Name: Ontwerp en implementatie van een ex vivo longperfusiemodel voor ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Leer een kosteneffectief en modulair ex vivo longperfusiemodel voor ratten. Deze methode maakt gecontroleerde longfysiologiestudies mogelijk en vult in vivo onderzoek aan voor nieuwe inzichten in ademhalingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteuning werd gedeeltelijk verleend door een Merit Review Award (101 BX003482) van de U.S. Department of Veteran Affairs Biomedical Laboratory R&D Service, een NIH-subsidie (5R01 HL123227), een Transformative Project Award (962204) van de American Heart Association en door institutionele fondsen toegekend aan Dr. Riess. Dr. Balzer ontving niet-gerelateerde financiering van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Onderzoeksstichting), projectnummer BA 6287/1-1. De auteurs willen Matthew D. Olsen, Chun Zhou, Zhu Li en Rebecca C. Riess bedanken voor hun waardevolle bijdragen aan het onderzoek.

Het in vivo gedeelte van de experimenten (van algemene anesthesie tot euthanasie) vereist voorafgaande goedkeuring van de respectieve Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle hierin beschreven procedures zijn goedgekeurd (protocolnummer M1700168) door de IACUC van het Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, en werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen14. Voorafgaand aan de experimenten werden alle ratten gehuisvest in de dierenverzorgingsfaciliteit van het instituut, met vrije toegang tot water en voedsel. Met inbegrip van verschillende studies buiten het bestek van dit manuscript, hebben we tot nu toe in totaal 148 mannelijke Sprague Dawley-ratten gebruikt, 7-10 weken oud, met een gewicht tussen 250 g en 400 g.
1. Apparatenbouw
NOTITIE: Alle onderdelen, inclusief de respectievelijke fabrikanten, staan vermeld in de materiaaltabel.
<ol><li>Om elk apparaat op zijn plaats te houden, construeert u een op maat gemaakt rooster om eenvoudige configuratie en integratie van de nieuwe apparaten mogelijk te maken (Afbeelding 1). Bevestig aluminium palen (1 tot 2 ft lang, 1 cm in diameter, verkrijgbaar bij elke ijzerhandel) aan elkaar met behulp van kruisklemmen om een 3D-rooster te creëren en plaats ze op een plastic bak (30 inch x 21 inch) om morsen van vloeistoffen te voorkomen.</li>
	<li>Monteer drukopnemers op gelijke hoogte aan de longen en sluit ze aan op de leidingen voor de longslagader (PA), longader (PV) en op de ventilatiebuis. OPMERKING: Deze transducers verzenden gegevens naar hun respectievelijke bioversterkers die zijn aangesloten op het data-acquisitiesysteem (DAQ) en de bijbehorende software.</li>
	<li>In plaats van in de handel verkrijgbare canules te gebruiken, maakt u op maat gemaakte canules (Figuur 2) van segmenten van 2 mm brede, harde plastic buizen die aan het uiteinde uitlopen, met behulp van een open vlam om het veilig afbinden van hechtingen mogelijk te maken. Buig ze in een U-vorm om de belasting van de longen tijdens het hangen te verminderen en om in de longkamer te passen.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat de longen in de kamer moeten worden geventileerd en doorbloed, plaatst u een bekerglas van 1.000 ml in een bekerglas van 1.500 ml met een waterbad tussen de twee en in de beker van 1.000 ml, zodat een dubbele boiler ontstaat. Plaats deze bekers op een verwarmingsplaat die is ingesteld op 48 °C, zodat er een kamer voor de longen ontstaat die zowel vochtig is als bestand tegen temperatuurschommelingen.</li>
	<li>Bewaar de buffer voor het experiment in een maatkolf van 150 ml op een verwarmingsplaat die op 37 °C is ingesteld. Gebruik een magnetische roerstaaf om de buffer in de beker te laten circuleren. Stel de meniscus van de buffer in op een zodanige hoogte dat deze zich 4 cm boven de long bevindt, om een aangeboren druk van 4 cmH2O op de PV te creëren. Zorg er tijdens de operatie voor dat de longen van het dier zich op dezelfde hoogte bevinden als de buffer om de vorming van hydrostatisch oedeem te verminderen. OPMERKING: Het gebruik van een kolf minimaliseert de hoeveelheid oppervlak die in contact komt met kamerlucht, waardoor gasdiffusie tot een minimum wordt beperkt.</li>
	<li>Gebruik een rolpomp om de buffer door een circuit te bewegen dat bestaat uit een verwarmingsspiraal en een luchtafscheider voordat de long wordt doorbloed. Recycle het afvalwater van de PV terug in de maatkolf. Sluit zowel de verwarmingsspiraal als de luchtafscheider aan op een circulerend waterbad dat ook op 37 °C is ingesteld. Pas de temperatuur van het waterbad aan op basis van de pompsnelheid, zodat het perfusaat een constante temperatuur van 37 °C heeft.</li>
