdere keren per dag en laat de zakken een nacht op vier graden Celsius staan. Giet op dag zeven de GelMA in een schaal en vries deze in bij min 80 graden Celsius voor de lyofilisatie.

Vervolgens lyofileer de GelMA door deze in de vacuümkamer van een lyofilisator te plaatsen. Zorg voor volledige droging voordat u de lyofilisator verwijdert. Los vervolgens de gelyofiliseerde GelMA op in de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks met een concentratie van 15% en stel de pH in op 7,4 met behulp van een kleine hoeveelheid natriumhydroxide.

Op basis van het verkregen volume vult u de oplossing aan met antibiotisch antimycotisch en 0,15% lithiumfenylfosfosfonaat of LAP. Bescherm de GelMA-oplossing tegen licht en bewaar deze bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. Autoclaaf 3D-geprinte dual flow bioreactorkamers, deksels en inzetstukken in autoclaafzakken bij 121 graden Celsius gedurende 20 minuten met stoom.

En dan, gedurende 20 minuten met droge hitte. Week na sterilisatie de bioreactorkamers, deksels en inzetstukken 's nachts in 15 milliliter steriele PBS in de bioveiligheidskast, gevolgd door volledige droging. Gebruik een pipet van 1000 microliter om 20 keer 10 tot de zesde van het menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen, of MSC's, per millilitercellen in een 15% GelMA-oplossing te resuspenderen.

Druk vervolgens een steriele, droge siliconen vorm tegen een petrischaaltje met steriele handschoenen. Plaats een inzetstuk in elk gat van de siliconenvorm met een tang met de gatzijde van het inzetstuk naar beneden gericht. Als u klaar bent, voegt u ongeveer 50 microliter van de celsuspensie per insert toe met behulp van een pipet van 200 microliter.

Cross-link de gel in de insert door de bovenkant bloot te stellen aan een 395 nanometer golflengte UV-zaklamp gedurende 1,5 minuut en vervolgens de andere kant gedurende 30 seconden te verlichten. Breng met een steriele tang de inserts onmiddellijk over in acht milliliter groeimedium in een niet-weefselkweekplaat met zes putten en laat de cellen 's nachts herstellen. Om de differentiatie van vetweefsel te initiëren, brengt u de inserts over naar acht milliliter adipogeen medium en kweekt u ze gedurende 28 dagen met dagelijkse mediumverandering.

Om de osteochondrale eenheden te engineeren, plaatst u de inserts in bioreactorkamers met dubbele stroom, sluit u de putten af en infundeert u de twee stromen afzonderlijk met een stroomsnelheid van vijf microliter per minuut met 35 milliliter osteogeen medium en 35 milliliter chondrogenisch medium. Houd cellen gedurende 28 dagen voor differentiatie door tweewekelijkse spuitwisselingen uit te voeren met de respectieve mediumtypen. Om de fibroblasten af te leiden, differentiëren de MSC's in 2D-cultuur in een T-150 vierkante centimeter weefselcelkweekkolf met 20 milliliter fibrogeen medium gedurende 21 dagen.

Houd de wekelijkse verandering van het medium in stand. Gebruik na 21 dagen vier milliliter trypsine om de cellen los te maken. Sluit de 3D-gels in de inzetstukken in.

Om synoviaal-achtig vezelig weefsel, of SFT, te verkrijgen, volgt u een soortgelijk protocol. Sluit de siliconen slang, met een binnendiameter van 0,062 inch en een buitendiameter van 0,125 inch, aan op de minijoint bioreactorbalk aan het ene uiteinde en F 1/16e lokvergrendelingsconnectoren aan het andere uiteinde. Autoclaaf vervolgens de 3D-minijoint-bioreactoren samen met de siliconenbuizen en deksels.

Bereid en laad 35 milliliter medium voor gebruik voor de minijoint-cultuur in de mediumreservoirs. Gebruik een rechte tang om de osteochondrale eenheden van de dual flow bioreactor over te brengen naar de rechterput van de minijoint bioreactor. Breng het inzetstuk van het vetweefsel en het inbrengen van vezelig weefsel over in respectievelijk de linker- en middelste put, voordat alle putjes worden bedekt met gesteriliseerde deksels.

