Name: Gefocusseerde ultrasone neuromodulatie van menselijke in vitro neurale culturen in multi-well micro-elektrode-arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: Leer gefocusseerde ultrasone neuromodulatie van menselijke iPSC-neuronen in multi-well micro-elektrode-arrays. Dit protocol optimaliseert stimulatieparameters voor niet-invasieve behandeling van neurologische aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amir Manbachi en Nitish Thakor erkennen financiële steun van het Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Award Contract: N660012024075. Daarnaast erkent Amir Manbachi de financiële steun van het Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR)'s Clinical Research Scholars Program (KL2), beheerd door het National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor erkent financiële steun van de National Institutes of Health (NIH): R01 HL139158-01A1 en R01 HL071568-15.

1. Voorbereiding van materialen
<ol><li>Zuig het kweekmedium op en gebruik het om een enkel putje te vullen in een neuronkweekplaat met 24 putjes met ingebed MEA (Figuur 2A). Kweek en induceer de neuronen volgens het gepubliceerde protocol van Taga et al.13.</li>
	<li>Steriliseer de parafilminterface, de rubberen band en de FUS-kegel met zijn rubberen membraan met 70% ethanol gedurende 10 minuten en plaats ze in de zuurkast voor latere montage.</li>
	<li>Ontgas 300 ml gedeïoniseerd water en 50 ml koppelingsgel. Centrifugeer het water en de gel gedurende 5 minuten op 160 x g om cavitatie in het koppelingsmedium te voorkomen. OPMERKING: De oorspronkelijke bron van de HiPSC's is afkomstig van GM01582- en CIPS-cellijnen. Gemiddeld kan een dichtheid van 5 x 104 motorneuronen en 2,5 x 104 astrocyten per put worden bereikt14.</li>
</ol>2. Aansluiten en instellen van de randapparatuur
<ol><li>Bevestig de FUS-conus met schroeven aan de transducer en sluit de conus af met een flexibel rubberen membraan in een geventileerde steriele kap. Vul de kegel met het ontgaste en gedeïoniseerde (DG-DI) water uit stap 1.3 en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kegel zijn om cavitatie te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik een op maat gemaakte draadstang om de 3D-geprinte houder aan een frame te bevestigen (Figuur 2B). Plaats het frame zo dat de kop van de FUS-transducer zich boven het te stimuleren putje bevindt.</li>
	<li>Gebruik een elastiekje om parafilm over het putje te bevestigen op de MEA-plaat met 24 putjes die het medium en de HiPSC's bevat.</li>
	<li>Bereid het FUS-systeem voor door de back-end driverelektronica van de ultrasone transducer aan te sluiten, in dit geval de uitgangsvermogen van de transducer (TPO; Afbeelding 3A), op een stopcontact van 100-240 V (Afbeelding 3B, Aansluiting 6) en het aansluitende netwerk aansluiten op de TPO en de FUS-transducer (Afbeelding 3B, respectievelijk Aansluiting 1 en Aansluiting 2). Het bijpassende netwerk zorgt voor een efficiënte elektrische koppeling tussen de transducer en de TPO.</li>
	<li>Sluit het MEA-systeem aan op een stopcontact (100-240 V) (Figuur 3B, aansluiting 5). Sluit de MEA-systeemsynchronisatiepoort aan op de TPO (Figuur 3B, Aansluiting 3). Deze verbinding synchroniseert de data-acquisitie door het MEA-systeem met de FUS-stimulatie.</li>
	<li>Plaats de MEA-plaat met 24 putjes in het MEA-systeem en verwijder het deksel om direct contact tussen de transducer en de put mogelijk te maken. Plaats de transducer 5-10 mm boven de putplaat om ruimte te maken voor de ontgaste koppelingsgel, zoals beschreven in stap 3.2 (Figuur 3A en Figuur 2B).</li>
</ol>3. Stimulatie en neuronale signaalacquisitie
<ol><li>Stel de FUS-parameters in op het TPO-bedieningspaneel (tabel 1).</li>
	<li>Breng de koppelingsgel aan op de parafilm en laat de FUS-transducer in de koppelingsgel zakken, waarbij u zorgt voor contact met de gel met minimale luchtbellen (Figuur 2A).</li>
	<li>Start de opname van het MEA-systeem door op de knop Start op de gebruikersinterface te klikken.</li>
	<li>Start de FUS-sonicatie door op de knop rechtsonder op de TPO te drukken (Figuur 3A, label 7) en wacht ten minste 5 minuten tussen elke sonicatieronde om de neuronen te laten terugkeren naar een basislijntoestand.</li>
	<li>Gebruik de triggerpuls die door het FUS-systeem wordt gegenereerd om de FUS-stimulatiesequentie af te stemmen op de MEA-opname (Figuur 3B, Aansluiting 3).</li>
</ol>4. Gegevensverwerking en -analyse
<ol><li>Breng de gegevens over van het MEA-systeem naar de computer via een USB-aansluiting (Figuur 3B, Aansluiting 4). Start dit door te klikken op het deelvenster Experiment instellen . Kies vervolgens het gegevenstype dat u wilt vastleggen. In dit geval worden ruwe spikes aanbevolen. Geef ten slotte het bestand een naam en selecteer de gewenste locatie op het schijfstation om de overdracht te voltooien. OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd door het vrijgegeven Python-script in https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod uit te voeren.</li>
	<li>Lees de gegevens van elk van de 16 elektroden in.</li>
	<li>Pas een Butterworth-banddoorlaatfilter toe met een bandbreedte van 5 Hz tot 3 kHz met een Butterworth-orde van 8. OPMERKING: Om deze waarden te optimaliseren, is het van cruciaal belang om rekening te houden met de vuursnelheid van de specifieke cellen en het aantal betrokken cellen. Door deze 2 waarden te vermenigvuldigen, kan men de totale vuursnelheid van de celpopulatie in het experiment schatten.</li>
	<li>Pas een Gaussiaans filter toe met σ = 3 om het signaal vloeiender te maken. OPMERKING: De parameter kan worden geoptimaliseerd op basis van de aanbevolen waarden van het MEA-systeem, aangezien overmatige afvlakking kan leiden tot gegevensvervorming na acquisitie en te weinig afvlakking ongewenste ruis zou veroorzaken.</li>
	<li>Stel een drempelwaarde in om de potentiële pieken te detecteren als 5 keer de standaarddeviatie van het Gaussiaans afgevlakte signaal.</li>
	<li>Bereken de vuursnelheid door het aantal geregistreerde pieken in een venster van 50 ms over alle 16 kanalen te delen door de lengte van het venster (d.w.z. 50 ms). Schuif het venster langs het signaal naar het volgende frame en herhaal de berekening van de vuursnelheid (aanvullende afbeelding 1).</li>
	<li>Analyseer het signaal door de FUS-sonicatietijd af te lezen van de overgedragen gegevens op basis van de verandering in de vuursnelheid die aan de FUS is gekoppeld.</li>
</ol>5. Reiniging en hergebruik van MEA-platen met meerdere putten
<ol><li>Zodra de experimenten zijn voltooid, gebruikt u een pipet om het medium voorzichtig uit de putjes in de multiwell-plaat te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat het elektrodeoppervlak wordt vermeden.</li>
	<li>Voeg 2 ml DG-DI water per putje toe. Aspireer en herhaal eenmaal.</li>
	<li>Om cellen en vuil los te maken, voegt u een mengsel van 1 g enzymatisch wasmiddel Terg-A-Zyme met 10 ml steriel DG-DI-water (0,3 ml per putje) toe aan de plaat. Laat het een nacht op kamertemperatuur (RT) incuberen.</li>
	<li>Verwijder de volgende dag de oplossing uit de putjes en spoel ze af met 1 ml steriel DG-DI-water.</li>
	<li>Incubeer de multi-well-plaat gedurende 5-7 minuten en zuig op. Herhaal deze stap 5 keer.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml steriel DG-DI-water per putje toe. Noteer de basislijn van de gereinigde multiwell-plaat om te valideren dat de MEA-plaat schoon is. Een gereinigde plaat moet Gaussiaanse ruispatronen vertonen met lage intensiteitswaarden.</li>
	<li>Bewaar de gereinigde multiwell-plaat bij 4 °C totdat deze klaar is voor gebruik. Ververs het water waarin de MEA's worden opgeslagen minstens één keer per maand.</li>
</ol>

