Verstoring van de bloed-ruggenmergbarrière met behulp van gefocusseerde echografie met lage intensiteit in een rattenmodel

De bloed-ruggenmergbarrière is nauw verbonden en heeft een beperkte doorlaatbaarheid. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de bloed-ruggenmergbarrière veilig en tijdelijk te openen, met behulp van microbellen en gerichte echografie. Met deze techniek kan de opening van de bloed-ruggenmergbarrière worden gelokaliseerd in het beoogde ruggenmergsegment.

Bovendien kan de verstoring eenvoudig worden bevestigd via visuele waarneming of fluorescerende microscopie. Dit protocol kan worden onderzocht op zijn potentieel bij het verbeteren van de toediening van gentherapieën of geneesmiddelen aan het ruggenmerg voor de behandeling van tumoren, atrofie of letsel. Meghana Bhimreddy zal de procedure demonstreren.

Een geweldige MD-student uit mijn laboratorium, die dagelijks de kloof tussen techniek en geneeskunde overbrugt. Schaf om te beginnen een gericht ultrasoon transducersysteem aan met specificaties die voldoende zijn om de bloed-ruggenmergbarrière of BSCB-openingen bij ratten te bereiken. Bevestig de 3D-geprinte sondehouder en waterkegel op de transducer.

Zorg voor een waterdichte afdichting tussen de conus en de transducer. Bevestig het gesteriliseerde, 50 micron dikke, akoestisch transparante, polyester membraan met een rubberen band aan de bodem van de waterkegel. Vul de waterkegel met ontgast en gedeïoniseerd water met behulp van de inlaat- en uitlaatbuizen.

Vermijd luchtbellen in de conus, omdat deze de akoestische koppeling tussen de transducer en het doel kunnen verstoren. In dit stadium moet het Mylar-membraan licht worden opgeblazen. Sluit de aandrijfapparatuur met de golfgenerator en de radiofrequentie-aandrijfversterker aan op de transducer.

Bevestig de stereotactische arm aan de bevestigingsplaat en bevestig de sondehouder aan de arm. Noteer het gewicht van een verdoofde vrouwelijke Sprague-Dawley-rat en voer een teen- en staartknijptest uit om de anesthesie te bevestigen. Plaats een verwarmingskussen en een steriel absorberend kussen op de fixatieplaat.

Plaats de rat op het absorberende kussen. Breng oogzalf aan en plaats een rectale thermometer om de lichaamstemperatuur te controleren. Palpeer de laatste rib van de rat, die aan de wervelkolom is bevestigd bij de 13e borstwervels.

Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de vacht van het dorsale oppervlak tussen de laatste rib en nek te scheren. Veeg de onbedekte huid af met gaas gedrenkt in 10% jodopovidon. Maak een incisie in de middellijn met een irisschaar en ontleed door de fascia totdat de processus spinosus en lamina zichtbaar zijn.

Verwijder het bot met een offset bottang en een irisschaar met schuin mes, totdat het ruggenmerg bloot komt te liggen. Zet de rat vast aan de fixatieplaat door de processus spinosus naast de laminectomie vast te klemmen. Trek vervolgens lichtjes aan de klemmen om de wervelkolom strak te maken.

Pas de positie van de transducer aan met de stereotactische arm totdat deze zich precies boven de laminectomie bevindt. Bevestig het laserapparaat aan de onderkant van de waterkegel en laat het zakken totdat het laserpunt zichtbaar is. Pas vervolgens de laterale positie van de transducer aan totdat het laserpunt zich boven de doellocatie bevindt voor BSCB-verstoring.

Verwijder het laserapparaat en vul de ruimte tussen de kegel en het ruggenmerg met ontgaste ultrasone gel, zonder luchtbellen te introduceren. Stel de parameters voor sonicatie in op het uitgangsvermogen van de transducer. Bereid een microbellenoplossing volgens de instructies van de fabrikant.

