Name: Sequencing van het hele genoom voor snelle karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Ontdek een kosteneffectieve workflow voor karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie. Deze methode ondersteunt lokale surveillance en helpt bij het identificeren van circulerende RABV-lijnages voor effectieve bestrijding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton-financiering van de Medical Research Council [MR/R025649/1] en het Filippijnse ministerie van Wetenschap en Technologie (DOST), de UK Research and Innovation Global effort on COVID-19 [MR/V035444/1], het University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], en International Partnership Development Fund, een DOST British Council-Philippines studentship (CB), een National Institute for Health Research [17/63/82] GemVi scholarship (GJ), en University of Glasgow studentships van de MVLS DTP (KC) [125638-06], de EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1], en de Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. We zijn de collega's en medewerkers die dit werk hebben gesteund dankbaar: Daniel Streicker, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Daria Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy Lushasi, Charles Kayuki, Jude Karlo Bolivar, Jeromir Bondoc, Esteven Balbin, Ronnel Tongohan, Agatha Ukande, Davis Kuchaka, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana en Anna Czupryna.

Een op nanoporie gebaseerde genomische benadering om hondsdolheid in lage-inkomenslanden te bestrijden

De auteurs hebben niets te onthullen.

Brunker et al.61 ontwikkelden een toegankelijke RABV, op nanoporiën gebaseerde, volledige genoomsequencing-workflow met behulp van bronnen van het ARTIC-netwerk46. Hier presenteren we een bijgewerkte workflow, met volledige stappen van monster naar sequentie naar interpretatie. De workflow beschrijft de voorbereiding van hersenweefselmonsters voor sequencing van het hele genoom, presenteert een bio-informaticapijplijn om lezingen te verwerken en consensussequenties te genereren, en belicht twee rabiës-specifieke tools om de toewijzing van afstammingslijnen te automatiseren en de fylogenetische context te bepalen. De bijgewerkte werkstroom biedt ook uitgebreide instructies voor het instellen van geschikte reken- en laboratoriumwerkruimten, met overwegingen voor implementatie in verschillende contexten (inclusief instellingen met weinig middelen). We hebben de succesvolle implementatie van de workflow aangetoond in zowel academische als onderzoeksinstellingen in vier RABV endemische LMIC's met geen of beperkte genomische surveillancecapaciteit. De workflow is veerkrachtig gebleken voor toepassing in verschillende omgevingen en begrijpelijk voor gebruikers met verschillende expertises.
Deze workflow voor RABV-sequencing is het meest uitgebreide openbaar beschikbare protocol (dat stappen van monster naar sequentie naar interpretatie omvat) en specifiek is aangepast om zowel de opstart- als de bedrijfskosten te verlagen. De tijd en kosten die nodig zijn voor de voorbereiding en sequencing van bibliotheken met nanoporietechnologie worden aanzienlijk verminderd in vergelijking met andere platforms, zoals Illumina61, en voortdurende technologische ontwikkelingen verbeteren de kwaliteit en nauwkeurigheid van de sequentie om vergelijkbaar te zijn met Illumina62.
Dit protocol is ontworpen om veerkrachtig te zijn in diverse contexten met weinig middelen. Door te verwijzen naar de richtlijnen voor probleemoplossing en wijzigingen die naast het kernprotocol worden gegeven, worden gebruikers ondersteund om de workflow aan hun behoeften aan te passen. De toevoeging van gebruiksvriendelijke bio-informaticatools aan de workflow vormt een belangrijke ontwikkeling ten opzichte van het oorspronkelijke protocol, omdat het snelle en gestandaardiseerde methoden biedt die kunnen worden toegepast door gebruikers met minimale eerdere bio-informatica-ervaring om sequentiegegevens in lokale contexten te interpreteren. De capaciteit om dit in situ te doen wordt vaak beperkt door de noodzaak om over specifieke programmeer- en fylogenetische vaardigheden te beschikken, die een intensieve en langdurige investering in vaardigheidstraining vereisen. Hoewel deze vaardigheden belangrijk zijn om sequentiegegevens grondig te interpreteren, zijn eenvoudige en toegankelijke interpretatietools even wenselijk om lokale "sequencing-kampioenen" te capaciteren, wier kernexpertise mogelijk op natte laboratoria is gebaseerd, waardoor ze hun gegevens kunnen interpreteren en er eigenaar van kunnen worden.