<ol><li>Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation%3A+Mechanisms+and+the+potential+of+multimodal+stimulation+for+neuronal+function+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment.</a> Frontiers in Physics. 8, 150(2020).</li>
<li>Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManbachi%2C+A+%22The+Abundant+Promise+of+Ultrasound+in+Neurosurgery%3A+A+Broad+Overview+and+Thoughts+on+Ethical+Paths+to+Realizing+Its+Benefits%22">The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits</a>. , SPIE PRESS. Bellingham. Washington, USA. (2022).</li>
<li>Manbachi, A. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83">https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83</a> (2021).</li>
<li>Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+excites+cortical+neurons+via+mechanosensitive+calcium+accumulation+and+ion+channel+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification.</a> Nature Communications. 13 (1), 493(2022).</li>
<li>Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+form+and+function+of+PIEZO2%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The form and function of PIEZO2.</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+ultrasound+ring+array+transducers+for+transcranial+ultrasound+neuromodulation+of+freely-moving+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%3A+Basic%2C+Translational%2C+and+Clinical+Research+in+Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals.</a> Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).</li>
<li>Hoffman, B. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+excites+action+potentials+in+mammalian+peripheral+neurons+in+part+through+the+mechanically+gated+ion+channel+PIEZO2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119(2022).</li>
<li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanobiology+of+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li>
<li>Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+thermal+effects+of+focused+ultrasound+on+an+identified%2C+single+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron.</a> eNeuro. 8 (2), (2021).</li>
<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosensory+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurosensory mechanotransduction.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (1), 44-52 (2009).</li>
<li>Launay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM4+Is+a+Ca2%2B-activated+nonselective+cation+channel+mediating+cell+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization.</a> Cell. 109 (3), 397-407 (2002).</li>
<li>Cain, S. M., Snutch, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+T-type+calcium+channel+isoforms+to+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing.</a> Channels. 4 (6), 475-482 (2010).</li>
<li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+electrophysiological+platform+for+modeling+ALS+with+regionally-specific+human+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62726(2021).</li>
<li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multielectrode+array+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li>
<li>Manuel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation+depends+on+pulse+repetition+frequency+and+can+modulate+inhibitory+effects+of+TTX%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15347(2020).</li>
<li>Treeby, B. E., Cox, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-wave%3A+Matlab+toolbox+for+the+simulation+and+reconstruction+of+photoacoustic+wave+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields.</a> J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314(2010).</li>
<li>Akhtar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+peripheral+focused+ultrasound+neuromodulation+of+the+celiac+plexus+ameliorates+symptoms+in+a+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease.</a> Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).</li>
<li>Smirnova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+intelligence+%28OI%29%3A+The+new+frontier+in+biocomputing+and+intelligence-in-a-dish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Science%22%5BJournal%5D)">Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish.</a> Frontiers in Science. 1, 1017235(2023).</li>
<li>Saccher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+neuromodulation+on+a+multi-well+MEA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectronic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA.</a> Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2(2022).</li>
<li>Yger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spike+sorting+toolbox+for+up+to+thousands+of+electrodes+validated+with+ground+truth+recordings+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo.</a> eLife. 7, e34518(2018).</li>
<li>Babakhanian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+low+intensity+focused+ultrasound+on+liposomes+containing+channel+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins.</a> Scientific Reports. 8, 17250(2018).</li>
<li>Liang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+an+Accurate+Benchtop+Characterization+Device%3A+An+acoustic+measurement+platform+for+localizing+and+implementing+therapeutic+ultrasound+devices+and+equipment+%28amplitude%29%5BTitle%5D)+AND+%222022+Design+of+Medical+Devices+Conference%22%5BJournal%5D)">Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude).</a> 2022 Design of Medical Devices Conference. , Minneapolis, MN, USA. (2022).</li>
<li>Ko, H., Yoon, S. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+neuromodulation+with+gamma+oscillation+as+a+new+strategy+for+Alzheimer+disease%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Yeungnam+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review.</a> Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).</li>
<li>White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+optogenetics+into+the+human+brain%3A+Opportunities+and+challenges+in+clinical+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Journal+of+Clinical+Trials%22%5BJournal%5D)">Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design.</a> Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties waren die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat. Amir Manbachi doceert en adviseert voor BK Medical (GE Healthcare) en Neurosonics Medical en is een uitvinder van een aantal FUS-technologieën waarvoor patent is aangevraagd. Betty Tyler heeft onderzoeksfinanciering van NIH en is mede-eigenaar van Accelerating Combination Therapies (inclusief aandelen of opties). Ashvattha Therapeutics Inc. heeft een van haar patenten in licentie gegeven en ze is aandeelhouder van Peabody Pharmaceuticals.

