Name: Isolatie en identificatie van limbale nichecellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer de isolatie en identificatie van humane limbal nichecellen voor stamcelbiologie en regeneratieve geneeskunde. Deze methode ondersteunt onderzoek naar behandeling van limbal stamceldeficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Met dank aan Wei Wang, Lingjuan Xu en Rong Liu voor de begeleiding bij dit werk, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You en Li Guigang voor het verstrekken van een deel van het materiaal, Guanyu Su voor het schrijven van het manuscript, Xiao Zhou, Yihong Xiong en Huatao Xie voor het corrigeren van het manuscript en Guigang Li voor zijn volledige begeleiding. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82070936, 81470606, 81570819), het wetenschappelijke onderzoeksproject voor gezondheid en gezinsplanning in de provincie Hubei (nr. WJ2017M073), Top tien translationele medische onderzoeksprojecten van het Tongji-ziekenhuis (nr. 2016ZHYX20), trainingsproject van jonge medische pioniers in de stad Wuhan (nr. 2015whzqnyxggrc10), Global Talents Recruitment Program (G2022154028L), project van de Nationale Gezondheidscommissie van de provincie Hubei in 2022 (WJ2021ZH0005), en onderwerp Bouw van de oprichting van de financiële afdeling van Hubei in 2022 (42000022815T000000102)