Aangezien het protocol al een aantal jaren in verschillende landen wordt toegepast, kunnen we nu richtlijnen geven voor het optimaliseren van multiplex-primerschema's om de dekking te verbeteren en om te gaan met geaccumuleerde diversiteit. Er zijn ook inspanningen geleverd om gebruikers te helpen de kosteneffectiviteit te verbeteren of om de aanschaf in een bepaalde regio te vergemakkelijken, wat doorgaans een uitdaging is voor de duurzaamheid van moleculaire benaderingen63. In Afrika (Tanzania, Kenia en Nigeria) hebben we bijvoorbeeld gekozen voor blunt/TA-ligase-mastermix bij de adapterligatiestap, die gemakkelijker verkrijgbaar was bij lokale leveranciers en een goedkoper alternatief was voor andere ligatiereagentia.
Uit ervaring blijkt dat er verschillende manieren zijn om de kosten per monster en per run te verlagen. Het verminderen van het aantal monsters per run (bijv. van 24 naar 12 samples) kan de levensduur van flowcellen over meerdere runs verlengen, terwijl het verhogen van het aantal monsters per run de tijd en reagentia maximaliseert. In onze handen waren we in staat om flowcellen te wassen en te hergebruiken voor één op de drie sequencing-runs, waardoor nog eens 55 monsters konden worden gesequenced. Door de flowcel direct na gebruik te wassen, of indien niet mogelijk, de afvalvloeistof na elke run uit het afvalkanaal te verwijderen, leek het aantal beschikbare poriën voor een tweede run te behouden. Rekening houdend met het aanvankelijke aantal poriën dat beschikbaar is in een stroomcel, kan één run ook worden geoptimaliseerd om te plannen hoeveel monsters in een bepaalde stroomcel moeten worden uitgevoerd.
Hoewel de workflow ernaar streeft zo uitgebreid mogelijk te zijn, met de toevoeging van gedetailleerde richtlijnen en bewegwijzerde bronnen, is de procedure nog steeds complex en kan het ontmoedigend zijn voor een nieuwe gebruiker. De gebruiker wordt aangemoedigd om persoonlijke training en ondersteuning te zoeken, idealiter lokaal, of anders via externe medewerkers. In de Filippijnen bijvoorbeeld heeft een project over capaciteitsopbouw binnen regionale laboratoria voor SARS-CoV-2-genomische surveillance met behulp van ONT kerncompetenties ontwikkeld onder diagnostici in de gezondheidszorg die gemakkelijk kunnen worden overgedragen op RABV-sequencing. Belangrijke stappen, zoals het opruimen van SPRI-parels, kunnen moeilijk onder de knie te krijgen zijn zonder praktische training, en ineffectief opruimen kan de stroomcel beschadigen en de run in gevaar brengen. Monsterbesmetting is altijd een groot probleem wanneer amplicons in het laboratorium worden verwerkt en kan moeilijk te elimineren zijn. Met name kruisbesmetting tussen monsters is uiterst moeilijk te detecteren tijdens bio-informatica na het uitvoeren van gegevens. Goede laboratoriumtechnieken en -praktijken, zoals het handhaven van schone werkoppervlakken, het scheiden van pre- en post-PCR-gebieden en het opnemen van negatieve controles, zijn absoluut noodzakelijk om kwaliteitscontrole te garanderen. Het snelle tempo van de ontwikkelingen op het gebied van nanoporiesequencing is zowel een voordeel als een nadeel voor routinematige RABV-genomische surveillance. De voortdurende verbeteringen aan de nauwkeurigheid, de toegankelijkheid, en het protocolrepertoire van nanopore verbreden en verbeteren het werkingsgebied voor zijn toepassing. Dezelfde ontwikkelingen maken het echter een uitdaging om standaard operationele procedures en bio-informaticapijplijnen te onderhouden. In dit protocol bieden we een document dat helpt bij de overgang van oudere naar huidige voorbereidingskits voor nanoporiebibliotheken (Tabel met materialen).