</ol>2. Werkwijze
<ol><li>Bereid voor de start van het experiment de opstelling voor.<ol><li>Zorg ervoor dat de software draait (zie hieronder) en gegevens correct verzamelt.</li>
		<li>Kalibreer alle drukopnemers dagelijks om er zeker van te zijn dat ze niet afdrijven.</li>
		<li>Bereid de buffer voor (zie tabel 1 voor ingrediënten voor een fysiologische zoutoplossing met 4% runderserumalbumine [BSA]) en zorg ervoor dat de pH 7,4 is, gebruik HCl om dienovereenkomstig aan te passen. Stel het perfusiesysteem in met een verwarmde buffer (tabel 1) die overal circuleert en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Voeg BSA minstens 30 minuten voor aanvang van het experiment toe om het voldoende tijd te geven om op te lossen. Bij afwezigheid van een oxygenator, bel gas in de perfusiebuffer voorafgaand aan de toevoeging van BSA met een gassamenstelling van 65% N2, 30% O2 en 5% CO2 om de CO2 -niveaus van in vivo longen na te bootsen. Dit voorkomt dat de oplossing gaat schuimen zodra BSA is toegevoegd.</li>
		<li>Bereid het operatiegebied voor met alle benodigde chirurgische instrumenten, hechtingen en tape. Kantel de operatieplank in een hoek van 15°, zodat de verdoofde rat met zijn kop boven de rest van het lichaam kan worden gepositioneerd en de luchtpijp en het hart-longblok gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd.</li>
		<li>Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, weeg de rat en geef een intraperitoneale injectie met pentobarbital (65 mg/kg-1). Gebruik na 10 minuten een teenknijp om ervoor te zorgen dat het chirurgische vlak van algemene anesthesie is bereikt. Dien indien nodig meer verdoving toe.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de rat over naar het operatiegebied en bevestig hem aan de operatieplank door zijn voorpoten afzonderlijk af te plakken, gevolgd door de achterpoten aan elkaar, en zorg ervoor dat de voorpoten los genoeg zijn getapet om een pijnreflex te kunnen visualiseren als de anesthesie niet diep genoeg is (Figuur 3A).</li>
	<li>Zet de kop van de rat vast door de bek af te plakken met een lange, dunne strook achter de voortanden, zonder de tong of luchtstroom voor de nog spontaan ademende rat te beperken (Figuur 3B).</li>
	<li>Voer een tracheostomie uit door met een tang in de huid boven de luchtpijp te knijpen en te knippen met een chirurgische schaar. Gebruik een gebogen pincet om de spier en het weefsel botweg te ontleden om de luchtpijp te bereiken. Zorg ervoor dat er tijdens deze stap geen bloeding optreedt.<ol><li>Steek een gebogen pincet onder de luchtpijp door en open ze zodat er ruimte is om 3-0 hechtingen eronder door te laten gaan die vervolgens vooraf in een doosknoop kunnen worden vastgemaakt (Figuur 3B). Maak een kleine incisie tussen de kraakbeenringen van de luchtpijp en breng de tracheacanule in (gemodificeerde naald van 18 G met slang met een diameter van 1 mm die rond de punt is gelijmd om een inkeping te maken). Bind de hechtdraad af en zorg ervoor dat er geen lucht uit de tracheale incisie kan ontsnappen en dat de canule de luchtpijp niet belast.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de ventilator in om te draaien met een gasmengsel van 30% O2, 5% CO2 en 65% N2, met een teugvolume (VT) van 10 ml/kg, een positieve expiratoire einddruk (PEEP) van 0 cmH2O en een snelheid van 60 ademhalingen/min.</li>
	<li>Zodra de tracheale canule is vastgezet met de hechtdraad, begint u met het ventileren van de rat met de bovenstaande instellingen. OPMERKING: De gebruikte chirurgische methode is overgenomen van Nelson et al.9 en wordt stap voor stap beschreven.</li>
	<li>Verwijder de vacht van de buik van de rat met behulp van een grote chirurgische schaar en een tang. OPMERKING: Ontharingszalven kunnen ook vóór de start van het experiment worden gebruikt.</li>
	<li>Terwijl u de processus xiphoid met een tang vasthoudt, maakt u een kleine horizontale incisie onder de ribben, zodat het middenrif intact blijft. Zodra de inwendige organen veilig kunnen worden gevisualiseerd, verbreedt u de horizontale snede om het hele middenrif bloot te leggen.</li>
	<li>Injecteer heparine (3.000 E/kg-1) in de inferieure vena cava (IVC) met een spuit van 22 G om te voorkomen dat de longen worden doorboord.</li>
	<li>Nogmaals, houd het xiphoid-proces met een tang vast en snijd craniaal langs het borstbeen terwijl u constant de longen visualiseert om te voorkomen dat ze worden gesneden.</li>