Limbusweefsel van donoren tussen 50 en 60 jaar werd verkregen van de Rode Kruis Eye Bank, Tongji Hospital (Wuhan, China). Het protocol werd goedgekeurd door de Tongji Ethics Committee en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
1. Isolatie
<ol><li>Verkrijg limbusweefsel uit het tussenliggende opslagmedium van het hoornvlies en werk onder aseptische omstandigheden op een ultraschone werkbank.</li>
	<li>Schraap en verwijder de iris en het endotheel rond het hoornvlies met behulp van een steriel chirurgisch rond mesje.</li>
	<li>Snijd limbusweefsel in twaalf stukken van gelijke grootte met een chirurgisch mes met 1 mm links aan beide zijden van het hoornvlies en de sclera.</li>
	<li>Breng limbusweefsels over naar een kweekplaat van 3,5 cm, voeg 1 ml collagenase A (2 mg/ml, in DF-12-medium) toe om alle weefsels onder te dompelen voor de spijsvertering.</li>
	<li>Plaats de plaat in de celincubator van 37 °C, verteer de limbale weefsels gedurende 18 uur. OPMERKING: Vervolgprocedures worden meestal op de tweede dag uitgevoerd.</li>
	<li>Bereid een 5% basaalmembraanmatrix (Matrigel) gecoate kweekplaat met 6 putjes voor.<ol><li>Smeer 5% basaalmembraanmatrix (opgelost in MESCM [Tabel 1]) op de bodem van de put.</li>
		<li>Bereid tips van 200 μl en 1 ml, een centrifugaalbuis van 15 ml en een plaat met 6 putjes voor in een gesteriliseerde zak.</li>
		<li>Zet de gesteriliseerde zak (inclusief tips en centrifugaalbuis) en een nieuwe plaat met 6 putjes gedurende 20 minuten in een omgeving van -20 °C of -80 °C. Ontdooi de basaalmembraanmatrix in de koelkast bij 4 °C.</li>
		<li>Haal de voorgekoelde tips, de centrifugaalbuis en de plaat met 6 putjes uit de omgeving van -20 °C of -80 °C en voer vervolgens de volgende handelingen uit op de ultraschone werkbank.</li>
		<li>Breng 50 μL 5% basaalmembraanmatrix over naar 1 ml MESCM met behulp van een tip van 200 μL en meng ze voorzichtig en gelijkmatig.</li>
		<li>Breng 5% basaalmembraanmatrix (opgelost in MESCM) over naar een putje van een kweekplaat met 6 putjes met behulp van de voorgekoelde tip van 1 ml.</li>
		<li>Schud de 6-wellsplaat voorzichtig en horizontaal, plaats de 6-wells kweekplaat ongeveer 1 uur in de 37 °C-celincubator en voer dan de volgende stap uit.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder na 18 uur vertering collagenase A-verteerd limbaal weefsel, er blijven alleen enkele zichtbare kleine clusters en onverteerd scleraweefsel over. OPMERKING: Sterk vergrote microscopie onthult een cluster dat bestaat uit veel dicht opeengepakte cellen (inclusief LNC's).</li>
	<li>Gebruik een pipetpunt van 200 μl om de clusters onder de stereomicroscoop los te maken van onverteerde scleraweefsels.</li>
	<li>Breng de clusters over naar de kweekplaat van 3,5 cm en dompel ze onder in 0,25% TE, en plaats de plaat vervolgens gedurende 15 minuten in de celincubator.</li>
	<li>Voeg 1 ml MESCM met 10% knock-out serum toe om de celvertering te stoppen en pipetteer voorzichtig op en neer om de clusters in individuele cellen te resuspenderen met behulp van een pipetpunt van 1 ml.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een centrifugaalbuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g .</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de celprecipitatie te verstoren en voeg vervolgens 1 ml MESCM toe om de cellen te resuspenderen.</li>
	<li>Pipetteer 2-3 keer op en neer totdat de neerslag van de onderste cel gelijkmatig in de MESCM is gesuspendeerd met behulp van een pipetpunt van 1 ml, en neem een celsuspensie van 20 μl voor het tellen van de cellen.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over naar de 5% basaalmembraan matrixgecoate 6-wells plaat met een pipetpunt van 1 ml en verhoog het volume MESCM tot 2,5 ml.</li>
	<li>Schud de plaat met 6 putjes voorzichtig horizontaal om de cellen gelijkmatig te verdelen.</li>
	<li>Breng de cellen over naar de kweekincubator nadat ze zijn afgebeeld en geregistreerd. Observeer en fotografeer de cellen dagelijks en verander het medium elke 3-4 dagen.</li>
</ol>2. Identificatie van LNC
<ol><li>Immunofluorescentie kleuring<ol><li>Verteer de LNC's van de bodem van de plaat met 1 ml 0,25% TE gedurende 5 minuten in de 37°C celincubator.</li>