Dit manuscript beschrijft een nieuwe methode die kan worden gebruikt om neuronale activiteit in HiPSC's vast te leggen tijdens FUS-neuromodulatie. Dit protocol is generaliseerbaar naar verschillende FUS-transducers en MEA-systemen. Om de resultaten die met het beschreven protocol zijn waargenomen te repliceren, moet de onderzoeker ervoor zorgen dat het brandpunt van de transducer groter is dan het gebied van de bodem van de MEA-put. Bovendien, als verschillende neuronale cellijnen worden gebruikt, moeten de filterparameters worden afgestemd op de verwachte frequentierespons voor de cellen in de put. Als er geen representatieve resultaten kunnen worden bereikt, moet worden overwogen om de bovengenoemde parameters te wijzigen (bijv. de barstlengte, intensiteit, inschakelduur, enz.).
Hoewel dit werk een toename van de vuursnelheid na FUS-stimulatie aantoonde, moeten er meer gegevens worden verzameld om de herhaalbaarheid van deze bevinding aan te tonen voordat er conclusies worden getrokken. Dit protocol erft de beperkingen van MEA-systemen, die doorgaans zwakke punten hebben die voortvloeien uit de directe registratie van micro-elektrodestroomsignalen. Hoewel direct contact met het neuron zorgt voor een betere gevoeligheid, kan het de cel veranderen en de meetnauwkeurigheid beïnvloeden. Bovendien bevat ons systeem, vanwege de kleine omvang van de putjes, geen perifeer weefsel, dat ook een rol kan spelen bij neuromodulatie17. Dit kan de toepasbaarheid van conclusies die uit deze opzet worden getrokken, beperken tot in-vivo-omgevingen . Om complexere netwerkresponsen te bestuderen, moet een MEA-systeem met een hogere kanaaldichtheid worden ontworpen om de gevoeligheid ervan te verbeteren18. Er zijn verschillende toekomstige richtingen voor dit voorgestelde systeem geïdentificeerd, waaronder het gebruik van een 3D-portaal om de transducer vast te houden en een nauwkeurige plaatsing te garanderen19. Aanvullende verbeteringen kunnen worden aangebracht met betrekking tot het nabewerkingsalgoritme, waaronder het gebruik van een spiking-sorteeralgoritme20 om individuele neuronen te classificeren. Dit proces zou gunstig zijn voor het ontrafelen van de reacties van multi-unit neuronen in toekomstige studies naar de mechanismen van FUS. Het belangrijkste is dat het essentieel is om aanvullende modaliteiten van stimulatie op te nemen, zoals chemische, elektrische en optische stimuli, om de onderliggende mechanismen op te helderen. Deze methoden kunnen neuronale eigenschappen en gedragingen veranderen, bijvoorbeeld door specifieke ionkanalente remmen 15 of de membraankenmerken te wijzigen21. Door de belangrijkste factoren binnen de veronderstelde signaalroute te moduleren, kunnen onderzoekers de bijdragen van elke factor in gecontroleerde omgevingen identificeren en uiteindelijk licht werpen op de complexe interacties die in het spel zijn.
Elektrische stimulatie22 is een van de meest gevestigde technieken voor neuromodulatie, met een lange geschiedenis van succesvolle toepassingen in klinische en onderzoeksomgevingen. FUS en optogenetica23 zijn daarentegen relatief nieuwe modaliteiten die de afgelopen jaren aandacht hebben gekregen. De belangrijkste voordelen van FUS zijn de niet-invasieve werking en het vermogen om neuronen te stimuleren op diepten die moeilijk te bereiken zijn met andere technieken, waaronder elektrische stimulatie en optogenetica. Net als optogenetica24 heeft FUS echter enkele beperkingen met betrekking tot het modelleren van de golfvoortplanting en de bijbehorende neuronale reacties. Het kan een uitdaging zijn om de complexiteit van de heterogene akoestische eigenschappen van weefsel in vivo vast te leggen, wat leidt tot onzekerheden in het drukveld en bijgevolg in de neuronale reacties. Deze moeilijkheid om deze eigenschappen nauwkeurig te modelleren, vormt een uitdaging bij het optimaliseren van de techniek voor specifieke toepassingen in de echte wereld. De inherente complexiteit benadrukt het belang van in-vitrosystemen zoals die in deze studie, omdat ze de directe studie van reacties onder gecontroleerde akoestische intensiteitsomstandigheden mogelijk maken.
Concluderend biedt dit systeem een high-throughput, in vitro platform voor het bestuderen van de neuromodulerende effecten van FUS op menselijke neuronen. Met dit systeem kunnen de werkingsmechanismen van FUS worden onderzocht door de elektrische reacties van menselijke neuronen te meten wanneer ze worden blootgesteld aan verschillende niveaus en soorten stimulatie in een gecontroleerde omgeving. Daarom biedt het een waardevol aanvullend hulpmiddel bij de mens- en diermodellen die in het veld vaak worden gebruikt.