	<li>Om het hart-longblok goed te kunnen zien, spreidt u de ribbenkast uit elkaar met behulp van twee grote tangen en zorgt u ervoor dat u de ribben niet breekt, wat kan resulteren in een scherp botfragment dat de long doorboort (Figuur 3C). OPMERKING: Zodra de ribbenkast is geopend, gebruikt u een PEEP van 2-3 cmH2O, ingesteld door een waterslot dat is bevestigd aan het uitademingsuiteinde van de ventilator, om atelectase te voorkomen.</li>
	<li>Snijd op dit moment de IVC door om de rat te euthanaseren door verbloeding. Zorg er zorgvuldig voor dat er ten minste 1 minuut is verstreken sinds de injectie van heparine (zie stap 2.9) om het voldoende tijd te geven om te circuleren en microstolsels in de longen te voorkomen.</li>
	<li>Controleer bij het plaatsen van de perfusiecanules voortdurend de druk om er zeker van te zijn dat er geen plotselinge veranderingen optreden. NOTITIE: Een plotselinge drukpiek terwijl de pomp op een constant toerental draait, duidt op verstoppingsvorming, terwijl een plotselinge afname kan duiden op een lekkage.</li>
	<li>Snijd overtollige thymus bij om een gemakkelijkere visualisatie van het pulmonale vaatstelsel mogelijk te maken. Zoek de PA, passeer de kleine, gebogen pincet eronder en haal er opnieuw een 3-0 hechting onder en knoop deze vooraf in een doosknoop.</li>
	<li>Maak een kleine incisie in de rechterventrikel van het hart en breng de PA-canule in (gemaakt van een plastic slang met een diameter van 2 mm die aan het uiteinde uitloopt met behulp van een open vlam om hechtingen eromheen te kunnen binden), wees voorzichtig om te voorkomen dat de aangrenzende slagader scheurt. Zet de canule vast met behulp van de hechtdraad en perfuse, beginnend bij 1.5 ml/min-1 (Figuur 3D).</li>
	<li>Snijd onmiddellijk de top van het hart weg om drukopbouw in de longen te voorkomen. Scheur met een kleine, gebogen tang de mitralisklep en zorg er visueel voor dat de tang onbeperkt het linker atrium kan binnendringen.</li>
	<li>Plaats een vooraf gebonden 3-0 hechting rond het hart onder het atrium (Figuur 3E).</li>
	<li>Plaats de PV-canule (vergelijkbare constructie als de PA-canule) in het linker atrium en zorg ervoor dat de buffer eruit kan stromen voordat u de hechting afhecht. NOTITIE: Het is van cruciaal belang dat de PV-canule voorbij de mitralisklep wordt geplaatst om ervoor te zorgen dat deze goed kan worden afgebonden, terwijl deze niet te diep wordt geplaatst om de PV of de laststroom te beschadigen (Figuur 3E). Wees extra voorzichtig bij het vastbinden van de hechtdraad, omdat te los binden leidt tot verlies van bloedstroom, terwijl te strak vastbinden het hart kan beschadigen, de plaatsing van de canule kan verzwakken en mogelijk lekkage kan veroorzaken.</li>
	<li>Knip overtollig weefsel tussen de borstholte en de incisie in de tracheostomie af met een schaar met stompe punt om beschadiging van de luchtpijp te voorkomen. Zorg ervoor dat de gehele luchtpijp onder de tracheacanule en het gehele hart-longblok zichtbaar zijn.</li>
	<li>Verwijder het hart-longblok en de luchtpijp door de tracheale canule vast te houden en het bindweefsel achter de luchtpijp weg te snijden met een gebogen schaar met stompe punt, waarbij de slokdarm vastzit voor extra structurele ondersteuning (Figuur 3F).</li>
	<li>Verhoog het debiet geleidelijk tot een maximaal debiet van 40 ml/kg-1/min-1. Laat de eerste 50 ml buffer uit het systeem stromen om eventuele inflammatoire cytokines die vrijkomen te verwijderen (Figuur 3G).</li>
	<li>Verplaats de geïsoleerde longen voorzichtig naar de dubbele ketelkamer die met de twee bekers is gemaakt. Zorg ervoor dat de PA-, PV- of tracheale canule op geen enkel moment verdraaid raakt tijdens het bewegen van de longen of het ophangen ervan. OPMERKING: Preventie van atelectase tijdens het ophalen van de longen en verbinding met de opstelling is belangrijk, vooral wanneer EVLP wordt gebruikt voor reeds beschadigde longen of wanneer interventies voorafgaand aan EVLP zijn gepland. Dit kan worden bereikt door bijvoorbeeld een kleine clip op de luchtpijp na inspiratie voordat deze wordt overgebracht naar de ventilator15.</li>
</ol>3. Data-acquisitie
<ol><li>Gebruik voor het verzamelen van gegevens een in de handel verkrijgbare analoog-naar-digitaal-omzetter en DAQ-systeem.</li>
	<li>Let erop dat de bemonsteringsfrequentie voldoende is voor het gegeven doel (hier 200 Hz) en dat alle relevante afhankelijke parameters van bioversterkers en andere invoerapparaten gelijktijdig worden verzameld (luchtwegdruk, PA en PV-druk gekozen voor dit protocol)16.</li>
	<li>Registreer onafhankelijke parameters (bijv. perfusiesnelheid, ventilatiesnelheid, geventileerde gassamenstelling, bufferelektrolytsamenstelling en longgewicht).</li>
</ol>

