Name: In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Leer de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden met cytotoxiciteitstests in 2D- en 3D-celculturen. Deze methode ondersteunt vroeg preklinisch onderzoek naar veilige fotofarmacologische geneesmiddelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen EU-financiering door het H2020-MSCA-RISE-programma via PELICO (#690973) en ALISE (#101007256) projecten. Dit werk werd ondersteund door de DFG-GRK 2039 (SA, TS en ASU), het NACIP-programma van de Helmholtz Society (SA en ASU) en de VIP + van de BMBF (OB en ASU). We erkennen Dr. Serhii Koniev, Karlsruhe Institute of Technology, die de verbinding LMB002 heeft gesynthetiseerd, gezuiverd en vriendelijk de verbinding voor de studie heeft verstrekt. De auteurs zijn ook dankbaar voor Chupryna Maksym die de video in Oekraïne heeft gefilmd en samengesteld, en voor alle dappere verdedigers van Oekraïne die het experimentele werk, het schrijven en filmen van deze publicatie mogelijk hebben gemaakt.

<ol><li>Fuchter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+promise+of+photopharmacology+using+photoswitches%3A+a+medicinal+chemist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).</li>
<li>Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+photoswitches+in+aqueous+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular photoswitches in aqueous environments.</a> Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).</li>
<li>Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+neuronal+ion+channels+and+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical control of neuronal ion channels and receptors.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).</li>
<li>Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Photopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">In Vivo Photopharmacology.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photopharmacology+with+a+caged+mu+opioid+receptor+agonist+drives+rapid+changes+in+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior.</a> Nature Methods. 20, 682-685 (2023).</li>
<li>Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomodulation+Approaches+to+Overcome+Antimicrobial+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance.</a> Pharmaceuticals. 16 (5), 682(2023).</li>
<li>Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolarski%2C+D+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+drugs+for+photopharmacology%3A+how+much+of+a+safety+advantage+can+be+gained+by+photocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol.</a> Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28(2020).</li>
<li>Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+of+successful+lead+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Components of successful lead generation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).</li>
<li>Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+of+utilizing+in+vitro+and+in+vivo+adme+tools+for+lead+optimization+and+drug+candidate+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).</li>
<li>Kleijn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+comparison+identifies+an+ATP-based+viability+assay+as+most+suitable+read-out+for+drug+screening+in+glioma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+model+revolution%3A+unveiling+tumor-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions.</a> Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).</li>
<li>Sittinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+autologous+transplant+formation%3A+practical+approaches+with+resorbable+biomaterials+and+new+cell+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques.</a> Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).</li>
<li>Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+3D+bioprinting+technology+for+tissue%2Forgan+regenerative+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering.</a> Biomaterials. 226, 119536(2020).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photocontrol+of+peptidomimetics%3A+an+alternative+to+oxygen-dependent+photodynamic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).</li>
<li>De Ridder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+lung+tumor+spheroids+for+oncoimmunological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+NanoBiomed+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays.</a> Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124(2022).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+basic+principles%2C+current+clinical+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions.</a> Cancers. 9 (2), 19(2017).</li>
<li>Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+strategies+for+hypoxic-tumor+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).</li>
<li>Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo photopharmacology.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+of+photoswitchable+diarylethene-based+%CE%B2-hairpin+peptides+as+membranolytic+antimicrobial+and+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).</li>
<li>Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+treatment+light+monitoring+for+interstitial+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).</li>
</ol>

IVK, OB, SA en ASU zijn uitvinders van de uitgegeven octrooifamilie: "Peptidomimetics bezitten fotogecontroleerde biologische activiteit" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) in licentie gegeven aan Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS en SA zijn oprichters en aandeelhouders van Lumobiotics GmbH. IVK is een wetenschappelijk adviseur, HK, TM, IP en PB zijn werknemers van Enamine LLC. De auteurs hebben geen andere relevante banden of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financieel conflict met het onderwerp of de materialen die in de publicatie worden besproken, afgezien van de openbaar gemaakte onderwerpen.