Een veel voorkomende hindernis voor sequencing in LMIC's is toegankelijkheid, waaronder niet alleen de kosten, maar ook de mogelijkheid om tijdig verbruiksartikelen aan te schaffen (met name sequencing-reagentia, die relatief nieuw zijn voor inkoopteams en leveranciers) en rekenkracht, evenals simpelweg toegang hebben tot stabiele stroom en internet. Het gebruik van draagbare nanoporie-sequencingtechnologie als basis van deze workflow helpt bij veel van deze toegankelijkheidsproblemen, en we hebben het gebruik van ons protocol in een reeks instellingen gedemonstreerd, waarbij we het volledige protocol en de analyse in het land hebben uitgevoerd. Toegegeven, het tijdig aanschaffen van apparatuur en het rangschikken van verbruiksartikelen blijft een uitdaging en in veel gevallen waren we genoodzaakt om reagentia uit het VK te vervoeren of te verzenden. In sommige gebieden konden we echter volledig vertrouwen op lokale aanvoerroutes voor reagentia, waarbij we profiteerden van investeringen in SARS-CoV-2-sequencing (bijv. de Filippijnen) die de inkoopprocessen hebben gestroomlijnd en een begin hebben gemaakt met het normaliseren van de toepassing van pathogene genomica.
De behoefte aan een stabiele internetverbinding wordt geminimaliseerd door eenmalige installaties; GitHub-repositories, softwaredownload en nanopore-sequencing zelf hebben bijvoorbeeld alleen internettoegang nodig om de run te starten (niet overal) of kunnen volledig offline worden uitgevoerd met toestemming van het bedrijf. Als er mobiele data beschikbaar is, kan een telefoon worden gebruikt als hotspot voor de laptop om de sequencing-run te starten, voordat de verbinding wordt verbroken voor de duur van de run. Bij het routinematig verwerken van monsters kunnen de vereisten voor gegevensopslag snel toenemen en idealiter worden gegevens op een server opgeslagen. Anders zijn solid state drive (SSD) harde schijven relatief goedkoop te verkrijgen.
Hoewel we erkennen dat er nog steeds belemmeringen zijn voor genomische surveillance in LMIC's, suggereert de toenemende investering in het opbouwen van toegankelijkheid en expertise op het gebied van genomica (bijv. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa BGA])64 dat deze situatie zal verbeteren. Genomische surveillance is van cruciaal belang voor pandemische paraatheid6, en capaciteit kan worden vastgesteld door de genomische surveillance van endemische pathogenen zoals RABV routinematig te maken. De wereldwijde verschillen in sequentiecapaciteit die tijdens de SARS-CoV-2-pandemie aan het licht zijn gekomen, zouden een katalysator moeten zijn voor katalytische verandering om deze structurele ongelijkheden aan te pakken.
Deze workflow van steekproef naar sequentie naar interpretatie voor RABV, inclusief toegankelijke bio-informaticatools, heeft het potentieel om te worden gebruikt als leidraad voor controlemaatregelen die gericht zijn op het doel van nul menselijke sterfgevallen door hondsgemedieerde hondsdolheid tegen 2030, en uiteindelijk voor de eliminatie van RABV-varianten. In combinatie met relevante metadata, maken genomische gegevens die uit dit protocol worden gegenereerd een snelle RABV-karakterisering mogelijk tijdens uitbraakonderzoeken en bij de identificatie van circulerende afstammingslijnen in een land of regio60,61,65. We illustreren onze pijplijn voornamelijk aan de hand van voorbeelden van hond-gemedieerde hondsdolheid; De workflow is echter direct toepasbaar op rabiës in het wild. Deze overdraagbaarheid en lage kosten minimaliseren de uitdagingen bij het gemakkelijk beschikbaar maken van routinematige sequencing, niet alleen voor hondsdolheid maar ook voor andere ziekteverwekkers46,66,67, om het ziektebeheer en de bestrijding te verbeteren.