<ol><li>Uhlig, S., Taylor, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUhlig%2C+S+%22Methods+in+Pulmonary+Research%22">Methods in Pulmonary Research</a>. , Birkhäuser. (1998).</li>
<li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+year+follow-up+of+lung+transplantations+using+initially+rejected+donor+lungs+after+reconditioning+using+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).</li>
<li>Stone, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+with+adenosine+A2A+receptor+agonist+enhances+rehabilitation+of+murine+donor+lungs+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion with adenosine A2A receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death.</a> Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).</li>
<li>Valenza, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consumption+of+glucose+during+ex+vivo+lung+perfusion+correlates+with+lung+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The consumption of glucose during ex vivo lung perfusion correlates with lung edema.</a> Transplantation Proceedings. 43 (4), 993-996 (2011).</li>
<li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95 (2), 196-203 (2004).</li>
<li>McAuley, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+grade+allogeneic+human+mesenchymal+stem+cells+restore+alveolar+fluid+clearance+in+human+lungs+rejected+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinical grade allogeneic human mesenchymal stem cells restore alveolar fluid clearance in human lungs rejected for transplantation.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (9), L809-L815 (2014).</li>
<li>Pego-Fernandes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+of+isolated+lung+perfusion+in+rats%3A+first+Brazilian+experience+using+the+IL-2+isolated+perfused+rat+or+guinea+pig+lung+system%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system.</a> Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).</li>
<li>Noda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+prolonged+ex+vivo+lung+perfusion+for+graft+preservation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).</li>
<li>Nelson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+isolated+ex+vivo+lung+perfusion+in+a+rat+model%3A+lessons+learned+from+developing+a+rat+EVLP+program%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e52309(2015).</li>
<li>Bassani, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+lung+perfusion+in+the+rat%3A+detailed+procedure+and+videos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo lung perfusion in the rat: detailed procedure and videos.</a> PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).</li>
<li>Watson, K. E., Segal, G. S., Conhaim, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+pressure+ventilation+enhances+acinar+perfusion+in+isolated+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Negative pressure ventilation enhances acinar perfusion in isolated rat lungs.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217753596(2018).</li>
<li>Ohsumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+translational+rat+ex+vivo+lung+perfusion+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).</li>
<li>Hozain, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiday+maintenance+of+extracorporeal+lungs+using+cross-circulation+with+conscious+swine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Multiday maintenance of extracorporeal lungs using cross-circulation with conscious swine.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (4), 1640-1653 (2020).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>van Zanden, J. E., Leuvenink, H. G. D., Verschuuren, E. A. M., Erasmus, M. E., Hottenrott, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+rat+model+for+ex+vivo+lung+perfusion+of+pre-injured+lungs+after+brain+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A translational rat model for ex vivo lung perfusion of pre-injured lungs after brain death.</a> PLoS One. 16 (12), e0260705(2021).</li>
<li>Cleveland, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+LabVIEW+as+a+virtual+instrument+in+a+cost-effective+isolated+lung+setup%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Implementation of LabVIEW as a virtual instrument in a cost-effective isolated lung setup.</a> The FASEB Journal. 33 (1), 846(2019).</li>
<li>Jamieson, S. W., Stinson, E. B., Oyer, P. E., Baldwin, J. C., Shumway, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operative+technique+for+heart-lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Operative technique for heart-lung transplantation.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 87 (6), 930-935 (1984).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+nitric+oxide+synthase+expression+and+activity+during+rat+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alterations of nitric oxide synthase expression and activity during rat lung transplantation.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 278 (5), L1071-L1081 (2000).</li>
<li>Riess, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+measurements+in+blood-free+balanced+salt+solutions+with+three+devices+%28i-STAT%C2%AE%2C+glucose+test+strips+and+ACCU-CHEK%C2%AE+Aviva%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Glucose measurements in blood-free balanced salt solutions with three devices (i-STAT®, glucose test strips and ACCU-CHEK® Aviva).</a> Anesthesia and Analgesia. 128 (5), 924(2019).</li>
<li>Menezes, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Celsior+and+Perfadex+lung+preservation+solutions+in+rat+lungs+subjected+to+6+and+12+hours+of+ischemia+using+an+ex-vivo+lung+perfusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics%22%5BJournal%5D)">Comparison of Celsior and Perfadex lung preservation solutions in rat lungs subjected to 6 and 12 hours of ischemia using an ex-vivo lung perfusion system.</a> Clinics. 67 (11), 1309-1314 (2012).</li>
<li>Riess, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrolyte+measurements+in+blood-free+balanced+salt+solutions+-+comparison+of+i-STAT%C2%AE+with+ABL80%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Electrolyte measurements in blood-free balanced salt solutions - comparison of i-STAT® with ABL80.</a> Anesthesia and Analgesia. 130 (5), 984(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.