Fotogecontroleerde verbindingen zijn ongekend in de ontwikkeling van geneesmiddelen; Er zijn echter geen methoden vastgesteld voor hun preklinische en klinische evaluatie. De dichtstbijzijnde monotherapie-analoog, fotodynamische therapie (PDT), is de behandelingsmodaliteit voor klinisch gebruik die door veel landen tegen kanker wordt gebruikt en is in ontwikkeling voor andere indicaties19,20. Net als fotofarmacologie is PDT ook gebaseerd op het gebruik van licht om de bioactieve stof (singlet zuurstof) te activeren. Daarom kunnen sommige experimentele methoden die worden gebruikt voor preklinische en klinische studies in PDT worden gebruikt voor fotofarmacologie. Lichtbronnen, lichtafgiftebenaderingen en medische hulpmiddelen zijn bijvoorbeeld goed ontwikkeld en goedgekeurd voor PDT; Ze kunnen direct worden gebruikt voor de evaluatie van fotogecontroleerde geneesmiddelen. PDT en fotofarmacologie hebben echter veel verschillen van elkaar4, wat de noodzaak rechtvaardigt om specifieke methoden voor de laatste vast te stellen.
Ten eerste is de niet-geactiveerde stof in PDT (zuurstof) altijd aanwezig in levende weefsels in niet-toxische concentraties. Daarentegen kunnen niet-geactiveerde fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen restactiviteit en ongewenste toxiciteit hebben. Daarom moeten ideale fotofarmacologische geneesmiddelen de biologische activiteit in hun toegediende vorm hebben geminimaliseerd en zeer actief zijn in hun door licht gegenereerde vorm, het "fototherapeutische venster"21 moet zo groot mogelijk zijn. Het vinden van de hit en het uitvoeren van hit-to-lead optimalisatie vereist de identificatie van geschikte verbindingen en de screening van relatief grote bibliotheken, al in een vroeg stadium van de ontwikkeling van geneesmiddelen. Hier stelden we een geautomatiseerde confocale fluorescerende microscopie met hoge doorvoer voor om efficiënte fotoschakelverbindingen te identificeren.
De gekozen methode voor cytotoxiciteitsevaluatie maakt een eenvoudige implementatie van de meest kritische vereiste mogelijk - behoud van de PSS of stabiliteit van het zichtbaar-lichtgevoelige foto-isomeer. Dit komt omdat, bij de implementatie, de blootstelling aan licht wordt geminimaliseerd. Daarom moet bij het selecteren van alternatieve methoden de voorkeur worden gegeven aan geautomatiseerde methoden. Deze aanpak is betrouwbaar en informatief. Het gebruik van 3D-celculturen (sferoïden) in dit stadium biedt een holistisch begrip van de reactie van de cel op de behandeling in een meer realistische weefselachtige micro-omgeving. Bovendien kunnen waardevolle inzichten in het werkingsmechanisme van de verbindingen worden verkregen met behulp van microscopie als directe methode. De confocale fluorescerende microscopie met het juiste kleuringsprotocol maakt de visuele beoordeling van de morfologie van de cellen en sferoïden mogelijk; Belangrijke details over de celdood en veranderingen in de cellen kunnen ook worden gedetecteerd.
Ten tweede vereist lichte toepassing een zorgvuldige keuze van de lichtdosering. Bij PDT is een lichte overdosis uiterst schadelijk voor weefsels22. Fotofarmacologische therapie kan voordelig zijn bij overmatige lichtbestraling. De bovengrens van de geactiveerde stof wordt bepaald door de toegediende dosis van de niet-geactiveerde stof en de farmacokinetiek ervan. Lichtdosering is echter nog steeds een probleem in de fotofarmacologie. Er moet voor worden gezorgd dat het bestralingsvermogen en de blootstellingstijd niet minder zijn dan de vereiste voor de therapie. In principe kan de aanmaak van de geactiveerde stof in vivo worden gemonitord. Om bio-ethische redenen stelden we echter een experiment voor met een modelweefsel (vers gehakt) gemengd met de niet-geactiveerde verbinding15. Dit experiment is eenvoudig en kan worden aangepast om verschillende lichtbronnen te gebruiken. Het kan ook worden aangepast voor de fotofysische schatting van de lichtdosering en de meting van thermische invloeden. Ook hier is het mogelijk om door gebruik te maken van modelweefsels de lichtbelichting te minimaliseren, bijvoorbeeld vergeleken met de nauwkeurigere bepaling van de fotoschakelefficiëntie in de in vivo omstandigheden, een alternatief dat altijd interessant kan zijn om te overwegen.
Ten slotte kunnen de verbindingen die superieure eigenschappen vertonen in de in vitro toxiciteitsschermen en efficiënt fotoswitching van ten minste 1-1,5 cm diep in het modelweefsel worden geselecteerd voor kostbare, bewerkelijke en langdurige in vivo studies. In dit protocol gebruikten we dezelfde cellijn (LLC) als in de in vitro beoordeling om het allograft kankermodel te genereren. De tumorgroeidynamiek, mortaliteit en metastasetelling zijn de parameters die het meest geschikt zijn voor het beoordelen van de werkzaamheid tegen kanker. In vergelijking met conventionele chemotherapie wordt een extra factor toegepast in de fotofarmacologische behandeling - het licht. Daarom zijn twee groepen bestrijdingsdieren nodig: een die alleen het voertuig ontvangt en de andere die het voertuig en de bestraling ontvangt. Deze opstelling maakt de evaluatie van de impact van licht op de gemeten parameters mogelijk. In ons experiment ontvingen de dieren van de twee experimentele groepen de niet-geactiveerde verbinding en werden de tumoren van de muizen in één groep bestraald. Het bestralingsregime was identiek voor de controle- en behandelingsgroepen. Vergelijking met benchmarkchemotherapie is in dit stadium niet nodig omdat het belangrijkste doel van het experiment is om het gecombineerde effect van lichte en samengestelde toepassing aan te tonen. De best presterende verbindingen die dit effect vertonen, kunnen vervolgens worden geselecteerd voor verder onderzoek naar hun in vivo toxiciteit en vergelijking met benchmarks voor het nemen van belangrijke go-no-go-beslissingen over hun ontwikkeling. Technisch gezien kan het in vivo experiment dat we beschrijven gemakkelijk worden aangepast aan farmacokinetische of farmacodynamische studies, bijvoorbeeld van een verbinding die al is geselecteerd als het geneesmiddellood.

Fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen zijn de afgelopen decennia naar voren gekomen als een veelbelovend onderdeel van veilige chemotherapieën voor menselijke ziekten en om specifiek kwaadaardige vaste tumoren uit te roeien1. Deze verbindingen bevatten reversibele foto-isomiseerbare fragmenten (moleculaire fotoschakelaars) en kunnen schakelen tussen inactieve en actieve foto-isomeren bij bestraling met licht van verschillende golflengten.
In vergelijking met hun niet-fotocontroleerbare analogen kunnen fotogecontroleerde geneesmiddelen veiliger zijn omdat ze systemisch in het lichaam van de patiënt kunnen worden ingebracht in minder actieve en in wezen niet-toxische vormen, en vervolgens alleen door licht worden geactiveerd waar nodig, zoals in tumoren, zweren en wonden. Hoewel meerdere opwindende demonstraties van dergelijke prototypes van moleculaire geneesmiddelen te vinden zijn in recente academische artikelen 2,3,4,5,6,7, bestaat het gebied van klinische fotofarmacologie - een toepassing van goedgekeurde combinaties van geneesmiddelen / medische hulpmiddelen / ziekten - niet. Fotofarmacologie bevindt zich nog in de fase van geneesmiddelenontdekking en systematische preklinische studies zijn onbekend.
We hebben pas zeer recent het in vivo veiligheidsvoordeel aangetoond voor sommige fotogecontroleerde antikankerpeptiden, namelijk de analogen van het peptide-antibioticum gramicidin S8. Deze fotogecontroleerde derivaten bevatten een diaryledatheen (DAE) fotoschakelaar, die omkeerbare foto-geïnduceerde transformaties ondergaat tussen de zogenaamde roodlicht-gegenereerde "ring-open" en UV-gegenereerde "ring-gesloten" fotovormen (geïllustreerd in figuur 1 voor een van de derivaten, verbinding LMB002).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg"> Figuur 1: Fotogecontroleerd cytotoxisch peptide LMB002 en zijn foto-isomerisatie. Het dagboekledheenfragment is in rood weergegeven. Afkorting: DAE = diarylethene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het vinden van hits en het uitvoeren van hit-to-lead optimalisatie vereisen vaak in vitro en in vivo screening van geschikte samengestelde bibliotheken 9,10. Hier demonstreren we een methodologie die geschikt is voor de systematische high-throughput screening van cytotoxiciteit van fotogecontroleerde verbindingen. We bepalen ook de foto-isomerisatie-efficiëntie, schatten de lichtdosis in modelweefsels en evalueren de in vivo werkzaamheid van de best presterende kandidaten. De aanpak is in overeenstemming met bio-ethiek en dierverzorgingsoverwegingen.
In dit werk worden traditionele preklinische methoden aangepast om de niet-gecontroleerde foto-isomerisatie van geteste verbindingen te voorkomen. Het algemene doel van het toepassen van deze gemodificeerde methoden hierin is het ontwikkelen van een algemene strategie die eenvoudig en snel is en statistisch significante gegevens oplevert om in vitro activiteiten betrouwbaar te vergelijken en de in vivo werkzaamheidstests van fotoschakelbare verbindingen voor loodidentificatie en verdere ontwikkeling te rationaliseren.
De strategie bestaat uit drie opeenvolgende stappen. De eerste stap omvat de bepaling van IC50 (schijnbare 50 % cel levensvatbaarheid) in seriële verdunningen voor de actieve en inactieve fotovormen van geselecteerde fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen met behulp van tweedimensionale (2D, monolayer) en driedimensionale (3D, sferoïde) celculturen en confocale high-throughput geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie. Fototherapeutische vensters worden vergeleken met betrekking tot het IC50-verschil tussen de twee fotovormen en de best presterende kandidaten worden geselecteerd. Er is geen specifiek voordeel bij toxiciteitsbeoordeling door geautomatiseerde microscopie en andere cytotoxiciteitsscreeningplatforms (assays)11; Complexere celgebaseerde tumormodellen12 kunnen in dit stadium eenvoudig worden geïmplementeerd.
Voor de verbindingen die in stap 1 zijn geselecteerd, is de tweede stap het realistisch schatten van hun fotoschakelingsefficiëntie in de weefsels als functie van de diepte van het bestraalde weefseloppervlak door de fotoschakelingsefficiëntie van de minder actieve fotovormen in een weefselsurrogaat te kwantificeren met behulp van UV-gedetecteerde high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) van bestraalde monsterextracten. In vivo kan de efficiëntie van fotoswitching worden bestudeerd, maar we stellen voor om een eenvoudig weefselsurrogaat te gebruiken - gehakt varkensvlees. We hebben de validiteit van deze aanpak getest. We maten de conversie van onze fotoschakelbare verbindingen in vivo op een muizenkankermodel en observeerden ongeveer dezelfde fotoconversie op een diepte gemeten in eerdere experimenten met muizen8. Elk geschikt alternatief kunstmatig weefsel13, 3D-biogeprint weefsel/ orgaan 14, biopsiemateriaal of ander vrijgesteld dierlijk materiaal kan worden gebruikt. Deze opstelling is echter een goed compromis omdat het economisch, snel en ethisch is.
De derde stap is de bepaling van in vivo antikanker werkzaamheid in een muizenkankermodel. De verbindingen die superieure eigenschappen vertonen in de in vitro experimenten en efficiënt fotoswitchen op een diepte van ten minste 1-1,5 cm in de modelweefsels worden geselecteerd voor dit experiment.
Dit protocol kan worden toegepast op verbindingen met verschillende soorten fotoschakelaars, op voorwaarde dat hun fotovormen (of hun fotostationaire toestanden, PSS) stabiel zijn gedurende een redelijke tijd (een paar dagen of langer). Ter illustratie wordt een eerder beschreven DAE-afgeleide LMB002 gebruikt15. De LMB002 fotovormen zijn thermisch stabiel en kunnen minstens een jaar bij −20 °C bewaard worden zonder noemenswaardige degradatie. Lewis longcarcinoom (LLC) cellen worden gekozen voor deze in vitro en in vivo demonstratie, maar er worden geen beperkingen opgelegd aan het celtype. LLC-cellen zijn aanhangend, gemakkelijk te kweken in 3D en worden gebruikt om tumoroïden te genereren (zoals beschreven in de referentie16). In vivo LLC-cellen worden gebruikt om metastatische processen te modelleren en kunnen gemakkelijk solide tumoren genereren bij immunocompetente muizen na subcutane injectie. Deze in vivo methodologie kan universeel worden toegepast op andere kankermodellen17,18. De gedetailleerde implementatie van deze strategie wordt hieronder beschreven.