		<li>Beëindig de digestie door 1 ml MESCM (met knock-out serum) toe te voegen, centrifugeer de celsuspensie op 200 x g gedurende 5 minuten en zuig het supernatans voorzichtig op.</li>
		<li>Voeg 1 ml MESCM toe om de cellen in suspensie te resuspenderen. Bereid een celsuspensie van 80 μl (4 × 103 cellen per objectglaasje) voor 4 objectglaasjes (20 μl/objectglaasje) en gebruik het centrifugesysteem om cellen op microscoopglaasjes te deponeren volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Fixeer de cellen (geplakt op de objectglaasjes in stap 3) met 4% paraformaldehyde gedurende ongeveer 10 minuten en permeabiliseer vervolgens de cellen op de objectglaasjes met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Blokkeer de cellen gedurende 1 uur met 2% runderserumalbumine (BSA) voordat u ze incubeert met primaire antilichamen (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) op een shaker 's nachts bij 4 °C. Verwijder na de incubatie ongebonden primaire antilichamen door de objectglaasjes te wassen (5 min/wasbeurt, 3x) met PBST (PBS + 0,1% Tween 20).</li>
		<li>Incubeer de overeenkomstige secundaire antilichamen (ezel anti-muis IgG secundair antilichaam TRITC [1:1000], ezel anti-konijn IgG FITC [1:500], ezel anti-muis IgG 488 [1:300], ezel anti-konijn IgG 594 [1:400]) gedurende 1 uur met geschikte IgG niet-specifieke IgG-antilichamen. Verwijder het ongebonden secundaire antilichaam met PBST (5 min/wasbeurt, 3x).</li>
		<li>Kleuring van de kernen met 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole) en sluit de glaasjes af.</li>
		<li>Voer fluorescentiebeeldvorming uit met behulp van een fluorescentiemicroscoop (vergroting: 400x; Belichtingstijd: 50 ms).</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR)<ol><li>Neem RNA Isolation Kit om het totale RNA te extraheren volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Gebruik een cDNA-transcriptiekit met hoge capaciteit om 1-2 μg totaal RNA om te keren naar cDNA.</li>
		<li>Voer de omgekeerde transcriptie (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) en qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cycli) uit in een oplossing van 20 μL met cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), universele PCR Master Mix (10 μL) en ddH2O (tot 20 μL).</li>
		<li>Gebruik de vergelijkende CT-techniek (ΔΔCT)4,9 om de relatieve genexpressie te onderzoeken.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Karakterisering van LNC
<ol><li>Cellen tellen (hemocytometer)<ol><li>Vergist de LNC's van de bodem van de plaat met 0,25% TE gedurende 5 minuten in de 37 °C-celincubator.</li>
		<li>Beëindig de digestie door 1 ml MESCM (met knock-out serum) toe te voegen, centrifugeer de celsuspensie op 200 x g gedurende 5 minuten en zuig het supernatans voorzichtig op.</li>
		<li>Voeg 1 ml MESCM toe om de cellen te resuspenderen en neem vervolgens 10 μl celsuspensie in een centrifugebuisje van 0,5 ml. Voeg een gelijk volume van 0,4% Trypan blauwe kleuroplossing toe.</li>
		<li>Plaats 10 μL gekleurde celsuspensie op het telgebied van de hemocytometer en dek het af met een dekglaasje om te tellen. OPMERKING: Het aantal cellen in de vijf middelste vierkante gebieden wordt gedefinieerd als "A"; het celgetal in 1 ml wordt berekend als 5A × 104 × 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Onderzoek van LNC- en BMMSC-markers met flowcytometrie15<ol><li>Detecteer de expressie van SCF, CD73, CD90 en CD105 in de LNC's en BMMSC's met behulp van flowcytometrie 15 (2-4 ×10 6 gebeurtenissen/monster, 2.000 cellen werden verkregen uit elk van de monsters, in totaal 550.000 cellen die tegelijkertijd werden afgeschermd).</li>
		<li>Verzamel en kleur de cellen bij 20-30 °C gedurende 15 minuten in een blokkerende buffer (3% BSA en 0,05% Tween-20 in PBS) met behulp van vooraf gelabelde antilichamen (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] en CD105 [1:50]) volgens de instructies van de kit.</li>
		<li>Voer een FACS-analyse (fluorescentie-geactiveerde celsortering) uit met behulp van een flowcytometer. In dit onderzoek is gebruik gemaakt van FACS Diva software en FlowJo software. Noteer voor elk monster 10.000 gebeurtenissen en poort- en analyseer levende cellen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Een protocol om menselijke limbale nichecellen te isoleren, te kweken en te identificeren