Gefocusseerde echografie (FUS) is een veelbelovende neuromodulatiemodaliteit die niet-invasieve stimulatie op centimeterdiepte mogelijk maakt met een resolutie van minder daneen millimeter 1,2,3. Ondanks deze sterke punten is de klinische impact van FUS beperkt, deels door een gebrek aan kennis over het werkingsmechanisme. Zonder een solide theoretische basis ondervinden onderzoekers en clinici moeilijkheden om de therapie af te stemmen op de specifieke behoeften van individuele patiënten onder verschillende omstandigheden. Een prominente theorie voorgesteld door Yoo et al.4 suggereert dat mechanosensitieve ionkanalen verantwoordelijk zijn voor de activering van neuronen. Deze theorie slaagt er echter niet in om FUS-activering in menselijke hersenneuronen te verklaren, diedeze kanalen missen. Deze ambiguïteit beperkt het gebruik van FUS in de kliniek, omdat het de afstemming van FUS-parameters om de behandelingsresultaten te optimaliseren uitsluit.
Eerdere gerelateerde studies hebben een reeks benaderingen gebruikt om de fysiologische mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan FUS en om de optimale stimulatieparameters te bepalen. Een cruciale stap in dit proces is het monitoren van neuronale reacties als feedback, wat kan worden bereikt door middel van methoden met ion-gate-monitoring, zoals calciumionenbeeldvorming4, optische beeldvorming1 en ex vivo elektrofysiologische registratie (bijv. elektromyografie6 of huid-zenuwelektrofysiologie7). De meeste van deze onderzoeken maken echter gebruik van niet-menselijke neuronen of in vivo benaderingen, die extra afwijkingen kunnen introduceren als gevolg van suboptimale controles. Daarentegen biedt het gebruik van elektroden om neuronale signalen te meten in in vitro door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (HiPSC) neuronen gevoeligere metingen en meer controle over de experimentele omgeving. In dit werk is een in vitro systeem ontwikkeld met behulp van micro-elektrode arrays (MEA's) om de elektrische reacties van HiPSC-neuronen na FUS-stimulatie te meten, zoals weergegeven in figuur 1. Dit systeem stelt onderzoekers in de gemeenschap in staat om neuronale reacties te volgen bij het variëren van de ultrasone parameters (bijv. frequentie, burst-lengte, intensiteit). Bovendien maakt dit systeem een hoge mate van controle mogelijk van de neuronale gevoeligheid voor fysieke stimuli (bijv. temperatuur, druk en cavitatie)8,9, aangezien de ionkanaalfunctionaliteit van de neuronen genetisch en farmaceutisch kan worden gemanipuleerd (bijv. gadolinium gebruiken om ionkanalen te remmen)10,11,12. Deze controle op moleculair niveau kan helpen om de mechanismen achter de neuromodulerende effecten van FUS op te helderen.