Het rabiësvirus (RABV) is een lyssavirus uit de familie Rhabdoviridae dat een dodelijke neurologische aandoening veroorzaakt bijzoogdieren1. Hoewel hondsdolheid 100% te voorkomen is door vaccinatie, blijft het een groot probleem voor de volksgezondheid en de economie in endemische landen. Van de 60.000 menselijke sterfgevallen door hondsdolheid die naar schatting elk jaar voorkomen, bevindt meer dan 95% zich in Afrika en Azië, waar honden het primaire reservoir zijn. Daarentegen heeft hondenvaccinatie geleid tot de eliminatie van hondsdolheid in West-Europa, Noord-Amerika en een groot deel van Latijns-Amerika. In deze regio's zijn reservoirs van hondsdolheid nu beperkt tot dieren in het wild, zoals vleermuizen, wasberen, stinkdieren en wilde hondachtigen. In heel Latijns-Amerika is de gewone vampiervleermuis een problematische bron van hondsdolheid vanwege de regelmatige overdracht van vleermuizen naar zowel mensen als vee tijdens nachtelijkebloedvoeding. De jaarlijkse wereldwijde economische impact van hondsdolheid wordt geschat op $ 8,6 miljard, waarbij het verlies van vee goed is voor 6%5.
Sequentiegegevens van virale pathogenen in combinatie met metadata over de timing en bron van infecties kunnen robuuste epidemiologische inzichten opleveren6. Voor RABV is sequencing gebruikt om de oorsprong van uitbraken te onderzoeken7,8, gastheerassociaties met dieren in het wild of gedomesticeerde hondente identificeren 8,9,10,11,12 en bronnen van menselijke gevallen op te sporen 13,14. Uitbraakonderzoeken met behulp van fylogenetische analyse hebben aangetoond dat hondsdolheid is ontstaan in de voorheen rabiësvrije provincie Bali, Indonesië, door een enkele introductie uit de nabijgelegen endemische gebieden van Kalimantan of Sulawesi15. Ondertussen werd in de Filippijnen bewezen dat een uitbraak op het eiland Tablas, in de provincie Romblon, werd geïntroduceerd vanaf het hoofdeiland Luzon16. Virale genomische gegevens zijn ook gebruikt om een beter inzicht te krijgen in de dynamiek van de overdracht van pathogenen die nodig is om de bestrijdingsmaatregelen geografisch te richten. Genomische karakterisering van RABV illustreert bijvoorbeeld de geografische clustering van clades 17,18,19, co-circulatie van afstammingslijnen 20,21,22, mens-gemedieerde virale beweging 17,23,24 en metapopulatiedynamiek 25,26.
Ziektemonitoring is een belangrijke functie van genomische surveillance die is verbeterd met de wereldwijde toename van de sequencingcapaciteit als reactie op de SARS-CoV-2-pandemie. Genomische surveillance heeft de real-time tracking van zorgwekkende SARS-COV-2-varianten27,28 en de bijbehorende tegenmaatregelenondersteund 6. Vooruitgang in toegankelijke sequencingtechnologie, zoals nanopore-technologie, heeft geleid tot verbeterde en meer betaalbare protocollen voor de snelle sequencing van zowel menselijke 29,30,31,32 als dierlijke33,34,35 pathogenen. In veel landen waar rabiës endemisch is, zijn er echter nog steeds belemmeringen voor het operationaliseren van de genomische surveillance van pathogenen, zoals blijkt uit de wereldwijde verschillen in de sequentiecapaciteit van SARS-CoV-236. Beperkingen in laboratoriuminfrastructuur, toeleveringsketens en technische kennis maken het opzetten en routineren van genomische surveillance een uitdaging. In dit artikel laten we zien hoe een geoptimaliseerde, snelle en betaalbare workflow voor sequencing van het hele genoom kan worden ingezet voor RABV-surveillance in omgevingen met beperkte middelen.