Om de kans op een succesvolle katheterisatie van de staartader te vergroten, dompelt u de staart in warm water en plaatst u een tourniquet aan de basis van de staart om de aderdiameter te vergroten. Breng vervolgens een staartaderkatheter van 22 gauge in en spoel met 0,2 milliliter gehepariniseerde zoutoplossing. Injecteer één milliliter per kilogram 3% Evans Blue Dye of EBD in de katheter.

Spoel vervolgens de katheter door met 0,2 milliliter gehepariniseerde zoutoplossing. Bevestig de succesvolle staartaderkatheterisatie door te controleren op blauwe kleurverandering in de huid, ogen of dorsale ruggenmerg van de rat. Injecteer 0,2 milliliter bolus microbellen in de katheter en spoel met gehepariniseerde zoutoplossing voordat u met de sonicatie begint.

Nadat u de rat hebt geëuthanaseerd, verwijdert u het ruggenmerg en plaatst u het een nacht in 4%paraformaldehyde bij vier graden Celsius. Vervang de volgende dag het paraformaldehyde door PBS. Om BSCB-verstoring te visualiseren, isoleert u een doorsnede van twee centimeter rond de locatie van sonicatie met behulp van een scheermesje.

Verdeel de sectie in secties van 10 micron dik met behulp van een microtoom en beits met hematoxyline-eosinekleuring. Voor fluorescentiemicroscopie deparaffiniseert u het objectglaasje met het ruggenmerggedeelte en gaat u de vlek tegen met 25 microliter DAPI opgelost in het montagemedium. Incubeer de secties bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten in het donker om bleken te voorkomen.

Gebruik na incubatie een fluorescentiemicroscoop om alle objectglaasjes in beeld te brengen. Beeld het met hematoxyline en eosine gekleurde objectglaasje met behulp van een lichtmicroscoop. Het vasculatuur van het ruggenmerg is zichtbaar na laminectomie en toont de achterste ruggenmergader, met meerdere kleinere bloedvaten die lateraal uitstralen.

Na intraveneuze injectie van EBD leken het omliggende weefsel en de vasculatuur van het ruggenmerg blauw. Na sonicatie wordt een blauwe vlek zichtbaar boven de beoogde locatie, wat wijst op de extravasatie van EBD in het witte parenchym, als gevolg van BSCB-verstoring. Uitgesneden ruggenmerg van de ratten met gefocuste echografie met lage intensiteit, of LIFU-sonicatie, bevestigde schijnbare extravasatie van EBD in het ruggenmerg.

Terwijl negatief gecontroleerde ratten zonder LIFU-behandeling geen EBD-extravasatie vertoonden. Ruggenmerg met LIFU-sonicatie vertoonde een significant grotere intensiteit van EBD-autofluorescentie dan koorden die geen sonicatie ontvingen. Met vergelijkbare intensiteiten van DAPI aanwezig in beide.

Hematoxyline- en eosine-analyse onthulde geen neuronale schade, bloeding of holtelaesies op de gesoniceerde locaties. Voorbeelden van gewonde snoeren als gevolg van chirurgische verkeerde behandeling en krachtige sonicatie worden ter vergelijking getoond. Bij ratten die microbellen en LIFU-behandeling kregen, werd geen verandering waargenomen in motorische scores, pre-sonicatie, post-sonicatie en gedurende een overlevingsperiode van vijf dagen.

Minimale veranderingen in de temperatuur van het ruggenmerg werden waargenomen vóór, tijdens en na sonicatieanalyse. Het is belangrijk om chirurgische schade aan de navelstreng tijdens de laminectomie te beperken. Het visualiseren van de H- en E-gekleurde secties met microscopie geeft aan of er schade is opgetreden.

Na verstoring van de bloed-ruggenmergbarrière, met behulp van focus-echografie, kunnen dieren worden geïnjecteerd met antineoplastische middelen of gentherapieën. De uitkomst zal bepalen of deze techniek de toediening van therapieën kan verbeteren en de overleving in de setting van ruggenmergpathologie kan verlengen.