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
<li>O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosa+tissue+equivalents+for+the+treatment+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency.</a> Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).</li>
<li>Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells.</a> Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).</li>
<li>Zeppieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+corneal+wound+healing+after+laser-induced+corneal+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice.</a> Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+cues+modulate+the+neurogenic+potential+of+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells.</a> Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft relevante financiële openbaarmakingen.

De transparantie van het hoornvlies wordt doorgaans gehandhaafd door regelmatige rangschikking en verdeling van kleine vezels (25-30 nm in diameter) in het hoornvliesstroma, wat cruciaal is voor een normale gezichtsscherpte16. Wereldwijd zijn er 253 miljoen mensen met een visuele beperking, van wie 36 miljoen blinden17. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) beschouwt hoornvliesblindheid als een van de ernstigste gevaren voor het menselijk gezichtsvermogen, goed voor 5,1% va...

De incidentie van cornea-epitheliale stamceldeficiëntie (CESD), ook wel limbale stamceldeficiëntie (LSCD)1 genoemd, en cornea-epitheliale regeneratie (CES) wordt steeds urgenter vanwege hoornvliesinfectie en -letsel. Als CESD niet goed wordt behandeld, kan het leiden tot blindheid waarvoor een hoornvliestransplantatie nodig is. Als gevolg hiervan wordt CES-regeneratie steeds belangrijker. Er is een groep ondersteunende cellen, limbale nichecellen (LNC's) genaamd, die essentiële ondersteuning bieden voor de CES-functie. Limbale stromale stamcellen werden voor het eerst geïsoleerd door Polisetty et al.2 en geïdentificeerd door Xie et al.3 als LNC's die gelokaliseerd zijn in het limbale epitheel subjacent en stroma van de limbus. LNC's zijn de belangrijkste ondersteunende stamcel van de hoornvliesrand en, met de functie van beenmerg-afgeleide MSC (BMMSC's), en kunnen worden geïnduceerd om zich te ontwikkelen tot hoornvliesepitheelcellen en hoornvliesstromale cellen, enz.3,4,5,6,7. Eerdere studies toonden aan dat de stamcelkwaliteiten van LNC's primitiever zijn dan BMMSC's8, die al veel in de kliniek worden gebruikt. LNC's kunnen zelfs de volgende haalbare optie worden na MSC, vooral voor de behandeling van CESD. Als belangrijke ondersteunende cellen voor CES zijn LNC's ook stamcellen die zijn afgeleid van de "niche"-structuur van de limbus. LNC's kunnen een sleutelrol spelen bij de dedifferentiatie van rijpe cornea-epitheelcellen (MCEC) naar CES9. Studies over LNC's zijn echter nog steeds relatief ontoereikend en er is geen consensus over de terminologie, isolatie, zuivering, identificatie en kenmerken van LNC's. Sommige onderzoekers hebben LNC's limbale biopsie-afgeleide stromale stamcellen10, limbale mesenchymale stamcellen 11, limbale fibroblaststamcellen 12 en limbale mesenchymale stromale cellen13 genoemd. Aangezien de groeikenmerken van LNC's niet in detail zijn beschreven, en vanwege hun veelbelovende wetenschappelijke en klinische toepassingen, en in de toekomst een van de belangrijkste klinische hulpmiddelen kunnen zijn, is het noodzakelijk om de isolatie, zuivering, identificatie en kenmerken van LNC's samen te vatten.
Volgens een eerdere studie14 zijn LNC's voornamelijk aanwezig in het limbale epitheel subjacent en stroma van de limbus. Dit protocol omvat het behandelen van limbusweefsel met collagenase A, het verkrijgen van een cluster bestaande uit LEPC en LNC's en het verteren ervan in afzonderlijke cellen met 0,25% trypsine-EDTA (TE). LNC's werden vervolgens selectief gekweekt in een gemodificeerd embryonaal stamcelmedium (MESCM) om te worden gezuiverd. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig en heeft een hoge efficiëntie bij het verkrijgen van menselijke LNC's in grote hoeveelheden.
De gedetailleerde procedure van LNC-isolatie, kweek en identificatie is opgenomen in de video voor wetenschappers die geïnteresseerd zijn in LNC-onderzoek, en kan indien nodig gemakkelijk worden herhaald.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu;g/mL</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1.25 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>MERCK</td><td>A1933</td><td>-</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Proteintech</td><td>67075-1-Ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-Ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Cell Incubator</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90(HT)</td></tr><tr><td>Centrifuge system</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge 12</td><td>-</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700</td><td>-</td></tr><tr><td>Culture plate</td><td>virya</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td>Tree Star</td><td>-</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line</td></tr><tr><td>High-capacity cDNA Transcription Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Inverted phase-contrast microscope</td><td>&nbsp;UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulin, transferrin, sodium selenite)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu;g/mL insulin, 5 &mu;g/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite</td></tr><tr><td>KnockOut SR Serum Replacement for ESCs/iPSCs</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td>356234</td><td>-</td></tr><tr><td>Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4.00%</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR&beta;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Real-time fluorescence quantitative PCR instrument</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One Plus</td><td>-</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/mL</td></tr><tr><td>Recominant Human Leukemia Inhibitory Factor(Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini RNA Isolation Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical round blade</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>size 10</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0.40%</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416</td><td>-</td></tr><tr><td>Ultra Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