<table><tbody><tr><td>Merknaam</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequencing software (MinKnow)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Bioinformatics tool kit (Guppy)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermische cycler (miniPCR&trade; mini16 thermische cycler)</td><td>Cambio</td><td>MP-QP-1016-01</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator (Precellys Evolution Touch Homogenisator)</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ02520-300</td><td></td></tr><tr><td>Koelrekken (0,2-0,5mL) (PCR Mini-koeler met transparant deksel)</td><td>BRAND&nbsp;</td><td>781260</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10030</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10024</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10020</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10025</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10021</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10026</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer (Qubit&nbsp; 4 Fluorometer)&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Laptop&nbsp; (Elk merk met ~2 GB schijfruimte, minimaal 512 GB opslagruimte, msi-installatieprogramma [GPU])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge (Gekoelde centrifuge)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>75004081</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer (Basis vortexmixer)&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>88882011</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisch rek (DynaMag -2 Magneet)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing-apparaat (MinION)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MinION Mk1B</td><td></td></tr><tr><td>RNA-extractie&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA-extractiekit (Qiagen RNEasy Mini Kit 250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>RNA stabiliserende reagentia&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(RNA later)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>(DNA/RNA Shield)</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-50</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water (Nuclease-vrij water [niet&nbsp; DEPC-behandeld])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Mastermix voor first strand cDNA-synthese (LunaScript RT SuperMix Kit)</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td><td></td></tr><tr><td>DNA-amplificatie mastermix (Q5&reg; Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Primer (schema) (Aangepaste DNA-oligo's)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI Bead Clean-up</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI-kralen (Aline Biosciences PCR Clean DX )</td><td>Cambio</td><td>AL-AC1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, puur absoluut, >99,8% (GC) [Riedel-De Haen]</td><td>Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>Short Fragment buffer (SFB-uitbreidingspakket)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-SFB001</td><td></td></tr><tr><td>DNA-kwantificering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-kwantificeringskit (Qubit&reg; dsDNA HS Assay Kit)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>DNA-kwantificeringsassaybuizen (Qubit&trade; Assay Tubes)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>End Prep en barcoden (Qubit&trade; Assay Tubes)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>End Prep mastermix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Barcodingkit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemistry 9&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Native Barcoding Expansion 1-12)</td><td></td><td>EXP-NBD104&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Native Barcoding Expansion 13-24)&nbsp;</td><td></td><td>EXP-NBD114&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Native Barcoding Expansion 96)</td><td></td><td>EXP-NBD196</td><td></td></tr><tr><td>*Chemistry 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 14</td><td></td></tr><tr><td>(niet compatibel)&nbsp;</td><td></td><td>(niet compatibel)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Native Barcoding Kit 24 V14)</