<table><tbody><tr><td>Agilent 1100 Series capillary LC system</td><td>ALSI-Chrom (Agilent distributor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line</td><td>ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NCrl muizen, vrouwelijk, ingefokt</td><td>Charles River</td><td>Stamcode: 027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture, CO2 incubator</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement membrane matrix</td><td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning, 384- well spheroid microplates</td><td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidin S</td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>Aangepaste synthese</td></tr><tr><td>HyClone, DMEM/hoge glucose</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS, beeldvormingssysteem</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraannarkose-apparaat</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM oplossing</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA-chirurg, diode-chirurgielaser</td><td>Fotonika plus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>LMB002</td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>Aangepaste synthese</td></tr><tr><td>Penicilline&ndash;Streptomycine, oplossing gestabiliseerd</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate, 96-well platen</td><td>PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>Fotometer PCE-LED 20</td><td>PCE Instruments</td><td>PCE-LED 20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Propidium jodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw, 0,4% oplossing</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine&ndash;EDTA, 10 x oplossing</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz Celcultuurkolven met ontluchte doppen, 75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz, flesdoppenfilters, PES, 0,22 &mu;m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP, C18 HPLC-kolom (4,6 mm &times; 250 mm, 5 &micro;m)</td><td>Altmann Analytik (Avantor distributeur)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Fotogecontroleerde, biologisch actieve verbindingen zijn een opkomende klasse van "slimme" kandidaat-geneesmiddelen. Ze bieden extra veiligheid bij systemische chemotherapie vanwege hun nauwkeurige spatiotemporale activering door een goedaardig, niet-ioniseerbaar licht naar een specifieke locatie in het lichaam van de patiënt te leiden. Dit artikel presenteert een reeks methoden om de in vitro potentie en ex vivo efficiëntie van de fotoactivatie van fotogecontroleerde, biologisch actieve verbindingen te evalueren, evenals de in vivo werkzaamheid in vroege stadia van de ontwikkeling van geneesmiddelen. De methodologie wordt toegepast op cytotoxische peptiden tegen kanker, namelijk de diaryletheen-bevattende analogen van een bekend antibioticum, gramicidin S. De experimenten worden uitgevoerd met behulp van 2D (adherente cellen) en 3D (sferoïden) celculturen van een kankercellijn (Lewis longcarcinoom, LLC), levend weefsel surrogaten (varkensvleesgehakt) en een allograft kankermodel (subcutane LLC) in immunocompetente muizen. De selectie van de meest effectieve verbindingen en schatting van realistische fototherapeutische vensters worden uitgevoerd via geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie. De fotoactiveringsefficiëntie bij verschillende verlichtingsregimes wordt bepaald op verschillende diepten in een modelweefsel en de optimale lichtdosering wordt toegepast in het uiteindelijke therapeutische in vivo experiment.