Met deze opstelling zijn meer dan 100 experimenten succesvol uitgevoerd in ons lab. Het modulaire ontwerp van deze op maat gemaakte opstelling gaf een grote flexibiliteit aan mogelijke veranderingen in experimentele vereisten. Terwijl andere opstellingen een deoxygenator18 gebruiken om een constant zuurstofverbruik en CO2 - productie door eindorganen na te bootsen, maakte dit vereenvoudigde model geen gebruik van deze functie, vanwege de focus op het bestuderen van de effecten van versc...

Ex vivo longperfusie (EVLP)-technieken1 zijn de afgelopen tien jaar steeds vaker gebruikt als middel om longtransplantaties2, ischemie/reperfusie3, longmetabolisme4 en immuunresponsen5 te bestuderen. Geïsoleerde, maar intacte, geventileerde en geperfuseerde longen bieden het uiterst belangrijke vermogen om de respons van de longen, inclusief het pulmonale vaatstelsel, op mogelijke interventies en/of therapieën direct te beoordelen zonder mogelijke confounders, zoals neuronale en hormonale input of veranderende hemodynamica in vivo. Tegelijkertijd behouden ze het fysiologische samenspel van ventilatie en perfusie, in tegenstelling tot in vitro-omstandigheden. Een voorstel dat bijvoorbeeld kijkt naar immuunresponsen in longen5 heeft dezelfde kwaliteit van gegevens nodig als een onderzoek dat gericht is op het vergroten van de donorpool6 voor longtransplantaties. EVLP kan worden gebruikt bij verschillende diersoorten, waaronder muizen3, ratten 7,8,9,10,11,12, varkens 13 en mensen 2. Daarom is het noodzakelijk om een model op te zetten dat betrouwbare gegevens kan produceren van een verscheidenheid aan verschillende experimentele parameters. Klinische relevantie zal worden gegenereerd in volgende studies met behulp van het EVLP-model als hulpmiddel.
Hoewel commerciële opstellingen voor de meeste soorten te koop zijn, kunnen ze vaak onbetaalbaar zijn en onderzoekers beperken tot een specifiek merk apparatuur en propriëtaire software. Elke afwijking van de out-of-the-box-opstelling (bijv. van de ene soort naar de andere gaan) vereist een vooruitziende blik en het werken rond de meegeleverde opstelling, wat moeilijk of onmogelijk kan blijken te zijn. Hieronder wordt een doe-het-zelf (doe-het-zelf) opstelling voor door ratten geïsoleerde longen beschreven die zowel modulair als kosteneffectief is, evenals de chirurgische procedure voor het isoleren van de longen.