sequencing van het hele genoom voor snelle karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomische gegevens kunnen worden gebruikt om de overdracht en geografische verspreiding van infectieziekten te volgen. De sequencingcapaciteit die nodig is voor genomische surveillance blijft echter beperkt in veel lage- en middeninkomenslanden (LMIC's), waar hondsdolheid en/of hondsdolheid die wordt overgedragen door dieren in het wild, zoals vampiervleermuizen, grote zorgen voor de volksgezondheid en de economie vormen. We presenteren hier een snelle en betaalbare sample-to-sequence-to-interpretation workflow met behulp van nanopore-technologie. Protocollen voor monsterafname en de diagnose van rabiës worden kort beschreven, gevolgd door details van de geoptimaliseerde sequencing-workflow voor het hele genoom, inclusief primerontwerp en optimalisatie voor multiplex polymerasekettingreactie (PCR), een aangepaste, goedkope sequencing-bibliotheekvoorbereiding, sequencing met live en offline base-calling, genetische afstammingsaanduiding en fylogenetische analyse. De implementatie van de workflow wordt gedemonstreerd en kritieke stappen voor lokale implementatie worden benadrukt, zoals pijplijnvalidatie, primeroptimalisatie, opname van negatieve controles en het gebruik van openbaar beschikbare gegevens en genomische tools (GLUE, MADDOG) voor classificatie en plaatsing binnen regionale en wereldwijde fylogenieën. De doorlooptijd voor de workflow is 2-3 dagen en de kosten variëren van $ 25 per monster voor een run van 96 samples tot $ 80 per sample voor een run van 12 samples. We concluderen dat het opzetten van genomische surveillance van het rabiësvirus in LMIC's haalbaar is en de vooruitgang kan ondersteunen in de richting van het wereldwijde doel van nul door honden gemedieerde sterfgevallen door hondsdolheid bij mensen tegen 2030, evenals verbeterde monitoring van de verspreiding van rabiës in het wild. Bovendien kan het platform worden aangepast voor andere ziekteverwekkers, waardoor een veelzijdige genomische capaciteit kan worden opgebouwd die bijdraagt aan de paraatheid bij epidemieën en pandemieën.