In dit werk werden 2D- en 3D-celexperimenten uitgevoerd om de IC50 te bepalen voor "ring-gesloten" en "ring-open" vormen van LMB002 (zie figuur 1) op verschillende incubatietijden. Deze waarden werden vergeleken met die verkregen voor het prototype peptide, gramicidin S (gebruikt als positieve controle). Een typische reeks afbeeldingen van de incubatie in 2D-gekweekte LLC-cultuur na kleuring wordt weergegeven in figuur 5. Co-kleuring met Hoechst 33342 (blauw) en propidiumjodide (rood) resulterend in verschillende tinten paars in een groter deel van de cellen in het geval van behandeling met "ring-open" vorm in vergelijking met "ring-gesloten" duidt op een merkbaar verschil in cytotoxiciteit tussen twee vormen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd. Het gedemonstreerde voorbeeld van een succesvol experiment is gebaseerd op de gegevens die zijn verzameld met behulp van het 96-well plaatformaat, waarbij de peptidevarianten in verschillende concentraties werden toegevoegd, zoals weergegeven in figuur 2. Vergelijkbare gegevens kunnen worden verkregen met platen met 384 putten en hoge dichtheid. Aangezien echter de volumes per put worden verminderd, zullen technische en systematische fouten en als gevolg daarvan de nauwkeurigheid van de IC50-bepaling afnemen met toenemende putdichtheid.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg"> Figuur 5: Representatieve beelden van de cytotoxiciteitstest in de monolayer-grown LLC. Cellen werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) en propidiumjodide (rood). De getoonde tijden: 10 min, 60 min, 24 h en 72 h zijn incubatietijden met verbindingen. Schaalbalken = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De fotoconversie van LMB002 door laserlichtbestraling in een modelweefsel - vers varkensgehakt - werd bepaald met behulp van een monster bestaande uit gehakt gemengd met LMB002 "ringgesloten" (inactieve) vorm opgelost in PBS en het meten van de omzetting van deze inactieve vorm in de LMB002 "ring-open" (geactiveerde) vorm in de richting van stralingsvoortplanting. Het monster werd in een spuit geplaatst en van één kant bestraald met een platte straal laserstraling gedurende de blootstellingstijd van ~ 10 minuten (meestal gebruikt in in vivo experimenten), zoals weergegeven in figuur 3. Na de blootstelling werd de monstercilinder in delen verdeeld door op de zuiger van de spuit te drukken en de plakjes van dezelfde hoogte met een scalpel te snijden. De concentratie LMB002 "ring-open" in de extracten van de plakjes werd bepaald met behulp van RP HPLC.
Figuur 6 illustreert de dosis-effectcurven Figuur 6A-D verkregen uit data-analyse. Om het percentage dode cellen met nucleaire co-kleuring van Hoechst 33342 en PI-kleurstoffen te identificeren, gebruikten we een ingebouwde classificatortool die numerieke drempels instelt op geselecteerde gemeten parameters om alle celtellingen in verschillende categorieën te splitsen. Wanneer bijvoorbeeld het rode kanaal (propidiumjodide) signaal in de controle op de drempel was (ongeveer 110-130 eenheden), konden de cellen worden geclassificeerd als PI-positief, beschouwd als dood, of PI-negatief, beschouwd als niet-beïnvloed door de verbindingen. Voor LMB002 kunnen sigmoïdale afhankelijkheid van het percentage propidiumjodide-positieve cellen op de concentratieverbinding worden gezien. Uit deze gegevens kunnen de IC50-waarden worden bepaald.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg"> Figuur 6: Analyse van cytotoxiciteit in 2D-cultuur. Sigmoïde past zoals verkregen in de LLC-cultuur voor (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h en (D) 72 h-tijdsintervallen genomen voor incubatie met verbindingen. Montage maakt de nauwkeurige bepaling van IC50-waarden mogelijk (niet weergegeven). Foutbalken zijn SEM. Afkortingen: LLC = Lewis longcarcinoom; PI = propidiumjodide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Gezien de verkregen IC50-waarden kunnen we concluderen dat de toxiciteit van alle drie de verbindingen toenam met de incubatietijd. Ons experiment onthulde dat de "ring-open" vorm van LMB002 ongeveer één verdunningsstap minder toxisch is dan het prototype peptide, gramicidin S. Terwijl de "ring-gesloten" vorm drie tot vier verdunningsstappen lagere toxiciteit vertoont, die toeneemt met de incubatietijd. Het verschil tussen de twee verdunningsstappen wordt niet beïnvloed door de toename van de incubatietijd en kan numeriek worden gebruikt als een experimenteel bepaald fototherapeutisch venster6 voor vergelijking met andere verbindingen in een potentiële bibliotheekscreening. De IC50-waarde voor gramicidin S werd ingesteld als referentiepunt om experimentele fouten of differentiële outputs in biologische replicaties te corrigeren.
De 3D-celexperimenten produceerden hetzelfde type onbewerkte gegevens - de single cell-resolved one-per-well sferoïde beelden. De opname van calceïne als derde kleurstof maakt de kwantificering van de fractie metabolisch actieve cellen (waargenomen in het groene kanaal) mogelijk. Door 384-putplaten te gebruiken, het aantal technische replicaties te verhogen, redundante co-incubatietijdpunten uit te sluiten en de verdunningsplooi te veranderen, konden we verschillende verbindingen direct vergelijken in een enkele testrun (met behulp van één plaat) zoals geïllustreerd in de plaatkaart in figuur 7.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg"> Figuur 7: Plaatkaart voor het 3D-cultuurexperiment met twee verbindingen. Kleurcodes voor de verbindingen en controle worden aangegeven. Getallen in putten zijn concentraties in μM. 10 min, 24 h en 72 h zijn incubatietijden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Figuur 8 toont de afbeeldingen van geselecteerde technische replicaties van LLC-sferoïden gekweekt met een dichtheid van 1 sferoïde / put in de aanwezigheid van geteste verbindingen en controlesferoïden die zijn vastgelegd na kleuring.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg"> Figuur 8: Representatieve beelden van 3D-cultuur cytotoxiciteitstest. Afbeeldingen tonen 48-h-oude LLC-sferoïden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw), calceïne AM (groen) en propidiumjodide (rood) na 10 min, 24 uur en 72 uur co-incubatie met zowel LMB002-fotovormen als gramicidin S. Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Met behulp van de instrumentsoftware werden de dosis-effectcurven, zoals die in het 2D-experiment, verkregen uit de z-gestapelde stapels afbeeldingen (figuur 9A). Bovendien kunnen compacte en niet-vervormde sferoïden in de 3D-culturen worden gekenmerkt door de diameter van de hele sferoïde (figuur 9B). Er werd ook opgemerkt dat de totale sferoïde diameter varieert met de concentratie van de verbinding.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg"> Figuur 9: Cytotoxiciteitsevaluatie met 3D-culturen. (A) Concentratieafhankelijke cytotoxiciteitsaanpassingscurven en (B) concentratieafhankelijke sferoïdediameterplots verkregen in de 3D-culturen van LLC co-geïncubeerd met gramicidin S gedurende 10 minuten, 24 uur en 72 uur en vastgelegd vóór kleuring. Foutbalken zijn SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Het experiment voor stap 2 maakt het mogelijk om LMB002-concentraties in beide fotovormen te bepalen met behulp van UV-gedetecteerde high-performance vloeistofchromatografie. De efficiëntie van fotoconversie in modelweefsels kon eenvoudig worden beoordeeld en gekwantificeerd met behulp van deze opstelling (figuur 3). De gegevens werden verkregen uit de kwantitatieve analyse van de chromatogrammen van de monsterextracten. In deze testexperimenten werden LMB002-chromatogrammen spectroscopisch gedetecteerd bij 270 nm en 570 nm. Bij 270 nm werden veel extra signalen waargenomen en toegeschreven aan de verbindingen die samen uit het modelweefsel werden geëxtraheerd (geverifieerd uit het controle-extract zonder de verbinding). Beide fotovormen waren voldoende verschillend in retentietijden en absorptie. Het LMB002 "ring-open"-signaal was echter baseline-gescheiden van deze achtergrondsignalen (zie een representatief chromatogram in figuur 10A). Daarom kan dit signaal zonder problemen worden geïntegreerd. Bij 570 nm bevatten de chromatogrammen alleen LMB002 "ring-gesloten" vormsignaal (figuur 10B). Hier hebben we concentratiebepaling uitgevoerd met behulp van RP HPLC. Niettemin kunnen nog hogere nauwkeurigheid en lagere detectiegrenzen worden bereikt met LC/MS als analysemethode.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg"> Figuur 10: Representatieve chromatogrammen van LMB002 geëxtraheerd uit modelweefsels. (A) Monster op 2 mm van het bestraalde oppervlak, geregistreerd bij 270 nm (LMB002 "ring-open"-vorm is geïntegreerd); B) monster op 38 mm van het bestraalde oppervlak, geregistreerd bij 570 nm (de piek van LMB002 "ringgesloten" is geïntegreerd). Retentietijdwaarden (aangegeven) bevestigden bovendien de identiteit van de verbinding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De gegevens die werden verkregen na integratie van de overeenkomstige signalen van alle verzamelde monsters werden gebruikt om de concentratiedieptegrafieken te maken, zoals weergegeven in figuur 11. Op basis van deze grafieken kon de efficiëntie van fotoconversie op verschillende diepten van het modelweefsel eenvoudig worden beoordeeld. Het bevestigt dat onze rode lichtbron de "ring-gesloten" LMB002-fotoconversie induceert op een diepte van maximaal 1 c, in het weefsel surrogaat, gehakt (bij ongeveer 103 mW / cm2).
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg"> Figuur 11: Evaluatie van de efficiëntie van de fotoconversie. Concentratie (A, mg/kg) van LMB002 "ring-gesloten" (niet-geactiveerde, blauwe stippen) en "ring-open" vormen (geactiveerde, oranje stippen) op verschillende afstanden van het bestraalde oppervlak van het modelweefsel (L, mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De resultaten van het in vivo experiment - stap 3 van onze methodologie uitgevoerd volgens het schema in figuur 4 - werden weergegeven door grafieken met tumorgroei als functie van de tijd (figuur 12) en Kaplan-Meier-overlevingscurven (figuur 13).
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg"> Figuur 12: Tumorgroeidynamiek bij dieren. Dieren behandeld met LMB002 in vergelijking met de met het medium behandelde dieren (subcutaan LLC allograftmodel in C57BL/6NCrl muizen, samengestelde dosis 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min incubatie, vervolgens bestraling bij 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg"> Figuur 13: Sterftecurven voor dieren. Dieren behandeld met LMB002 in vergelijking met de met het medium behandelde dieren (subcutaan LLC allograftmodel in C57BL/6NCrl muizen, samengestelde dosis 7 mg/kg, IV, 2 h 40 min incubatie, vervolgens bestraling bij 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

