Name: In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Leer in situ beeldvorming van de thymus met 2-fotonenmicroscopie bij muizen. Deze methode maakt visualisatie van celmigratie en T-celselectieprocessen mogelijk voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Matt Paul en Jimmy Wu voor technische bijstand.

Adoptieve overdracht Injecteren neonaten met 50-100ul van beenmerg met behulp van een insuline spuit 2-4 keer tijdens de eerste 3-7 dagen van het leven, met een uiteindelijke donor-to-host-verhouding van 1:1. Streven naar een injectie onder het borstbeen en ribbenkast, maar boven de darmen en maag. Steek de naald ver genoeg om het buikvlies, Pas op dat u doorboren het membraan dringen. Het is niet ongewoon dat een deel van het beenmerg om verloren tijdens de injectie. U kunt het verlies door het losdraaien van uw grip op de pup als je zo injecteren zijn dat de huid uit te breiden en, vervolgens, langzaam het verwijderen van de naald. Dissectie van Thymus Maak een incisie door de middellijn en het knippen of afscheuren van de huid aan de ribbenkast te onthullen. Houd vast aan het borstbeen en snijd door het buikvlies en het middenrif. Knip de zijkanten van de ribbenkast naar de borstholte te onthullen. De thymus ligt op de top van het hart. Dus als de structuur van de thymus te bewaren, vasthouden aan het omliggende weefsel als je ontleden de thymus. Spoel de zwezerik met PBS te houden tegen uitdroging tijdens de dissectie. Zachtjes weg te pesten overtollige weefsel op het oppervlak van de thymus capsule en halveren de twee lobben. Voorbereiden Tissue for Imaging Gebruik veterinaire weefsel lijm op lijm van de thymus nee tegen een vierkant dekglaasje aan. Gebruik een pipetteman tot een fractie van een microliter van lijm te zetten. Verspreid de lijm aan de lengte en de breedte van de thymus. Steady de thymus tegen het dekglaasje en sleep deze op zijn plaats. Two-Photon Imaging Het weefsel is ondergedompeld in DMEM zonder fenol rood dat is geperfuseerd met 95% zuurstof en 5% kooldioxide en verwarmd tot 37 ° C. Twee-foton excitatie werd bereikt met behulp van een Spectra-Physics Maitai laser afgestemd op 900nm, en CFP, GFP, YFP en Texas Red-emissie licht was gescheiden met behulp van een 495, 515, 560 dichroïsche spiegels en verzameld met behulp van PMT detectoren.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Twee-foton beeldvorming in de thymus stelt ons in staat om na te gaan in het leven, intacte organen de interacties en migraties die selectie ten grondslag liggen aan gebeurtenissen in de thymus.

in situ beeldvorming van de muis thymus met behulp van 2-photon microscopie

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Twee-foton microscopie (TPM) stelt ons in staat om de afbeelding diep in de thymus en document de gebeurtenissen die belangrijk zijn voor thymocyt ontwikkeling. Het volgen van de migratie van individuen in een menigte van thymocyten, genereren we neonatale hersenschimmen, waar minder dan een procent van de thymocyten zijn afgeleid van een donor die transgeen voor een rode draad te drukken fluorescerend eiwit. Voor het genereren van deze gedeeltelijke hematopoëtische hersenschimmen, zijn neonatale ontvangers geïnjecteerd met beenmerg tussen de 3-7 dagen oud zijn. Na 4-6 weken, wordt de muis gedood en de thymus wordt zorgvuldig ontleed en bissected het behoud van de architectuur van het weefsel dat zal worden afgebeeld. De thymus is gelijmd op een dekglaasje aan ter voorbereiding van ex vivo beeldvorming van TPM. Tijdens beeldvorming van de thymus wordt gehouden in DMEM zonder fenol rood dat is geperfuseerd met 95% zuurstof en 5% kooldioxide en verwarmd tot 37 ° C. Met deze aanpak kunnen we bestuderen de gebeurtenissen die nodig zijn voor het genereren van een divers T-cel repertoire.