De sample-to-sequence-to-interpretation workflow voor RABV die in dit protocol wordt beschreven, is met succes gebruikt in verschillende laboratoriumomstandigheden in endemische landen, zoals Tanzania, Kenia, Nigeria en de Filippijnen (Figuur 4). Het protocol werd gebruikt voor verschillende soorten monsters en omstandigheden (tabel 6): vers en ingevroren hersenweefsel, cDNA- en RNA-extracten van hersenweefsel dat gedurende langere perioden onder de koudeketen werd getransporteerd, en FTA-kaarten met uitstrijkjes van hersenweefsel.
Live basecalling met behulp van RAMPART (Figuur 5) toont de bijna real-time generatie van reads en de procentuele dekking per sample. Dit is vooral handig om te beslissen wanneer de run moet worden gestopt en de flowcel moet worden bewaard voor hergebruik. Er werd variatie in looptijd waargenomen, waarbij sommige binnen 2 uur klaar waren, terwijl andere meer dan 12 uur nodig hadden om een voldoende dekkingsdiepte (x100) te bereiken. We kunnen ook regio's bekijken met een slechte versterking; Figuur 6 toont bijvoorbeeld een momentopname van één sequencing-run waarbij dekkingsprofielen enkele amplicons vertonen met een zeer lage versterking, wat wijst op mogelijk problematische primers. Door deze slecht versterkende regio's grondiger te onderzoeken, hebben we primer-mismatches kunnen identificeren, waardoor we individuele primers opnieuw kunnen ontwerpen en verbeteren. Sommige primerschema's hebben meer mismatches laten zien dan andere. Dit wordt waargenomen in het Oost-Afrikaanse primerschema, in vergelijking met de Filippijnen, in overeenstemming met de beoogde diversiteit, aangezien het Oost-Afrika-schema tot doel heeft een veel bredere diversiteit vast te leggen.
RABV-GLUE42, een algemene bron voor het beheer van RABV-genoomgegevens, en MADDOG60, een afstammingsclassificatie- en nomenclatuursysteem, werden gebruikt om de resulterende RABV-sequenties samen te stellen en te interpreteren. Tabel 7 geeft een overzicht van de grote en kleine clades die circuleren in elk land dat met behulp van RABV-GRUE is toegewezen. Ook wordt een hogere resolutie classificatie van lokale afstammingslijnen getoond na de MADDOG-opdracht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig01.jpg"> Figuur 1: Sample-to-sequence-to-interpretation workflow voor RABV. Samengevatte stappen worden getoond voor (A) monstervoorbereiding, (B) PCR- en bibliotheekvoorbereiding, en (C) sequencing en bio-informatica tot analyse en interpretatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig02.jpg"> Figuur 2: Schema van het primerschema. Gloeiposities langs het 'indexreferentiegenoom' (donkerpaars) voor paren voorwaartse en achterwaartse primers (halve pijlen), die in twee afzonderlijke pools zijn ingedeeld: A (rood) en B (groen). Primerparen genereren overlappende amplicons van 400 bp (blauw) die opeenvolgend zijn genummerd langs het indexreferentiegenoom in het formaat 'scheme_name_X_DIRECTION', waarbij 'X' een getal is dat verwijst naar het amplicon dat door de primer wordt gegenereerd en 'DIRECTION' 'LINKS' of 'RECHTS' is, dat respectievelijk de vooruit of achteruit beschrijft. Oneven of even waarden van 'X' bepalen de pool (respectievelijk A of B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig04.jpg"> Figuur 3: Nanopore flow cel48. Blauwe labels illustreren de verschillende onderdelen van de flowcel, waaronder het deksel van de primingpoort dat de primingpoort bedekt waar de primingoplossing wordt toegevoegd, het deksel van de SpotON-monsterpoort dat de monsterpoort bedekt waar het monster druppelsgewijs wordt toegevoegd, de afvalpoorten 1 en 2 en de flowcel-ID. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig03.jpg"> Figuur 4: Kaart met de locatie waar RABV-sequencing werd uitgevoerd met behulp van de geoptimaliseerde workflow in 2021 en 2022. De grootte en kleur van de bellen komen overeen met het aantal sequenties per locatie, waarbij kleiner en donkerder minder is, terwijl groter en lichter meer is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig05v2.jpg"> Afbeelding 5: Screenshot van RAMPART-visualisatie in webbrowser. Barcodenamen worden vervangen door voorbeeldnamen volgens de bio-informatica-opstelling. De bovenste drie panelen tonen samenvattende plots voor de hele run: dekkingsdiepte van in kaart gebrachte reads voor elke streepjescode per nucleotidepositie op het indexreferentiegenoom (linksboven, gekleurd door streepjescode), opgetelde in kaart gebrachte lezingen van alle streepjescodes in de loop van de tijd (midden boven) en in kaart gebrachte lezingen per streepjescode (rechtsboven, gekleurd door streepjescode). Onderste panelen tonen rijen plots per streepjescode. Van links naar rechts: de dekkingsdiepte van in kaart gebrachte reads per nucleotidepositie op het indexreferentiegenoom (links), lengteverdeling van in kaart gebrachte reads (midden) en het aandeel nucleotideposities op het indexreferentiegenoom die in de loop van de tijd een dekking van 10x, 100x en 1.000x van in kaart gebrachte reads hebben verkregen (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig05largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig06v2.jpg"> Figuur 6: Een voorbeeld van een leesdekking over het genoom voor een rabiësvirusmonster uit de Filippijnen waarvan de sequentie is bepaald met behulp van het protocol. De leesdekking op elke nucleotidepositie in het genoom wordt weergegeven, naast de positie van de overlappende amplicons (1-41) die worden gebruikt om de bibliotheek te genereren. Pieken in de dekkingsdiepte komen overeen met overlappingsgebieden met ampliconen. Amplicons met een lage dekkingsdiepte komen overeen met overlappende gebieden met amplicon. Amplicons met een lage dekkingsdiepte worden rood gemarkeerd om problematische regio's aan te geven die mogelijk moeten worden geoptimaliseerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig06largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Condities voor mastermix en thermische cycler voor cDNA-preparaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Mastermix- en thermische cyclercondities voor multiplex-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%202.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Condities van het mastermengsel en de thermische cycler voor de eindvoorbereidingsreactie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%203.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 4: Condities voor het mastermengsel en de thermische cycler voor barcodering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%204.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 5: Adapter ligation master mix en final library dilution for sequencing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table-5_revised.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 6: Het aantal gegenereerde sequenties van het hele genoom van het rabiësvirus en het type monsters dat in verschillende landen is gebruikt met behulp van de workflow van monster naar sequentie naar interpretatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%206.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 7: Grote en kleine clade-toewijzingen van RABV-GLUE en afstammingstoewijzingen van MADDOG voor sequenties die zijn gegenereerd met behulp van de workflow. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%207.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Ontwerp en optimalisatie van het inleidingsschema, en analyse van de ampliconleesdiepte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Computationele setup <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 3: RABV WGS-protocol werkblad <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%203-%20Worksheet.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we een snelle en kosteneffectieve workflow voor het karakteriseren van genomen van het rabiësvirus (RABV) met behulp van nanoporietechnologie. De workflow is bedoeld om genomics-geïnformeerde surveillance op lokaal niveau te ondersteunen, door informatie te verstrekken over circulerende RABV-lijnen en hun plaatsing binnen regionale fylogenieën om rabiësbestrijdingsmaatregelen te begeleiden.