Fotogecontroleerde, biologisch actieve verbindingen bevatten reversibel foto-isomiseerbare fragmenten, fotoschakelaars in hun moleculen. Verbindingen zijn cyclische peptiden gemodificeerd door een diaryletheenfragment dat omkeerbare lichtgeïnduceerde elektrocyclische transformaties ondergaat. Ze kunnen fotoschakelen, dat wil zeggen, schakelen tussen een UV-gegenereerde, biologisch inactieve vorm en een door rood licht gegenereerde, biologisch actieve vorm.Er wordt aangenomen dat fotoschakelbare geneesmiddelen veiliger zijn dan niet-fotoschakelbare geneesmiddelen. Dit komt omdat je een niet-toxische, gedeactiveerde vorm aan het menselijk lichaam kunt toedienen en het lokaal alleen met licht kunt activeren waar je het nodig hebt, bijvoorbeeld tumoren, vijzels of wonden. Er zijn geen standaardmethoden of protocollen voor de preklinische of klinische ontwikkeling van dergelijke fotofarmacologische geneesmiddelen, dus hier willen we u experimenten laten zien die kunnen worden gebruikt voor dit vroege preklinische onderzoek.Kateryna Horbatok en Tetiana Makhnii zullen de procedures demonstreren. De dierverzorgings- en experimentele procedures werden goedgekeurd door de Bioethics Commission van de Bienta Company. Begin met het voorbereiden van de buffers met behulp van standaardprocedures.U kunt ook commercieel beschikbare oplossingen gebruiken. Bereid stamoplossingen van verbindingen voor. Weeg voor elke verbinding twee batches van 5,12 milligram van de verbinding in de ringgesloten fotovorm in twee Eppendorf-buizen van 1,5 milliliter, één met heldere en één met zwarte, niet-transparante wanden.Weeg als positieve controle 2,28 milligram van de ouder, niet fotogecontroleerd, peptide in een extra buis. Voeg 100 microliter pure DMSO toe aan elk monster en vortex gedurende 30 seconden. Foto-isomeriseer de stamoplossing in de helderwandige buis door de oplossing te bestralen met een laser van 650 nanometer, lichtvermogensdichtheid 6 watt per vierkante centimeter, met vortexing om menging te garanderen.Ga door totdat de kleur verandert van donkerpaars naar lichtbruin. Bescherm tegen licht met aluminiumfolie. Zaai 5.000 tot 10.000 cellen per put.We gebruikten circa 8.000 Lewis-longcarcinoomcellen in 200 microliter DMEM in de centrale 60 putten van een 96-well steriele plaat met een heldere bodem en zwarte, niet-transparante wanden. Vul de overige 36 putten met pure DMEM. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius in een 5% CO2-atmosfeer gedurende een nacht.Bereid de volgende dag seriële verdunningen van verbindingen en de positieve controle in polypropyleen geautoclaveerde heldere platen. Begin met de voorraden in DMSO en verdun met DMEM, maar niet meer dan 1% volume DMSO in de uiteindelijk hoogste concentratie. Om ongecontroleerde foto-isomerisatie van de bestudeerde verbindingen te voorkomen, schakelt u de lichten in de steriele kast uit.Breng 100 microliter van de verdunningen over in 56 putten met 100 microliter eerder toegevoegde DMEM om de vereiste eindconcentratie van de verbindingen in de putten te bereiken, meestal binnen het bereik van vijf tot 150 micromol. Voeg vervolgens 100 microliter DMEM toe aan vier putten, die dienen als een negatieve controle. Bedek de platen met aluminiumfolie of een plastic, niet-transparante afdekking om ongecontroleerde fotoschakeling te voorkomen.Plaats de platen in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius voor de gekozen incubatietijd. Voeg na de incubaties 50 microliter kleuringsoplossing per put toe aan de platen. Gebruik vijf-micromolair Hoechst 33342 en één-micromolair propidiumjodide als de uiteindelijke kleuringsoplossingen voor dit experiment.Incubeer opnieuw bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voer geautomatiseerde fluorescentiebeeldvorming uit met behulp van een 20x vergrotingsobjectieflens. De laboratoriumwerkzaamheden voor dit deel van de methode zijn identiek aan die beschreven voor het 2D-experiment: voorbereiding van de celcultuur, incubatie met de geteste verbindingen en beeldvorming.In dit geval worden de cellen echter bereid als compacte, volwassen sferoïden in een 384-well, ultra-low-adhesion, U-bodemplaat met zwarte, niet-transparante wanden. Met behulp van een plaat van deze grootte kunnen twee verbindingen in één experiment worden vergeleken. In dit experiment gebruikten we bovendien calceïne AM als derde component van de meerkleurige kleuringsoplossing.Beelden verkregen uit zowel de 2D- als 3D-experimenten worden geanalyseerd met behulp van de geautomatiseerde beeldanalysesoftware van de instrumenten. Cellen bedekt met Hoechst en propidiumjodidekleurstoffen worden als necrotisch dood beschouwd en hun fractie als functie van de concentratie wordt gebruikt om de IC50-waarde te berekenen. Monteer de optische trein voor de bestraling van het monster.Het bestaat uit een optische kabel van de laserlichtbron, een lens met een variabele brandpuntsafstand, een spuit met een niet-transparante afdekking en een plat gesneden uiteinde. Alle volgende handelingen moeten worden uitgevoerd in een verduisterde ruimte met minimale verlichting op de werkplek. Bereid een modelweefselmonster voor dat is geladen met de inactieve fotoformele verbindingen.In een typische run wordt vijf gram vers gehakt varkensvlees mechanisch gemengd met de PBS-oplossing van de verbinding om de uiteindelijke concentratie van 50 milligram per kilogram te bereiken. Vul de spuit met het geladen monster. Bestraal het monster in de optische trein voor de vereiste blootstelling en lichtdoseringstijd.Maak na de blootstelling vier millimeter dikke plakken van het monster door de massa met de zuiger van de spuit te duwen en deze met een scalpel te snijden. Weeg en extraheer de