<table><tbody><tr><td>1,000 mL glazen beker</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,500 mL glazen beker</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air Trap Compliance Chamber</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Bioamplifiers</td><td>CWE Inc</td><td>BPM-832</td><td></td></tr><tr><td>Klemmen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02626</td><td></td></tr><tr><td>DAQ (Data Acquisition)</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>NI USB-6343</td><td></td></tr><tr><td>Gas Mixer</td><td>CWE Inc, Ardmore, PA</td><td>GSM-4</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsspiraal</td><td>Radnoti, Covina, CA</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11-100-49SH</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Pfizer</td><td>W63422</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Full Development System 2014</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Diamondback Drugs</td><td>G2270-0235-50</td><td></td></tr><tr><td>pH700 sonde</td><td>OAKTON, Vernon Hills, IL</td><td>EW-35419-10</td><td></td></tr><tr><td>Polystat waterbad</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12121-02</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Model 683</td><td></td></tr><tr><td>Rollerpomp</td><td>Cole-Parmer, Wertheim, Duitsland</td><td>Ismatec REGLO Digital MS 2/8</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River, Wilmington, MA</td><td>Strain code 001</td><td></td></tr><tr><td>VetScan i-STAT</td><td>Abraxis, Chicago, IL</td><td>i-STAT 1</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwerp en implementatie van een ex vivo longperfusiemodel voor ratten

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo longpreparaten zijn een nuttig model dat kan worden vertaald naar veel verschillende onderzoeksgebieden, als aanvulling op overeenkomstige in vivo en in vitro modellen. Laboratoria die geïsoleerde longen willen gebruiken, moeten zich bewust zijn van belangrijke stappen en inherente uitdagingen om een opstelling op te zetten die betaalbaar en betrouwbaar is en die gemakkelijk kan worden aangepast aan het onderwerp van interesse. Dit artikel beschrijft een doe-het-zelf (doe-het-zelf) model voor ex vivo longventilatie en perfusie bij ratten om geneesmiddel- en gaseffecten op de pulmonale vasculaire tonus te bestuderen, onafhankelijk van veranderingen in het hartminuutvolume. Het maken van dit model omvat a) het ontwerp en de constructie van het apparaat, en b) de longisolatieprocedure. Dit model resulteert in een opzet die kosteneffectiever is dan commerciële alternatieven en toch modulair genoeg om aan te passen aan veranderingen in specifieke onderzoeksvragen. Verschillende obstakels moesten worden opgelost om te zorgen voor een consistent model dat kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan verschillende onderzoeksonderwerpen. Eenmaal vastgesteld, heeft dit model bewezen zeer aanpasbaar te zijn aan verschillende vragen en kan het gemakkelijk worden aangepast voor verschillende vakgebieden.

Na 10 minuten stabilisatie en baselinemetingen, randomiseerden we een eerste set van 10 mannelijke Sprague Dawley-ratten in vijf kleine groepen: globale no-flow ischemie gedurende 5, 7,5, 8, 9 of 10 minuten (n = 2 per groep) gevolgd door reperfusie; Deze beperkte voorbereidende dosisbepalingsexperimenten werden uitgevoerd om de langst mogelijke ischemietijd te identificeren om nog voldoende ventilatie en reperfusie mogelijk te maken voordat er uiteindelijk een steile en onomkeerbare toename van de luchtwegdruk en oedeemv...

Ex vivo longen zijn nuttig voor een verscheidenheid aan experimenten om fysiologische gegevens te verzamelen, terwijl de verstorende variabelen van in vivo experimenten worden uitgesloten. Commerciële opstellingen zijn vaak duur en beperkt in de soorten gegevens die ze kunnen verzamelen. We beschrijven een methode voor het bouwen van een volledig modulaire opstelling, aanpasbaar voor verschillende onderzoeksontwerpen.

Ontwerp en implementatie van een ex vivo longperfusiemodel voor ratten

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro ...