We presenteren stap-voor-stap instructies voor het genereren van neonatale hersenschimmen, alsmede de dissectie en voorbereiding van de thymus voor ex vivo beeldvorming door 2-Photon Microscopie.

In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie

Tweefotonmicroscopie (TPM) stelt ons in staat om diep in de thymus te beelden en de gebeurtenissen te documenteren die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van thymocyten. Om de ...

Tweefoton-imaging is nuttig voor de immunologie omdat het ons in staat stelt de migratie van een enkele cel te volgen terwijl deze in contact komt met zijn omgeving. Door de migratie naar de thymuslocatie te volgen met behulp van tweefotonmicroscopie, kunnen we het mechanisme van positieve en negatieve selectie karakteriseren.Hallo, ik ben Ina Lottie van het laboratorium van Dr. Ellen Roby aan de University of California in Berkeley. En ik ben Paul Herzmark, ook van het lab van Ellen Roby. Vandaag gaan we laten zien hoe we in situ imaging van thymusweefsel uitvoeren, en ik zal laten zien hoe we onze tweefotonenmicroscoop kunnen gebruiken om de thymus in beeld te brengen.En ik zal u de stappen laten zien die voorafgaan aan de tweefoton-beeldvorming. Dit omvat de volgende procedures: het isoleren van hematopoëtische stamcellen uit het beenmerg, de adoptieve transfer van beenmergcellen naar neonaten, de dissectie en bisectie van de thymus, en het voorbereiden van het weefsel voor beeldvorming via tweefoton-laserscannende microscopie. Laten we beginnen.Voordat we de thymus kunnen prepareren voor beeldvorming, moeten we eerst beenmergcellen adoptief overdragen naar een neonatale muis. Deze beenmergcellen werden geïsoleerd uit de achterpoten van transgene muizen die GFP ubiquitair tot expressie brengen. Dit is een insulinespuit met 50 µL beenmerg.We dienen twee tot vier injecties toe aan gasten die drie tot zeven dagen oud zijn, waarbij beenmerg van één donor wordt gebruikt voor elke geïnjecteerde pup. Hier hebben we een pup van vijf dagen oud; knijp de huid terug om te voorkomen dat de pup tijdens de injectie beweegt en om de huid gespannen te houden. Richt op een injectieplaats die zich onder de longen en de ribbenkast bevindt, maar boven de darmen en de maag.Ontspan uw grip op de huid tijdens het injecteren, zodat deze kan uitzetten. Verwijder tot slot de spuit langzaam om het verlies van beenmerg te beperken. De muizen krijgen vier tot zes weken de tijd om zich te ontwikkelen, waarna de thymus kan worden verwijderd voor beeldvorming.Na vier tot zes weken kan de thymus worden verwijderd. Voor de beeldvorming gebruik ik een set grote pincetten en scharen, evenals een set kleine pincetten en scharen. Deze muis is geofferd in overeenstemming met ons protocol voor diergebruik en is besproeid met ethanol.Ik gebruik de grote pincet om de huid vast te pakken en maak een incisie in de middellijn. Nu kan ik de schaar gebruiken om langs de middellijn te knippen, of ik kan de huid van het peritoneum scheuren; ik zal de huid vastpinnen om de borstholte bloot te leggen. Ik gebruik het sternum als houvast terwijl ik door het peritoneum snijd en via het diafragma de borstholte binnenga, om vervolgens langs de zijkanten van de ribbenkast te knippen.En u kunt de thymus zien die direct bovenop het hart ligt. Ik zal ze terugplaatsen. Dus dat is de thymus.Ik ga voorkomen dat ik het aanraak. Gebruik de kleinere pincet en houd het weefsel rondom de thymus vast. Oké, nu ga ik het besproeien met wat PBS en begin ik het overtollige weefsel te verwijderen.Ik zal het weefsel rondom de thymus gebruiken om deze vast te houden. Tijdens het schoonmaken van de thymus zal ik het overtollige weefsel voorzichtig wegsnijden. De thymus bestaat uit twee lobben die we tijdens het schoonmaken ook van elkaar moeten scheiden.Maar eerst ga ik al deze extra bloedvaten verwijderen die op het oppervlak van de thymus liggen. Ik ben zeer voorzichtig om de architectuur van de thymus, die we gaan afbeelden, niet te verstoren. Daarom verwijder ik alleen weefsel dat zich direct aan het oppervlak bevindt.Nu ga ik voorzichtig de twee lobben scheiden. Dit zijn de ventrale lob en de dorsale lob die we gaan scheiden door het weefsel voorzichtig door te snijden en ze uit elkaar te manoeuvreren. We willen niet dat het weefsel uitdroogt, dus we spuiten er een beetje PBS op.Nu heb ik de twee lobben gescheiden. Dit is de dorsale lob, die een kenmerkende gitaarvorm heeft. En dit is hier de ventrale lob.Ik ga het overtollige weefsel van elk van deze lobben verwijderen, zodat het beeldvormingsgebied vrij is van extra weefsel. Ik laat echter een klein beetje weefsel zitten zodat we de lobben vast kunnen houden. Tijdens de beeldvorming zouden we door dit overtollige