verbinding met een acetonitril, water, TFA-mengsel, 70% acetonitril en 01% trifluorazijnzuur in een Eppendorf-buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer twee keer op 20XG gedurende 30 minuten om het onoplosbare materiaal te verwijderen en het supernatant te verzamelen.Neem UV-gedetecteerde chromatogrammen op bij 570 nanometer detectie van hun gesloten vorm en 270 nanometer detectie van de ring-open vorm. Gebruik de niet-bestraalde en bestraalde controlemonsters die op dezelfde wijze zijn bereid als de stamoplossingen in de celexperimenten om de specifieke retentietijden te bepalen en de methode te kalibreren. Herhaal het experiment drie keer en plot het genormaliseerde percentage van elke fotovorm op de plot, percentage versus afstand tot het bestraalde weefseloppervlak.Op dag nul ent u de C57 zwarte 6 muizen volwassen vrouwtjes met een gewicht van ongeveer 20 gram elk subcutaan met een suspensie van ongeveer een half miljoen Lewis longcarcinoomcellen in ongeveer 100 microliter DMEM en Matrigel mix in de rechter achterpoot. Deze procedure wordt uitgevoerd onder 5% isofluraan sedatie. De dieren zijn klaar voor de behandeling op dag vijf tot acht, wanneer de tumoren voelbaar zijn.Alle bewerkingen waarbij wordt getest, moeten onder halfdonkere omstandigheden worden uitgevoerd. Deze voorwaarde geldt ook bij de behandeling van de dieren na ontvangst van de samengestelde dosis gedurende een periode van twee dagen. Stel willekeurig vier groepen van acht dieren samen en verwijder de vacht uit het tumorgebied.De twee controlegroepen krijgen een intraveneuze injectie van het medium. 100 microliter zoutoplossing per dier van 20 gram, en de dieren in de twee experimentele groepen ontvingen de geteste verbinding in de inactieve fotovorm in een oplossing van één milligram per milliliter zoutoplossing. Dien de samengestelde bolus toe in de staartader met vijf milliliter per kilo.Twee uur, 45 minuten nadat de verbinding is geïnjecteerd, bestraalt u het tumorgebied gedurende 20 minuten onder isofluraananesthesie met een laser van 650 nanometer, met behulp van een lichtvermogensdichtheid van 100 milliwatt per vierkante centimeter. Observeer de omstandigheden van de dieren zorgvuldig gedurende de komende 30 minuten. Observeer de dieren dagelijks en meet hun gewicht en de afmetingen van hun tumoren.Meet de tumorvolumes en noteer de progressie van de necrose. Bepaal de overlevingskans met behulp van de standaardprocedure. De resultaten van ons protocol voor stap één in het geval van 2D-celkweekexperimenten kunnen worden gepresenteerd als afbeeldingen, zoals hier geïllustreerd op een representatieve afbeelding voor Lewis-longcarcinoomcellen geïncubeerd met LMB002 in verschillende concentraties en gedurende verschillende perioden van de incubatie.Costaining met Hoechst en propidiumjodide maakt de visualisatie van celkernen in het blauwe kanaal mogelijk, waardoor een totaal celgetal ontstaat. Cellen met een gecompromitteerde integriteit van het plasmamembraan werden waargenomen in het rode kanaal. Ervan uitgaande dat deze laatste necrotisch dood is, kan de schijnbare cytotoxiciteit van een bestudeerde verbinding worden gekwantificeerd als een percentage van de propidiumjodide-positieve cellen.De resultaten van de gegevenskwantificering verkregen door geautomatiseerde beeldanalyse worden hier weergegeven. Voor LMB002 kunnen sigmoïdale afhankelijkheden van het percentage propidiumjodide-positieve cellen in de concentratieverbinding worden gezien. Uit deze gegevens kunnen de IC50-waarden worden bepaald.Ons experiment onthulde dat de open vorm van LMB002 ongeveer één verdunningsstap minder toxisch is dan het prototypepeptide, Gramicidin S, terwijl de gesloten vorm drie tot vier verdunningsstappen lagere toxiciteit vertoont, die toeneemt met de incubatietijd. De 3D-celexperimenten produceerden hetzelfde type ruwe gegevens, de eencellige opgeloste sferoïde beelden van één per muur. De opname van calceïne als een derde kleurstof maakt de kwantificering mogelijk van de fractie metabolisch actieve cellen die in het groene kanaal wordt waargenomen.De dosiseffectcurven, zoals die in het 2D-experiment, werden verkregen uit de Z-stack stapels afbeeldingen. Paneel A illustreert dergelijke curven en bevestigt de 2D-resultaten. Zoals weergegeven in paneel B, varieert de totale sferoïde diameter met de concentratie van de verbinding.Het experiment voor stap twee maakt het mogelijk om LMB002-concentraties in beide fotovormen te bepalen met behulp van UV-gedetecteerde, hoogwaardige vloeistofchromatografie. Beide fotovormen waren voldoende verschillend in retentietijden en absorptie, weergegeven geïntegreerd op de panelen A en B van de figuur. De verkregen gegevens zijn samengevat in de figuur en bevestigen dat onze rode lichtbron de ringgesloten LMB002-fotoconversie induceert op een diepte van maximaal één centimeter in het weefselsurrogaat, gehakt met ongeveer 103 milliwatt per vierkante centimeter.De resultaten van het in vivo experiment, stap drie van onze methodologie, werden weergegeven door grafieken die tumorgroei laten zien als een functie van de tijd in Kaplan-Meier overlevingscurven. De strategie die hier wordt weergegeven voor het evalueren van fotoschakelbare kandidaat-geneesmiddelen is praktisch en geschikt voor verbindingen met diaryletheen-achtige fotoschakelaars. Stap één, cytotoxiciteitskwantificering, kan worden gebruikt voor de eerste screening van de bibliotheken van de fotogecontroleerde verbindingen.Stap twee, de evaluatie van de efficiëntie van fotoswitching is zowel eenvoudig in te stellen als ethisch. Het vereist geen levende dieren. Stap drie, in vivo fotofarmacologiemodellen, kan de therapie worden toegepast op kleine dieren.

