Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Dit protocol is voor een robuuste en kosteneffectieve methode die kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan onderzoeksvragen met betrekking tot de functie en de rol van luchtwegepitheelcellen in gezondheid en ziekte aan te pakken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het resulteert in een cellaag die een goede weergave is van de menselijke epitheelcellaag, inclusief slijmproductie en ciliaire activiteit. Deze techniek is veelzijdig en kan worden gebruikt om ziektegerelateerde beledigingen of therapieën te bestuderen.

Spoel om te beginnen de bronchiale ring geïsoleerd uit menselijk longweefsel met 10 milliliter steriele PBS in een petrischaal van 10 centimeter. Terwijl u de ring met een pincet vasthoudt, gebruikt u een kleine schaar om overtollig bindweefsel en bloedresten te verwijderen. Snijd de ring in tweeën en dompel twee helften onder in 10 milliliter voorverwarmde Protease 14-oplossing in HBSS met Primocin in een gesloten steriele container.

Incubeer de bronchiale ringstukken bij 37 graden Celsius gedurende twee uur. Breng na incubatie de stukjes over in een petrischaal met 10 milliliter warme PBS en schraap met een gebogen pincet de binnenkant van de ring om een celoplossing te verkrijgen. Gooi de ring weg.

Breng de celoplossing over in een buis van 50 milliliter en voeg warme PBS toe om een eindvolume van 50 milliliter te verkrijgen. Centrifugeer de celoplossing en zuig het supernatant op voordat u de pellet opnieuw in 10 milliliter warme PBS suspenseert. Vul het volume aan tot 50 milliliter met PBS en herhaal de centrifugatie.

Suspensie van de pellet opnieuw in warme complete KSFM met Primocin. Vervang vervolgens de coatingoplossing van de zesputplaat door twee milliliter celsuspensie per put. Laat de cellen groeien tot 80 tot 90% confluentie is bereikt, Voor cryopreservatie van PBECs, zuig het medium uit de putten en was de cellen eenmaal met twee milliliter warme PBS per put.

Trypsiniseer de cellen door 500 microliter zacht trypsine per put toe te voegen en incuber gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius. Draai de trypsine-oplossing en laat de cellen los door zachtjes op de plaat te tikken. Breng de losgemaakte cellen over in een centrifugebuis van 50 milliliter met soja-trypsineremmer.

Centrifugeer de suspensie en gooi het supernatant weg voordat u de pellet opnieuw opsuspenseert in 10 milliliter KSFM met penicilline en streptomycine. Na het tellen van de cellen op een geautomatiseerde celteller, suspensie de cellen opnieuw tot een concentratie van 400.000 cellen per milliliter in een vriesmedium en voeg een milliliter van deze suspensie toe in een cryovial. Breng de injectieflacons over in een koelcelcontainer en plaats deze op min 80 graden Celsius.

Breng de injectieflacons na 24 uur over naar vloeibare stikstof van minder dan 196 graden Celsius voor langdurige opslag. Om een T75-celkweekkolf te coaten, voegt u 10 milliliter coatingoplossing in PBS toe en sluit u het deksel goed voordat u de kolf in een incubator plaatst bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang de volgende dag de coatingoplossing uit de kolf door 10 milliliter complete KSFM.

Laat het medium opwarmen tot 37 graden Celsius in de incubator met een licht geopend deksel om de incubator binnen te laten. Ontdooi de gecryopreserveerde PBEC's snel in een kralenbad van 37 graden Celsius. Voeg de volledige inhoud van de cryovial toe aan de voorverwarmde T75-kolf en verdeel de cellen gelijkmatig.

Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de cellen stevig zijn bevestigd, vervangt u het medium door 10 milliliter verse en warme complete KSFM en laat u ze groeien totdat 80 tot 90% samenvloeiing is bereikt. Coat celkweek inserts door 400 microliter coatingoplossing per insert toe te voegen en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Trypsiniseer de PBEC's in de kolf door twee milliliter zacht trypsine toe te voegen en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten.

Vergemakkelijk het loslaten van de cel door te draaien en zachtjes op de kolf te tikken. Voeg vervolgens vier milliliter soja-trypsineremmer toe aan de kolf en breng de celsuspensie over in een buis van 25 milliliter. Centrifugeer de suspensie en suspensie de pellet opnieuw in zes milliliter compleet BD-medium.

Tel de cellen op een geautomatiseerde celteller. Verwijder na het coaten de coatingoplossing van de inzetstukken. Verdun de celsuspensie met volledig BD-medium aangevuld met één nanomol EC 23 en voeg 500 microliter toe aan de bovenkant van het membraan van de inserts.

Voeg 1,5 milliliter compleet BD-medium toe aan de put onder de insert. Wanneer de cellen klaar zijn voor overdracht naar de Air-Liquid Interface, of ALI, verwijdert u het medium uit de inserts en de put en voegt u een nieuw compleet BD-medium aangevuld met 50 nanomolar EC 23 alleen aan de put toe. Verander het medium in de putten drie keer per week.

Om overtollig slijm en cellulair afval te verwijderen, voegt u voorzichtig 200 microliter warme PBS toe aan de apicale kant van de cellaag in de insert en incubeert u gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Na incubatie, zuig de PBS met overtollig slijm en cellulair puin op. TEER werd gemeten om de kwaliteit van ALI PBEC-culturen te beoordelen.

Na zeven dagen wordt de elektrische weerstand van de cellaag hoger dan 300 ohm als een succesvolle cultuur beschouwd. Verder is de interdonorvariabiliteit in de elektrische weerstand in de loop van de tijd afgenomen tussen dag zeven en dag 14 van de cultuur op de Air-Liquid Interface, en wordt duidelijk beïnvloed door de oorsprong van de gebruikte DMEM. Alle belangrijke verschillende celtypen, zoals basale, trilhaar, bokaal- en clubcellen, werden waargenomen na 14 dagen ALI-cultuur en de expressieniveaus waren donorafhankelijk.

Onder de verschillende concentraties van geteste EC 23 werd maximale TEER waargenomen bij 50 nanomolair. Een vergelijking van retinoïnezuur en zijn synthetische analoog, EC 23, bevestigt dat de genexpressie van markers voor trilhaar- en bokaalcellen vergelijkbaar was tussen 50 nanomolair EC 23 en retinoïnezuur. Het gebruik van medium van verschillende leveranciers resulteerde in aanzienlijke verschillen in cellulaire samenstelling, terwijl verschillen in TEER minder uitgesproken waren.

Aan de andere kant resulteerde het gebruik van inserts van verschillende leveranciers niet in substantiële verschillen in cellulaire ontleding. Bovendien werd ook een verschil in TEER-waarden en cellulaire samenstelling van het ALI PBEC en het PneumaCult-medium waargenomen in vergelijking met het volledige BD-medium. Wanneer de cellen klaar zijn om over te brengen naar ALI, verhoogt u de EC 23-concentraties.

Centrifugeer de cellen ook niet na het ontdooien en verwijder de cellen snel uit celkweekplastics na het toevoegen van SBTI. Met behulp van culturen van luchtwegepitheelcellen zoals in dit protocol wordt voorzien, kun je dat opvolgen met behulp van verschillende analysemethoden om bijvoorbeeld te kijken naar de functie, genexpressie, mediatorproductie van de luchtwegepitheelcellen, en zo bijvoorbeeld inzicht te krijgen in de gevolgen van blootstelling aan bijvoorbeeld sigarettenrook. De volgende stappen voor dit celkweekprotocol is de integratie van extra celtypen, zoals immuuncellen of vasculaire cellen, en dit zal helpen om de weefselrepresentatie te vergroten.