weefsel heen kijken, wat eigenlijk niet nodig is; door het te verwijderen verbeteren we de beeldkwaliteit.Nu hebben we onze twee in tweeën gedeelde lobben die klaar zijn om op een dekglas te worden gemonteerd voor beeldvorming. Om de gedeelde thymus voor te bereiden voor beeldvorming, heeft u veterinair weefsellijm en dekglazen van 18 bij 18 mm nodig. Ik gebruik bij voorkeur een micropipet om een fractie van een microliter lijm op het dekglas aan te brengen.Ik breng een druppel lijm aan met een lengte die ongeveer gelijk is aan die van de thymus die we gaan afbeelden. Vervolgens verspreid ik de lijm. Als de lijm de breedte van de thymus heeft, plaats ik beide lobben op hetzelfde dekglas.Ik ga er nu nog een hier plaatsen. Ik pak de lob uit het overtollige weefsel, leg deze op het dekglas en sleep deze vervolgens naar het gebied met de lijm. Ik doe hetzelfde voor de andere lob; opnieuw raak ik het dekglas aan op een plek zonder lijm om mijn hand te stabiliseren en leg ik daarna de andere thymuskwab op het dekglas.Nu we beide thymusbolletjes aan het dekglas hebben bevestigd, geven we het door aan Paul voor de beeldvorming. Bedankt Ina. Laten we dit monster nemen en in het DME-medium plaatsen dat we voor de beeldvorming gaan gebruiken.Dit is onze opstelling voor tweefotonmicroscopie. Tweefotonmicroscopie is zeer geschikt voor het in beeld brengen van immuuncellen, omdat u diep in de thymus kunt kijken en de fluorescerende cellen kunt zien bewegen. Er wordt gebruikgemaakt van een gepulste infraroodlaser om de cellen te laten fluoresceren.Onze microscoop is uitgerust met vier verschillende camera's waarmee we vier verschillende kleuren gelijktijdig kunnen visualiseren, en maakt gebruik van een speciale objectieflens met een 20 x vergroting. Dit is een speciale lens die in het DMEM-medium wordt gedoopt waarin we de thymus hebben ondergedompeld; dit maakt een 0,95 na mogelijk, wat zeer gunstig is en onze cellen zeer helder maakt. Om het weefsel gezond te houden, leiden we 95% zuurstof en 5% CO2 door het DMEM-medium.Van daaruit wordt het gepompt naar de perfusiekamer waar het wordt verwarmd tot 37 °C, en dat is waar de thymuslobben in zijn ondergedompeld. Met dit systeem kunnen we de cellen in de thymus gedurende vier uur beeldvorming gezond houden. Ik heb u nu laten zien hoe u de beeldvorming voor de tweefotonenmicroscoop instelt.Laten we nu kijken naar enkele van onze resultaten in deze herhalende video. Hier kunt u de thymus zien die we in vier verschillende kleuren hebben afgebeeld. De rode delen zijn bloedvaten uit de thymus en de gele delen zijn dendritische cellen van de gastheer die geel fluorescent eiwit tot expressie brengen onder controle van een promoter die specifiek is voor dendritische cellen.De blauwe en groene thymocyten die u hier ziet, zijn afkomstig van twee verschillende donoren die we gebruiken om een neonatale chimeera te maken met behulp van een adoptieve transfertechniek die Ena u eerder heeft laten zien. De groene cellen zijn thymocyten die groen fluorescerend proteïne tot expressie brengen, en de blauwe cellen zijn thymocyten van de donor die cyaan fluorescerend proteïne tot expressie bracht. Dit is dezelfde herhalende video die ik u eerder heb laten zien, maar ik wil u de driedimensionaliteit tonen van de datasets die we verzamelen om deze video's te maken.We stellen scherp op een vlak en maken een afbeelding, waarna we iets dieper scherpstellen en een volgende afbeelding maken, en vervolgens weer iets dieper voor een andere afbeelding. Voor deze film zijn we ongeveer 60 microns naar beneden gegaan, waarna we dit volume aan afbeeldingen ongeveer elke 30 seconden hebben herhaald om het bewegende volume vast te leggen. Deze film is over een periode van ongeveer 20 minuten opgenomen.Hierdoor kunnen we de cellen over een tijdsbestek in drie dimensies volgen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe we de thymus visualiseren met behulp van twee-fotonmicroscopie. De belangrijkste aspecten van deze procedure zijn: ten eerste, het injecteren van de neonaten met beenmerg van donoren.Ten tweede, het dissecteren van de thymus zonder de structuur te beschadigen. Ten derde, het stevig bevestigen van de thymus aan een dekglas voor beeldvorming met een tweefotonmicroscoop. Beeldvorming in de thymus kan vele vragen beantwoorden over de ontwikkeling van thymocyten en de generatie van een divers T-celrepertoire.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Twee-foton beeldvorming heeft blootgelegd lymfocyten beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en gedurende een immuunrespons 1. Hier laten we zien adoptieve overdracht van T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de geëxplanteerd lymfeklier.

Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

We hebben nieuwe laboratorium instrumenten en protocollen voor intravitale imaging verkrijging van thymus. Onze techniek zou moeten helpen bij de identificatie van 'niches' in de thymus, waar T-cel ontwikkeling optreedt.

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Het doel van het protocol is te tonen longitudinale intravital real-time tracking van thymocytes door laser scanning microscopie in serie implantaten in de voorste kamer van het oog van de muis. De transparantie van het hoornvlies en vascularisatie van de prothese zorgt voor de continu opname progenitor cel aanwerving en rijpe T-cel-uitgang.

Real-time In Vivo Tracking van Thymocytes in de voorste kamer van het oog door Laser Scanning Microscopie

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in...

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Het huidige protocol beschrijft een interventionele radiologieprocedure die is vastgesteld voor intrathymische injectie bij muizen om het risico van open chirurgie te vermijden en de nauwkeurigheid van blinde percutane injecties te verbeteren.

Een minimaal invasieve, nauwkeurige en efficiënte techniek voor intrathymische injectie bij muizen

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Deze studie presenteert een in vivo twee-foton beeldvormingsbenadering om de structuren van laag-drempel mechanoreceptor (LTMR) axonterminalen in de voorpoothuid van muizen te visualiseren. Met behulp van herhaalde, hoogresolutiebeeldvorming van individuele axonen biedt deze methode een nieuw platform voor het bestuderen van de structuur en functie van het cutane sensorische circuit tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen.

Intravitale tweefotonbeeldvorming van aanrakingssensorische axonmorfologie in muizenhuid

Leer in situ beeldvorming van de thymus met 2-fotonenmicroscopie bij muizen. Deze methode maakt visualisatie van celmigratie en T-celselectieprocessen mogelijk voor immunologisch onderzoek.

In situ beeldvorming van de muis Thymus Met behulp van 2-Photon Microscopie

Meer video's verkennen