We demonstreren een eenvoudige methode voor het maken en implementeren van een ex vivo longopstelling vanaf nul. Dit zorgt voor een betaalbare en modulaire opstelling die voor verschillende opstellingen kan worden geïmplementeerd. De hier gepresenteerde techniek is betaalbaar, modulair en aanpasbaar aan de laboratoria die het protocol opzetten.De ex vivo-operatie kan worden gebruikt als aanvulling op in-vivomodellen om nieuwe mechanismen op te helderen. Deze doe-het-zelf-opstelling is ontworpen om de longen in een gecontroleerde omgeving te bestuderen. Het sluit aan bij de belangrijkste onderzoeksfocus van ons laboratorium, namelijk het onderzoeken van verschillende benaderingen om de uitkomst na reanimatie te verbeteren.De opstelling kan echter worden aangepast aan verschillende onderzoeksdoelen, waardoor deze zeer veelzijdig is, De chirurgie vereist een basiskennis van de respiratoire anatomie en fysiologie en kan snel worden beheerst door het protocol te volgen. Desalniettemin is het van vitaal belang om de stappen die in ons protocol worden beschreven ijverig te volgen en vooral de longen te beschermen, vooral bij het verwijderen van de ribben. Om een tracheostomie uit te voeren, knijpt u met een tang in de huid van een verdoofde rat boven de luchtpijp en snijdt u in de huid.Ontleed botweg de spier en het weefsel om de luchtpijp te bereiken, zodat er geen bloedingen optreden. Steek vervolgens een gebogen tang onder de luchtpijp door en open ze zodat er ruimte is om 3-0 hechtingen eronder door te voeren. Bind vervolgens de hechtingen voor in een doosknoop.Maak een kleine incisie tussen de kraakbeenringen van de luchtpijp en breng de tracheale canule in. Bind de hechting af om te voorkomen dat er lucht uit de tracheale incisie ontsnapt en om ervoor te zorgen dat de canule de luchtpijp niet belast. Zodra de tracheale canule is vastgezet, begint u met het ventileren van de rat.Verwijder met een grote chirurgische schaar en tang de vacht van de buik van de rat. Pak het xiphoid-proces vast met de pincet en maak een kleine horizontale incisie onder de ribben, zorg ervoor dat het middenrif intact blijft. Verbreed de horizontale snede om het hele diafragma bloot te leggen.Injecteer met een spuit van 22 gauge heparine in de inferieure vena cava en zorg ervoor dat u de longen niet doorboort. Pak het xiphoid-proces vast met een tang en snijd craniaal langs het borstbeen, waarbij u constant de longen visualiseert om te voorkomen dat ze worden gesneden. Spreid de ribbenkast uit elkaar met twee grote tangen en snijd de inferieure vena cava door om de rat te euthanaseren door verbloeding.Snijd overtollige thymus bij om een gemakkelijkere visualisatie van het pulmonale vaatstelsel mogelijk te maken. Lokaliseer de longslagader en passeer er een kleine gebogen pincet onderdoor. Nogmaals, haal er een 3-0 hechting onder en knoop deze vooraf in een doosknoop.Maak vervolgens een kleine incisie in de rechterventrikel van het hart en breng de PA-canule in. Zet de canule vast met de hechtdraad en begin met perfuseren met 1.5 milliliter per minuut. Snijd onmiddellijk de top van het hart weg om drukopbouw in de longen te voorkomen.Scheur met een kleine gebogen tang de mitralisklep en bevestig visueel dat de tang zonder belemmering het linker atrium kan binnendringen. Wikkel een 3-0 hechting strak om het hart onder het atrium en plaats de PV-canule in het linker atrium, zorg ervoor dat de buffer eruit kan stromen voordat u de hechting afbindt. Knip vervolgens met een schaar met stompe punt overtollig weefsel tussen de borstholte en de incisie in de tracheostomie af om beschadiging van de luchtpijp te voorkomen.Zorg ervoor dat de luchtpijp onder de tracheale canule en het hele hart-longblok zichtbaar zijn. Om het hart-longblok en de luchtpijp te verwijderen, houdt u de tracheale canule vast en gebruikt u een gebogen schaar met stompe punt om het bindweefsel achter de luchtpijp weg te snijden. De levensvatbaarheid van de longen na ischemie en reperfusie wordt gepresenteerd.De langste ischemietijd om 150 minuten reperfusie mogelijk te maken was acht minuten. Het is van cruciaal belang om het vaatstelsel goed te kannuleren zodat de geïsoleerde longen tijdens het experiment levensvatbaar blijven. De longen blijven intact na de procedure, waardoor basismetingen zoals nat of droog gewicht of histologie na het experiment kunnen worden uitgevoerd.

design-and-implementation-of-a-rat-ex-vivo-lung-perfusion-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video shows an ex vivo technique for isolated lung perfusion. It is a tool for pulmonary research that will aid studies of various physiological and pathological mechanisms involved in lung transplantation procedures.