<table><tbody><tr><td>MEA System</td><td>Axion Biosystem Inc.</td><td>Maestro Edge</td><td>Sampling Rate: 11500 Hz</td></tr><tr><td>MEA Plate</td><td>Axion Biosystem Inc.</td><td>CytoView MEA</td><td>Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells</td></tr><tr><td>Well plate Interface</td><td>Amcor Inc.</td><td>Parafilm PM996; P7793</td><td>Thickness: 127 &micro;m</td></tr><tr><td>CO2 Tank and Regulator for culture</td><td>AirGas Inc./ Harris Inc.</td><td>9296NC</td><td>Concentration: 5%</td></tr><tr><td>Culture Media</td><td>ThermoFisher Inc.</td><td>Laminin; 23017-015</td><td>Concentration: 1 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>HiPSC Neurons</td><td>Peprotech</td><td>CIPS and GM01582 Derived; 450-10</td><td>Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)</td></tr><tr><td>Transducer</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>CTX250; 008</td><td>Center Frequency: 250 kHz</td></tr><tr><td>Matching Network</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>CTX250; NFS102v2</td><td>Impedance: 50 &Omega;</td></tr><tr><td>Transducer Power Output (TPO)</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Version 4.1; 020</td><td>Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz</td></tr><tr><td>Membrane</td><td>McMaster Inc.</td><td>Silicone Rubber; 5542N115</td><td>Thickness: 0.0127 cm</td></tr><tr><td>Coupling Gel</td><td>Parker Laboratory Inc.</td><td>Aquasonic 100; B08DDWG GXB</td><td>Viscosity: 130,000&ndash;185,000 cops</td></tr><tr><td>Connection to Probe holder</td><td>McMaster Inc.</td><td>Steal Threaded Rod; 90322A661</td><td>Length: 1&ndash;1/2" Long</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher Inc.</td><td>Sorvall Legend X1R; 75004261</td><td>Max acceleration: 10&ndash;25,830 x g</td></tr><tr><td>Hydrophone</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Y-104; 009</td><td>Range: 50 kHz&ndash;1.9 MHz</td></tr><tr><td>Water Tank</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>WT</td><td>Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>Water Conditioning Unit</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>WCU; SN006</td><td>Flow Velocity: 50 mL/s maximum</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Rohde-Schwarz Inc.</td><td>RTC1002</td><td>Sampling rate: Up to 50 MHz</td></tr><tr><td>Stage</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>MicroStage; 2</td><td>Accuracy: 1 &micro;m</td></tr><tr><td>Thermochromic sheet</td><td>TIPTEMP Inc.</td><td>Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337</td><td>Range: 22&ndash;24 &deg;C</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Microsoft Surface</td><td>Surface Pro</td><td>CPU i5 1035G4: 3.7 GHz</td></tr><tr><td>Data Transfer Software</td><td>Mathworks Inc.</td><td>MATLAB</td><td>Version 2021b</td></tr><tr><td>Processing Software</td><td>Python Software Foundation</td><td>Python</td><td>Version 3.7.10</td></tr></tbody></table>

gefocusseerde ultrasone neuromodulatie van menselijke in vitro neurale culturen in multi-well micro-elektrode-arrays

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

De neuromodulerende effecten van gefocusseerde echografie (FUS) zijn aangetoond in diermodellen en FUS is met succes gebruikt om bewegings- en psychiatrische stoornissen bij mensen te behandelen. Ondanks het succes van FUS blijft het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de effecten ervan op neuronen echter slecht begrepen, waardoor het moeilijk is om de behandeling te optimaliseren door FUS-parameters af te stemmen. Om deze lacune in kennis aan te pakken, hebben we menselijke neuronen in vitro bestudeerd met behulp van neuronen gekweekt uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (HiPSC's). Het gebruik van HiPSC's maakt het mogelijk om mensspecifiek neuronaal gedrag te bestuderen in zowel fysiologische als pathologische toestanden. Dit rapport presenteert een protocol voor het gebruik van een high-throughput systeem dat de monitoring en kwantificering van de neuromodulerende effecten van FUS op HiPSC-neuronen mogelijk maakt. Door de FUS-parameters te variëren en de HiPSC-neuronen te manipuleren door middel van farmaceutische en genetische modificaties, kunnen onderzoekers de neurale reacties evalueren en de neuromodulerende effecten van FUS op HiPSC-neuronen ophelderen. Dit onderzoek kan belangrijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van veilige en effectieve op FUS gebaseerde therapieën voor een reeks neurologische en psychiatrische aandoeningen.