Sequencing van het hele genoom voor snelle karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...

Ons onderzoek maakt gebruik van geavanceerde genomica om de surveillance van ziekteverwekkers in lage- en middeninkomenslanden te verbeteren. En dit helpt ons om lokale onderzoekers in staat te stellen vijf grote vragen te beantwoorden: wie, wat, waar, waarom en wanneer. En dit kan praktische oplossingen op het terrein opleveren.We gebruiken nanoporietechnologie om sequencing te decentraliseren. Het gebruiksgemak, de draagbaarheid en de lagere kosten in vergelijking met andere platforms maken het ideaal voor omgevingen met weinig middelen. En de mogelijkheid om snel te sequencen bij de monsterbron betekent dat we toezicht kunnen houden op het raakvlak tussen dier en mens.We staan voor uitdagingen bij het verkrijgen van hele genomen uit monsters van wisselende kwaliteit. Vaak werden inzendingen uit afgelegen gebieden onder slechte opslagomstandigheden vervoerd. En we hebben ook beperkte expertise in bio-informaticatools die nuttig zouden zijn bij het interpreteren van gegevens.Dus deze tools zouden zijn als MADDOG en drug-V GLUE. Dit kan worden gebruikt bij het interpreteren van gegevens op een universele manier om controle te initiëren. We proberen aan te tonen hoe ze het protocol optimaliseren voor snelle sequenties of voor hele genomische sequenties van hondsdolheid en om te zien hoe het kan worden aangepast en gebruikt in de lage-inkomenslanden voor de sequentiebepaling van rabiës om verschillende vragen te beantwoorden over hoe het echt circuleert, wat circuleert en wanneer het circuleert?En deze informatie is nodig voor strategieën voor de eliminatie van hondsdolheid. Virale genomische surveillance is nu toegankelijker. De richtsnoeren voor gegevensanalyse en -interpretatie voor lokale controle-inspanningen zijn echter beperkter.Ons protocol biedt een end-to-end pijplijn, waardoor lokale wetenschappers beschikken over eerstelijns bewakingsmogelijkheden. Een grotere beschikbaarheid van virale genomen en methoden voor het interpreteren van deze gegevens stelt onderzoekers in staat om epidemiologisch inzicht te vertalen in bruikbare informatie voor ministeries of ziektebestrijdingsprogramma's en het besluitvormingsproces te begeleiden.

whole-genome-sequencing-for-rapid-characterization-rabies-virus-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nanogaatje sequencing is een nieuwe technologie die het mogelijk maakt kosteneffectieve sequencing in afgelegen locaties en resource-arme instellingen. Hier, presenteren wij een protocol voor het rangschikken van mRNAs van geheel bloed dat met dergelijke voorwaarden compatibel is.

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Een pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie is ontwikkeld om specifiek te detecteren alle bekende lyssaviruses. Validatie met behulp van rabiës hersenen monsters van verschillende diersoorten bleek dat deze methode een gevoeligheid en specificiteit gelijkwaardig is aan de gouden standaard fluorescerende antilichaam test en kan worden gebruikt voor routine hondsdolheid diagnose heeft.

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

Deze real-time RT-PCR met behulp van dsDNA intercalating Dye is geschikt om Lyssavirus infecties te diagnosticeren. De methode begint met RNA geëxtraheerd uit rabiës verdachte ante-mortem-of postmortemmonsters, detaillering Master Mix preparaat, RNA toevoeging, installatie van de real-time machine en juiste interpretatie van de resultaten.

Pan-Lyssavirus real time RT-PCR voor rabiës diagnose

We valideerden eerder een protocol voor op amplicon gebaseerde whole genome Usutu virus (USUV) sequencing op een nanopore sequencing platform. Hier beschrijven we de methoden die in meer detail worden gebruikt en bepalen we het foutenpercentage van de nanopore R10-stroomcel.

Validering van Whole Genome Nanopore Sequencing, met behulp van Usutu Virus als voorbeeld

Dit protocol presenteert een qRT-PCR-gebaseerde benadering voor het bepalen van het rabiësvirus nucleoproteïne (N) genkopienummer binnen verschillende anatomische structuren van runderhersenen met behulp van in vitro transcriptie.

Kwantificering van rabiësvirus in verschillende runderhersenstructuren

Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.

Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

Het binnenoor sensorische epitheel van volwassen zebravis is een goed model voor het begrijpen van de mechanismen van haar cel regeneratie in volwassen gewervelde dieren. Dit protocol laat de fijne ontleding van het epitheel, waardoor we kunnen weefselmonsters krijgen voor het bestuderen van de regeneratieve gebeurtenissen in cellulaire en subcellulaire niveau.

Grove en fijne Dissectie van binnenoor Sensory epitheel in Adult zebravis ( Danio rerio)

Ontdek een kosteneffectieve workflow voor karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie. Deze methode ondersteunt lokale surveillance en helpt bij het identificeren van circulerende RABV-lijnages voor effectieve bestrijding.

Sequencing van het hele genoom voor snelle karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie

Meer video's verkennen