Ex vivo Lung Perfusion: A Technique for Pulmonary Research in a Rabbit Model

Ex-Vivo longperfusie (EVLP) heeft toegestaan ​​longtransplantatie bij de mens om meer direct beschikbaar doordat de mogelijkheid om organen te beoordelen en uit te breiden het donorpool geworden. We beschrijven hier de ontwikkeling van een rat EVLP programma en verfijningen die zorgen voor een reproduceerbaar model voor toekomstige uitbreiding.

WERKWIJZE Geïsoleerde<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Longperfusie in een Rat Model: Lessen uit het ontwikkelen van een Rat EVLP Program

Hier presenteren we optimalisaties voor een longtransplantatiemodel bij ratten die dienen om de resultaten te verbeteren. We bieden een maattabel voor manchetten op basis van lichaamsgewicht, een meetstrategie om de 4eintercostale ruimte te bepalen en methoden voor wondsluiting en BAL (bronchoalveolaire lavage) vloeistof- en weefselverzameling.

Een rattenlongtransplantatiemodel van warme ischemie / reperfusieletsel: optimalisaties om de resultaten te verbeteren

Het geïsoleerde konijnenlongpreparaat is een gouden standaardinstrument in longonderzoek. Deze publicatie heeft tot doel de techniek te beschrijven zoals ontwikkeld voor de studie van fysiologische en pathologische mechanismen die betrokken zijn bij luchtwegreactiviteit, longbehoud en preklinisch onderzoek bij longtransplantatie en longoedeem.

Geïsoleerd longperfusiesysteem in het konijnenmodel

Hier presenteren we een beoordelingsprotocol van een heterotopisch geïmplanteerd hart na normotherm ex situ behoud in het rattenmodel.

Rattenmodel van Normothermische ex-situ perfuseerde heterotope harttransplantatie

Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het opstellen van een EVLP-model bij ratten en tonen we het ontstekingsprofiel dat verband houdt met de geperfuseerde longen. Het doel is om kennis en ervaringen over het EVLP-model van ratten te verspreiden, waardoor een integraal begrip mogelijk wordt van de biologische reacties die met die revolutionaire techniek gepaard gaan.

Opstelling van een ex vivo longperfusiemodel bij ratten voor translationele inzichten in longtransplantatie

Hier beschrijven we de toepassing van een op gepolymeriseerde humane hemoglobine (PolyhHb) gebaseerde zuurstofdrager als perfusaat en het protocol waarin deze perfusieoplossing kan worden getest in een model van ex vivo longperfusie bij ratten.

Onderzoek naar alternatieve perfusieoplossingen met behulp van gepolymeriseerde zuurstofdragers op basis van hemoglobine van de volgende generatie in een model van ex vivo longperfusie bij ratten

Het doel is om een nieuw ex vivo longperfusie (EVLP) model bij ratten te ontwikkelen dat 4 uur lang een consistente longfunctie kan handhaven gedurende EVLP en de industrie te voorzien van implementatiedetails die een stevige methode bieden voor het toepassen van EVLP op knaagdiermodellen.

Oprichting van een nieuw Ex Vivo longperfusiesysteem voor rattenlongen na circulatoire dood

Dit protocol presenteert een ex-vivo longperfusiemodel bij ratten met een voorbijgaande blootstelling aan een gekalibreerde thermische stress, waarbij endogene beschermingsmechanismen worden bevorderd voor de therapeutische reconditionering van beschadigde longtransplantaten. De aanpak is schaalbaar en reproduceerbaar en ondersteunt de ontwikkeling van niet-medicamenteuze therapieën om het succes van longtransplantaties te verbeteren.

Thermische preconditionering tijdens ex-vivo longperfusie voor de revalidatie van beschadigde longtransplantaten vóór transplantatie

Een nieuwe in vitro systeem voor het gelijktijdig laden van vier pezen in de cultuur wordt beschreven.

Ex vivo mechanische belasting van Tendon

Leer een kosteneffectief en modulair ex vivo longperfusiemodel voor ratten. Deze methode maakt gecontroleerde longfysiologiestudies mogelijk en vult in vivo onderzoek aan voor nieuwe inzichten in ademhalingsmechanismen.

Ontwerp en implementatie van een ex vivo longperfusiemodel voor ratten

Meer video's verkennen