Samengevat presenteren we een protocol dat in vitro FUS-neuromodulatiemonitoring mogelijk maakt met behulp van neuronen gekweekt uit HiPSC's. Het algemene systeemplatform om HiPSC-geïnduceerde neuronen te stimuleren en de bijbehorende elektrische reacties voor analyse vast te leggen, wordt geschetst in figuur 1. Deze studie richt zich op de FUS-stimulatie van neuronen en het registreren van de elektrische reacties in een MEA-systeem, zoals weergegeven in figuur 2. De randcomponenten van de FUS- en MEA-systemen en hun aansluitingen worden geïllustreerd in figuur 3.
De karakterisering van het brandpunt wordt uitgevoerd voorafgaand aan de neuronale experimenten om ervoor te zorgen dat de bodem van de put volledig wordt bedekt door het FUS-brandpunt. De visualisatie van het brandpunt op thermochrome platen, zoals weergegeven in figuur 4, moet worden uitgevoerd om het FUS-systeem te evalueren. Na de karakterisering van de brandpuntsafstand moeten de nabewerkingsstappen, waaronder filteren, drempelwaarden en het berekenen van de vuursnelheid, worden uitgevoerd, en deze worden samengevat in figuur 5 en figuur 6. Deze stappen zijn essentieel om bruikbare signalen op te halen door ruis uit de omgeving te filteren en zo inzicht te krijgen in de neuronale activiteitsveranderingen veroorzaakt door FUS. De rasterplots in figuur 6A-B tonen de gedetecteerde pieken in elk kanaal. Aangezien de gehele bodem van de put zich binnen het brandpunt van de FUS-transducer bevindt, wordt verwacht dat de FUS de vuursnelheid over alle elektroden zal veranderen. Deze verandering in vuursnelheid wordt gevisualiseerd in de vuursnelheidsgrafiek in figuur 6C, die laat zien dat de gekozen stimulatieparameters resulteerden in een toename van de neuronale vuursnelheid. In het bijzonder was de vurende valtijd vóór de FUS (d.w.z. baseline) 140 Hz ± 116,7 Hz, terwijl de afvuursnelheid na de FUS 786 Hz ± 419,4 Hz was met FUS met continue golven. Bovendien laat figuur 6C zien hoe het wijzigen van de FUS-parameters (bijv. het gebruik van gepulseerde golf FUS in plaats van continue golf) de omvang van de verandering in de vuursnelheid kan veranderen, evenals de hoeveelheid tijd voordat de neuronen terugkeren naar hun basistoestand. Gefocusseerde echografie met lage intensiteit (LIFU) veroorzaakt geen significante opwarming van culturen, vooral in vergelijking met gefocuste echografie met hoge intensiteit, die bedoeld is om thermische laesie te bereiken. Het ontbreken van klinisch impactvolle temperatuurverandering wordt ondersteund door theoretische berekeningen en simulaties (aanvullende figuur 2). Zelfs in extreme gevallen van de experimentele FUS-parameters die in tabel 1 zijn vermeld, kon slechts een minimale temperatuurstijging van ongeveer 0,04 °C worden waargenomen.
Het gebruik van een vuursnelheidsgrafiek maakt het mogelijk om de neuromodulerende effecten van FUS te kwantificeren en kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen exciterende en remmende reacties. Een belangrijk voordeel van de multi-well MEA-plaat is dat deze meerdere keren kan worden hergebruikt om verschillende neuronale toestanden en stimulatieparameters op een high-throughput manier te bestuderen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van het in vitro platform voor de gefocusseerde echografie (FUS) neuromodulatie van neuronen in een putje en de meting van hun neuronale activiteit met behulp van een micro-elektrode-array. Elke elektrode (rode, groene en blauwe lijnen) registreert van een populatie neuronen in een enkele put. Er wordt een verwerkingspijplijn geïmplementeerd om de ruwe neuronale elektrische opnames om te zetten in de detectie van neuronale vuurpatronen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig02.jpg"> Figuur 2: FUS-neuromodulatie met een multi-well micro-elektrode-array (MEA). (A) Schema van de opstelling voor FUS-neuromodulatie met een multi-well MEA. De akoestische golven die door de FUS-transducer worden gegenereerd, planten zich voort door een FUS-kegel gevuld met ontgast water en worden gekoppeld met behulp van ultrasone gel. De parafilm wordt met een elastiekje aan de put bevestigd om besmetting te voorkomen. De MEA-plaat stuurt elektrische opnames van de neuronen naar het MEA-systeem. (B) Een foto van de FUS-transducer op de multiwell-plaat in het MEA-systeem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig03.jpg"> Figuur 3: In-vitroplatformopstelling . (A) De voorkant van het in-vitroplatform . Het uitgangsvermogen van de transducer (TPO; links) wordt gebruikt om de FUS-parameters te programmeren. Het MEA-systeem (rechts) registreert de elektrische activiteit van de neuronen in de putplaat, die neuromodulair worden gemoduleerd door de FUS-transducer. (B) De achterkant van de opstelling van het in-vitroplatform met aansluitingen van het matchingnetwerk (1) naar de TPO en (2) naar de transducer. (3) De verbinding van het MEA-systeem naar de TPO synchroniseert de data-acquisitie. (4) De verbinding van het MEA-systeem met de computer voor gegevensoverdracht. (5) De stroomaansluiting op het MEA-systeem. (6) De stroomaansluiting op het FUS-systeem. (7) De sonicatieknop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig04v2.jpg"> Figuur 4: Karakterisering van de FUS-transducer. (A) Een drukkaart van het brandpunt met behulp van de FUS-parameters in tabel 1 , gemeten met het AMPLITUDE-systeem15. (B) Pre- en post-sonicatie van een thermochrome plaat die op de bodem van een put wordt geplaatst met behulp van de experimentele opstelling in figuur 3. Het thermochrome vel verandert van kleur als reactie op temperatuurveranderingen, wat zorgt voor een visuele validatie van succesvolle stimulatie op de locatie van de neuronen. De maximale gemiddelde intensiteit van de ruimtelijke-piekpuls (ISPPA) van 30 W/cm2 en continue sonicatie van 3 minuten werden aangepast om de lokale temperatuur drastisch te veranderen voor een betere visualisatie van een dergelijk brandpunt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig04largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig05.jpg"> Figuur 5: Verwerkingspijplijn. Stap 1: Ruwe elektrische opnames worden vastgelegd van N = 16 kanalen. De volgende stappen tonen het proces met behulp van kanaal 16 (rood omlijnd). Stap 2: Voor elk kanaal wordt een Butterworth-banddoorlaatfilter (5 Hz tot 3 kHz banddoorlaat) toegepast, gevolgd door een Gaussiaans filter (σ = 3). Een drempel wordt ingesteld op vijf keer de standaarddeviatie van het signaal binnen een venster van 2 s gecentreerd aan het begin van de sonicatie. Stap 3: Signalen boven of onder de drempel worden gekenmerkt als pieken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig06.jpg"> Figuur 6: Raster- en vuursnelheidsgrafieken. (A) Rasterdiagram van de gedetecteerde pieken op elk kanaal als functie van de sonicatietijd. Het tijdstip van FUS-stimulatie wordt geannoteerd met een rode lijn. (B) Rasterplot van neuronen onder verschillende FUS-instellingen met continue FUS ter vergelijking. (C) De vuursnelheid werd berekend met behulp van een schuifvenster van 50 ms. De gemiddelde vuursnelheden voor en na FUS-neuromodulaties waren respectievelijk 140 Hz en 786 Hz. Met gepulseerde FUS waren de gemiddelde vuursnelheden 230 Hz en 540 Hz. Er werd waargenomen dat een kortere activering en minder snelheidsverandering werden geïnduceerd door deze reeks verschillende FUS-stimulatie. Het proces voor de berekening van de stooksnelheid wordt beschreven in aanvullende figuur 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>Waarde</td>
		</tr><tr><td>Max. vermogen/ch.</td>
			<td>1.200 W</td>
		</tr><tr><td>Pactueel</td>
			<td>0,749 W/kanaal.</td>
		</tr><tr><td>IkSPPA</td>
			<td>10,79 W/cm2</td>
		</tr><tr><td>IkSPTA</td>
			<td>0,05 B/cm2</td>
		</tr><tr><td>Burst Lengte</td>
			<td>0,100 ms</td>
		</tr><tr><td>Frequentie</td>
			<td>250,00 kHz</td>
		</tr><tr><td>Focus</td>
			<td>39.800 mm</td>
		</tr><tr><td>Periode</td>
			<td>20.000 ms</td>
		</tr><tr><td>Timer</td>
			<td>60.000 s</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Parameters voor gefocusseerde echografie (FUS) ingesteld op de TPO voor het onderzoek gepresenteerd in figuur 4.
Aanvullende figuur 1: Verwerking van de rasterplot tot de stooksnelheid. Stap 1: Tel de pieken over alle kanalen om het telnummer binnen een bepaald schuifvenster te verkrijgen. Opmerking: Hier is gekozen voor een groter schuifvenster (ingesteld op 0,1 s) voor een betere illustratie. Stap 2: Converteer de pieken per vensterlengte naar pieken per seconde (vermenigvuldig hier bijvoorbeeld de tellingen met 10 om te converteren naar hertz [Hz] en deel vervolgens door 1.000 om de waarde in kilohertz [kHz] te verkrijgen). Stap 3: De als resultaat verkregen vuursnelheidscurve. Een open-source toolkit, samen met gesamplede gegevens, is beschikbaar op GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: K-golf simulatie resultaat temperatuurprofiel van LIFU16. Op basis van de akoestische intensiteitskaart in figuur 4 suggereert het resultaat van de K-golfsimulatie een maximale temperatuurstijging van 0,04 °C binnen het middengebied van de brandpuntszone (straal: 2 mm) met behulp van het extreme geval van de experimentele FUS-parameters vermeld in tabel 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig2.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van een high-throughput systeem dat de monitoring en kwantificering van de neuromodulerende effecten van gefocusseerde echografie op door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (HiPSC) neuronen mogelijk maakt.