in-vitro-vivo-evaluation-photocontrolled-biologically-active

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. This video describes the in vivo anti-tumor efficacy analysis using photosensitizer containing nanoparticles in a tumor-bearing mouse, to determine the phototoxic potential of the photosensitizer.

In Vivo Antitumor Efficacy Analysis of PDT: A Technique to Determine the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Tumor Bearing Mice

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

Het protocol hier vermeld kan de evaluatie van de effectiviteit van fotodynamische therapie (PDT) in cellijnen en de optimalisering van de PDT instellingen alvorens de therapie diermodellen.

Cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen<em&gt; In Vitro</em

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbaar licht photoactivation te induceren van apoptose. We presenteren een in vitro PDT protocol ontworpen om te simuleren van PDT die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de verschillen in PS incubatie en licht behandeling parameters.

Een benadering In Vitro Fotodynamische therapie

Hier beschrijven we een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om met succes in vitro fotodynamische therapie (PDT) -testen uit te voeren met behulp van tweedimensionale HeLa-celcultuur en verteporfine als een fotosensitizer.

Een in-house gebouwd en licht-emitting-diode-gebaseerd fotodynamisch therapie-apparaat voor het verbeteren van verteporfine cytotoxiciteit in een 2D-celcultuurmodel

Het hier verstrekte protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen uit te voeren in een bioluminescent model van Trypanosoma cruzi-infectie , met een focus op gegevensverzameling, -analyse en -interpretatie. Er zijn ook procedures voor probleemoplossing en kwaliteitscontrole om technische problemen tot een minimum te beperken.

Demystificerende in vivo bioluminescentiebeeldvorming van een muismodel van de ziekte van Chagas voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en economische methode voor het evalueren van de effectiviteit van potentiële fotosensibilisatoren bij antibacteriële fotodynamische inactivatie (aPDI), met behulp van een plaatformaat met 96 putjes in combinatie met een lichtbron van een LED-paneel. Deze benadering maakt het mogelijk om meerdere experimentele omstandigheden gelijktijdig te testen, waaronder verschillende concentraties, verbindingen en bacteriestammen.

LED-gebaseerde in-vitroscreening voor het beoordelen van fotoactiveerbare moleculen bij bacteriële fotodynamische inactivatie

Dit manuscript presenteert een nieuw, innovatief 3D-geprint verlichtingsapparaat voor het bestuderen van Rose Bengal-gemedieerde fotodynamische therapie in vitro.

Ontwikkeling van een innovatief LED-gebaseerd verlichtingsapparaat voor in vitro toepassing van fotodynamische therapie met Rose Bengal

Leer de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden met cytotoxiciteitstests in 2D- en 3D-celculturen. Deze methode ondersteunt vroeg preklinisch onderzoek naar veilige fotofarmacologische geneesmiddelen.

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker (Video) | JoVE Journal

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

Meer video's verkennen