Het meten van lokale weefselspanningen in pezen via open-source digitale beeldcorrelatie

Dit protocol maakt het mogelijk om de lokale weefselspanningen in een pees tijdens het laden te meten. Het is nuttig om te begrijpen hoe pezen zich mechanisch gedragen en zich aanpassen aan hun laadomgeving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gebruikte software online openbaar beschikbaar is en feedback geeft over de meetnauwkeurigheid, zelfs als de ware weefselstammen onbekend zijn.

Het meten van lokale weefselspanningen in een pees is waardevol om te begrijpen hoe cellen weefsel hermodelleren tijdens peesdegeneratie en -herstel. Stanton Godshall, een niet-gegradueerde student, en Krishna Pedaprolu, een promovendus in mijn laboratorium, zullen deze procedure demonstreren. Na het kleuren van de geoogste achillespezen in DTAF, breng het weefsel over van de DTAF-oplossing naar de DRAQ5-oplossing en incuber de weefsels gedurende 10 minuten in een donkere ruimte bij kamertemperatuur.

Plaats de pees in de grepen van de trekbelasting. Voordat u de handgrepen in de laadinrichting monteert, gebruikt u digitale remklauwen om de afstand tussen het calcaneus-bevestiging en de tegenovergestelde greep te meten. Monteer de grepen in het laadapparaat met PBS om de weefselhydratatie te behouden.

Lijn de pees zo goed mogelijk af op de x-as of y-as van de microscoopbeelden, zodat de X-spanning en Y-rekuitgangen van het algoritme overeenkomen met de peesas. Laad de pees voor met één gram spanning. Indien gewenst, fotobleekt een set van vier lijnen met een onderlinge afstand van 80 micron in het middengebied van het weefsel en herhaalt u het proces aan de linker- en rechteruitersten in de buurt van de grepen.

De verandering in afstand tussen de lijnen in elk weefselgebied is een secundaire meting van de lokale weefselstammen die kan worden gebruikt om de gegevens te valideren. Verkrijg vervolgens met behulp van de confocale microscoop volumetrische beelden van de DTAF- en DRAQ5-fluorescentie bij één gram voorbelasting. Voer een rekhelling uit naar 2% spanning met 0,5% per seconde.

Merk op dat de reksnelheid en de incrementele spanningsgrootte kunnen worden aangepast. Nadat u het weefsel gedurende 10 minuten hebt laten ontspannen, neemt u na de vervorming nog een volumetrisch beeld van het weefsel. Herhaal het proces voor zoveel rekverhogingen als gewenst.

Als u de digitaal getransformeerde afbeeldingen wilt maken, downloadt u de code digital_strain. m van GitHub. Na het downloaden opent u de code en voert u deze uit.

Wanneer u hierom wordt gevraagd, voegt u de gewenste waarden in voor de maximaal toegepaste spanning, de toegepaste spanningstoename en de verhouding van Poisson voordat u op OK drukt. Wanneer u hierom opnieuw wordt gevraagd, selecteert u de niet-vervormde referentieafbeelding. Voor elke stamtoename wordt een overlay van de referentieafbeelding en de getransformeerde afbeelding weergegeven. De digitaal getransformeerde afbeeldingen worden opgeslagen in de directory met de naam digitaal getransformeerde X procent-stam, waarbij X de stamtoename is.

Open het script met de weergegeven naam en klik op Uitvoeren om de afbeeldingsanalyse te starten. Wijzig desgevraagd de waarden voor de verhoogde Lagrangiaanse digitale beeldcorrelatie of ALDIC-parameters naar wens. Nadat u hierom bent gevraagd, schakelt u het selectievakje ja in om automatisch de gemiddelde waarde, standaarddeviatie en 2D-kaart op te slaan voor de gewenste verzameling variabelen.

Wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u de gewenste variabelen zoals X-stam, Y-stam, afschuifspanning, slechte regio's, enzovoort en drukt u op OK. Selecteer na de volgende prompt de map met de hernoemde maximale intensiteit Z-projecties. De software voert automatisch incrementele ALDIC uit om de spanningsvelden van de vervormde beelden te bepalen. Klik desgevraagd met de linkermuisknop om een vierpuntsveelhoek te maken om het interessegebied voor het meten van de stammen te definiëren.

De nucleaire trackingresultaten van de map, die kunnen worden hernoemd door de regels 555 en 556 aan te passen, slaat alle eerder opgegeven percelen op. Deze map bevat ook een spreadsheet met de naam resultaten, waarin alle eerder opgegeven gemiddelden en standaardafwijkingen worden opgeslagen. Bij validatie met behulp van digitaal gespannen beelden onderschatte het ALDIC-algoritme consequent de gemiddelde X-stam en nam de foutgrootte toe met toenemende toegepaste spanning.

De Y-stam werd ook grotendeels onderschat. In alle gevallen was de omvang van de stamfout echter zeer klein. De standaardafwijking van de berekende X-stam en Y-stam, hoewel laag in omvang, nam toe met toenemende toegepaste spanning.

Slechte regio-analyse onthulde dat het aantal slechte regio's met ongeldige stamberekeningen in de digitaal getransformeerde afbeeldingen die met behulp van de cumulatieve methode werden geanalyseerd, consistent toenam na 6% toegepaste stam, terwijl de incrementele hoeveelheid op 1% bleef In een van de vier monsters, die als een uitschieter werd behandeld, werd bijna de helft van het beeld geïdentificeerd als slecht bij de maximale stamtoename. De door ALDIC berekende X-stammen waren groter dan die bepaald uit de PBL's, waarbij het verschil binnen 0,005 lag, wat vergelijkbaar is met de standaarddeviatie voor de PGO-gegevens gemiddeld over alle monsters. Het bepalen van de groottes en ruimtelijke verdelingen van de lokale stammen in de pezen onder trekbelasting toonde aan dat over alle monsters de X-stam consequent onder de toegepaste stammen bleef.

De gemiddelde spanning in de Y-richting was ongeveer nul voor alle stappen, maar de standaarddeviatie was hoog. De gemiddelde schuifspanning nam gestaag toe gedurende de rekstappen. Het belangrijkste punt om te onthouden is om de afbeeldingen op te slaan voordat u een grotere belasting toepast.

De afbeeldingen, indien niet opgeslagen, gaan verloren en kunnen niet worden hersteld. Hoewel deze techniek specifiek is gevalideerd voor het meten van weefselspanningen in pezen, kan het inzicht geven in de mechanische biologie en mechanica van vele andere dierlijke en menselijke weefsels.