Gefocusseerde ultrasone neuromodulatie van menselijke in vitro neurale culturen in multi-well micro-elektrode-arrays

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

Gefocusseerde ultrasone neuromodulatie. Dit opkomende opwindende veld is een onderwerp van lopende studies Op het gebied van gerichte echografie zijn de optimale stimulatieparameters voor een bepaalde toepassing vaak onbekend. Deze studie is gericht op een systematische bepaling van deze parameters door middel van empirische in vitro testen op neuronen.Deze methode kan het neuronale mechanisme onderzoeken dat ten grondslag ligt aan de focus van resound-neuromodulatie door onderzoekers in staat te stellen de reacties van genetisch en farmaceutisch gemodificeerde neuronen te analyseren. Om te beginnen zuigt u het kweekmedium op om een enkel putje te vullen in een neuronenkweekplaat met 24 putjes, met ingebedde micro-elektrode-arrays of MEA. Na het bereiden van 300 milliliter ontgast en gedeïoniseerd water, vult u het voorzichtig in de gefocusseerde ultrasone of FUS-transducerkegel.Gebruik een op maat gemaakte draadstang om de 3D-geprinte houder aan een frame te bevestigen. Plaats het frame zo dat de kop van de FUS-transducer zich boven het te stimuleren putje bevindt. Gebruik een elastiekje om de paraform over het putje te bevestigen op de MEA-plaat met 24 putjes die het medium en de door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen of HIPSC's bevat.Stel de FUS-parameters in op het uitgangsvermogen van de transducer of het TPO-bedieningspaneel. De waarden van de verschillende parameters worden op het scherm vermeld. Breng vervolgens koppelingsgel aan bovenop de paraform over de put en laat de FUS-transducer in de koppelingsgel zakken en zorg ervoor dat er contact is met de gel met minimale luchtbellen.Start de FUS-sonicatie door op de knop rechtsonder op de TPO te drukken en wacht ten minste vijf minuten tussen elke sonicatieronde om de neuronen terug te laten keren naar een basislijntoestand. Als de verbinding geschikt is, zal de triggerpuls die door het FUS-systeem wordt gegenereerd, de FUS-stimulatiesequentie automatisch afstemmen op de MEA-opname. Analyseer het signaal door de FUS-sonicatietijd af te lezen met de overdrachtsgegevens op basis van de verandering in de vuursnelheid die aan de FUS is gekoppeld.De FUS-brandpuntsafstand werd gekarakteriseerd door deze zowel te visualiseren op thermochromatische platen als door middel van hydrofoonscannen met water. Nabewerkingsstappen, waaronder filteren, drempelwaarden en het berekenen van de vuursnelheid, filterden de ruis uit de omgeving om de neuronale activiteitsveranderingen veroorzaakt door FUS te onthullen. De rasterplots toonden de gedetecteerde pieken in elk kanaal.De grafiek van de vuursnelheid toonde aan dat de gekozen stimulatieparameters de neuronale vuursnelheid verhoogden. De vurigheidssnelheid vóór de FUS was 140 hertz, terwijl de afvuursnelheid na de FUS 786 hertz was met een continue golf van FUS. Het wijzigen van de FUS-sonicatiemodus veranderde ook de hoeveelheid tijd voordat de neuronen terugkeren naar hun basistoestand.Het is van cruciaal belang om de vorming van luchtbellen zorgvuldig te minimaliseren bij het plaatsen van de transducer op de paraform-interface. Een andere overweging is het elektrische vermogen dat aan de transducer wordt geleverd. Het vermogen moet hoog genoeg zijn om een effect te veroorzaken, maar moet laag genoeg zijn om geen transducer- of celbeschadiging te veroorzaken.Deze techniek zou de optimale stimulatieparameter kunnen identificeren voor de behandeling van de ziekte van Parkinson en andere neurologische aandoeningen, waardoor het risico van de invasieve chirurgie, waaronder onomkeerbare schade, langdurig herstel en revalidatietijd, wordt geëlimineerd. Verdere inspanningen om het mechanisme ervan bloot te leggen en preklinische optimalisatie te beheersen, zijn nodig om de veiligheid in toekomstige studies, inclusief klinische proeven, te waarborgen.