Sluit de minijoint clipinlaten aan op de middelgrote reservoirs en de uitlaten op spuiten. Monteer vervolgens de spuiten op een spuitpomp. Breng de pomp en chips over naar een incubator.

Plaats de middelgrote reservoirs op ijs buiten de incubator. Bedien de pomp in de opzuigmodus en trek het medium uit het mediumreservoir in de minijoint bioreactorkamer. Ga door met dit minijoint kweekproces gedurende 28 dagen.

Om de gewrichtsontsteking en kraakbeendegeneratie te modelleren, voegt u interleukine één bèta toe aan de fibrogene mediumstam met 10 nanogram per milliliter gedurende zeven dagen. Zorg ervoor dat u de spuit op de derde dag vervangt voordat u verse interleukine één bèta aan het fibrogene medium verstrekt. Voor het testen van geneesmiddelen, na drie dagen interleukine één bètabehandeling, dient u het geneesmiddel toe in het gedeelde medium, waarbij een intra-articulaire toediening wordt gesimuleerd, of in alle mediumtypen, waarbij een systemische toediening wordt gesimuleerd.

Na zeven dagen interleukine één bètabehandeling, verzamel individuele weefsels voor de analyse. Nadat u de inserts met een steriele tang hebt verwijderd, duwt u een biopsiepons door het midden van de insert om de gel te verwijderen en de gel in PBS te plaatsen. Snijd vervolgens de osteochondrale gels doormidden terwijl u de genexpressie beoordeelt.

Verzamel en centrifugeer ongeveer 1,5 milliliter media van elke mediumbron bij 14.000 G gedurende 10 minuten. Na het weggooien van het sediment, flash bevriest u de geconditioneerde media in vloeibare stikstof. Voor histologische kleuring en immunokleuring fixeert u eerst het osteochondrale en synoviale vezelweefsel, of SFT-monsters, in 10% gebufferde formaline en droogt u ze uit in ethanol van oplopende concentraties.

Wis het monster in xyleen, sluit ze in paraffine in en snijd de monsters ten slotte in zes micrometer dikte. In het geval van vetweefsel, kleurt u de 10% gebufferde formele en vaste monsters direct met olierode O-oplossing of BODIPY. De weefselspecifieke fenotypen werden goed onderhouden voor de individuele microweefsels.

Alle weefsels van de minijoint werden verzameld om hun fenotypes na 28 dagen cultuur te analyseren. De botvormige component van de microweefsels van de osteochondrale eenheden bracht hoge niveaus van osteocalcine tot expressie. In het kraakbeengedeelte van het osteochondrale drukten weefsels significant hoge niveaus van collageen type twee en aggrecan uit.

De expressieniveaus van representatieve adipogene genen, adiponectine en leptine waren hoger in het vetweefsel. De afzetting van calciummineralen, alkalische fosfatase en osteocalcine-eiwit werd voornamelijk gezien in de botgrootte van osteochondrale microweefsels. Kraakbeenzijde van osteochondrale weefsels vertoonde goed vastgehouden glycosaminoglycaan en collageen type twee.

De expressie van chondrocytenhypertrofie geassocieerde markers, collageen type 10 en Indiase egel, was significant down-gereguleerd na 28 dagen cultuur. Overvloedige lipidedruppelafzetting werd gevonden in het vetweefsel. De immunofluorescente kleuring vertoonde robuuste smeer- en cadherine 11-expressie door de SFT na vier weken kweek.

In een ziektemodel resulteerde IL één bètabehandeling in celapoptose en verhoogde MMP-13-niveaus in de SFT. De kraakbeenafbraak werd behandeld met IL one beta, wat wijst op het optreden van kruisverwijzing tussen de osteochondrale weefsels en SFT. De therapeutische werkzaamheid van naproxen door systemische toediening toonde verminderde kraakbeenafbraak in IL one beta minijoint.

De realtime PCR gaf aan dat de vier potentiële ziektemodificerende artrosemedicijnen het kraakbeenverlies gedeeltelijk omkeerden. De belangrijkste stappen van deze procedure zijn crosslinking van de gels in de inserts en de plaatsing van de insert in de bioreactor. De chip maakt het mogelijk om de bijdrage van andere risicofactoren bij artrose te onderzoeken, zoals obesitas en mechanisch letsel.

Het kan ook worden gebruikt om andere gewrichtsaandoeningen te bestuderen.