focused-ultrasound-neuromodulation-human-vitro-neural-cultures-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol biedt de nodige informatie voor het opzetten, zorg voor, opname van en elektrisch stimuleren van culturen op MMO's.

Hoe te Cultuur, Record en het stimuleren van neuronale netwerken op de Micro-elektrode arrays (MEA&#39;s)

The video demonstrates how to use a microelectrode array (MEA) to record the electrophysiological activity of neurons derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Electrophysiological activity from a multiwell MEA containing a neuron-astrocyte co-culture is recorded to detect action potentials from multiple neurons in the network, confirming the successful differentiation of hiPSCs into neurons.

Measuring the Electrophysiological Activity of Neuronal Networks Using Micro-Electrode Arrays

This video demonstrates the procedure of using the multielectrode array (MEA) to measure synaptic physiology in 3D coculture spheres. This method allows to understand the neural network dynamics and synaptic network burst activity within the 3D spheres.

Utilizing Multielectrode Arrays to Measure Synaptic Physiology in 3D Coculture Spheres

This video demonstrates the method for inducing the modulation of neural activity in cultured human iPSC-derived neurons in a multi-well microelectrode array, or MEA system using a focused ultrasound transducer.

Ultrasound-Induced Neuromodulation Using a Microelectrode Array System

In dit werk wordt een nieuw experimenteel model gepresenteerd waarin 3D neuronale culturen gekoppeld zijn aan vlakke Micro-Elektrode Array's (MEA's). 3D netwerken worden gebouwd door neuronen te zaaien in een schaal gemaakt van glazen microbeads waarop neuronen groeien en onderling verbonden 3D structuren vormen.

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

We illustreren hoe u opnemen en elektrische modulatie van 4-aminopyridine-geïnduceerde epileptiform activiteit in knaagdier hersenen segmenten met behulp van micro-elektrode arrays. Een aangepaste opname-kamer onderhoudt weefsel levensvatbaarheid in langdurige experimentele sessies. Leven van de elektrode toewijzing en selectie van stimulerende paren worden uitgevoerd door een aangepaste grafische gebruikersinterface.

Opname en moduleren van Epileptiform activiteit in knaagdier hersenen plakjes gekoppeld aan micro-elektrode Arrays

Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.

Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering

Hier gebruiken we HD-MEA om ons te verdiepen in de computationele dynamica van grootschalige neuronale ensembles, met name in hippocampussen, olfactoriusbolcircuits en menselijke neuronale netwerken. Het vastleggen van spatiotemporele activiteit, gecombineerd met computationele tools, geeft inzicht in de complexiteit van neuronale ensembles. De methode verbetert het begrip van hersenfuncties en identificeert mogelijk biomarkers en behandelingen voor neurologische aandoeningen.

Vastleggen en analyseren van multimodale grootschalige neuronale ensembledynamiek op CMOS-geïntegreerde micro-elektrode-array met hoge dichtheid

Het protocol omvat de productie van transducers, parameterrapportage, chirurgische ingrepen en signaalregistratie voor de volledige operationele workflow van gelijktijdige gefocusseerde ultrasone neuromodulatie en vezelfotometrie-opname bij vrij bewegende muizen.

Gelijktijdige gefocusseerde ultrasone neuromodulatie en opname van vezelfotometrie in vrij bewegende muizen

Dit protocol heeft tot doel dorsaal-ventrale gefuseerde assembloids stabiel te plaatsen op multi-elektrode-arrays voor het modelleren van epilepsie in vitro.

Een multi-elektrode array platform voor het modelleren van epilepsie met behulp van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide hersenassemboïden

Hier presenteren we twee protocollen voor de registratie van micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μEcoG) bij ratten en muizen, inclusief chirurgische, implantatie- en registratiemethoden. μECoG-opnames worden uitgevoerd in combinatie met laminaire polytrode-opname in de auditieve cortex van de rat of met optogenetische manipulatie van neurale activiteit in de somatosensorische cortex van de muis.

Multischaalonderzoek van corticale verwerking door integratie van laminaire polytrodes en optogenetica met micro-elektrocorticografie bij knaagdieren

Leer gefocusseerde ultrasone neuromodulatie van menselijke iPSC-neuronen in multi-well micro-elektrode-arrays. Dit protocol optimaliseert stimulatieparameters voor niet-invasieve behandeling van neurologische aandoeningen.

Gefocusseerde ultrasone neuromodulatie van menselijke in vitro neurale culturen in multi-well micro-elektrode-arrays

Meer video's verkennen