isolatie en identificatie van limbale nichecellen

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Hier rapporteren we een standaardprocedure voor de isolatie en identificatie van limbale nichecellen (LNC's). Limbusweefsel verkregen uit een oogbank werd gebruikt voor de isolatie van LNC's. Het weefsel werd onder aseptische omstandigheden in 12 stukken verdeeld en gedurende 18 uur bij 37 °C verteerd in de celkweekincubator met behulp van collagenase A om celclusters met LNC's en limbale epitheliale voorlopercellen te verkrijgen. De celclusters werden verder verteerd gedurende 15 minuten bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA om afzonderlijke cellen te verkrijgen en vervolgens gekweekt in gemodificeerd embryonaal stamcelmedium (MESCM) op een plastic oppervlak bedekt met 5% Matrigel. Cellen werden gepasseerd bij 70% samenvloeiing en LNC's werden geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie, real-time kwantitatieve PCR (qPCR) en flowcytometrie. Primaire LNC's werden geïsoleerd en meer dan 12 keer gepasseerd. De proliferatieactiviteit van LNC's van P4 naar P6 was het hoogst. LNC's brachten hogere stamcelmarkers tot expressie dan BMMSC's (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR en PDGFRβ). Bovendien toonden de resultaten aan dat P4-LNC's VIM, CD90, CD105 en PDGFRβ uniform tot expressie brachten, maar niet Pan-CK, dat kon worden gebruikt als marker voor de identificatie van LNC's. Flowcytometrische analyse toonde aan dat ongeveer 95%, 97%, 92% en 11% van de LNC's respectievelijk CD73, CD90, CD105 en SCF tot expressie brachten, terwijl ze 68%, 99%, 20% en 3% waren in BMMSC's. Het standaardproces voor LNC-isolatie en -identificatie zou een betrouwbare laboratoriumbasis kunnen bieden voor het wijdverbreide gebruik van LNC's.

Groei van LNC De LNC's werden met succes geïsoleerd volgens de verteringsmethode van collagenase A (2 mg/ml) vertering van corneosclerale randweefsel, zoals hierboven beschreven (figuur 1). In overeenstemming met een eerder gerapporteerde studie3 werden na de vertering van collagenase A rupsachtige clusters onder de microscoop gevisualiseerd (Figuur 2). Het aandeel spoelcellen nam geleidelijk toe met de celpassage. Spo...

Hier presenteren we een protocol om de menselijke limbale nichecellen te isoleren en te identificeren.

Isolatie en identificatie van limbale nichecellen

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Onze studies richten zich op de reconstructie van de limbale niche om limbale stamceldeficiëntie te behandelen en het gezichtsvermogen van de patiënt te herstellen. We proberen te beantwoorden of limbale nichecellen al dan niet de sleutelcellen zijn die de functie van limbale stamcellen ondersteunen, en zo ja, hoe het werkt. Recente studies meldden dat subconjunctivale transplantatie van mesenchymale stamcellen uit beenmerg de limbale stamceldeficiëntie van alkalische verbrande ogen verhinderde.Een van de technologieën die momenteel worden gebruikt om ons onderzoek vooruit te helpen, is sequencing van één cel, die de belangrijkste activiteiten van de signaalroute op het niveau van een enkele cel kan analyseren voor het karakteriseren van limbale nichecellen. Hoewel LNC het potentieel hebben om in de toekomst een belangrijk klinisch hulpmiddel te worden, zijn hun groeikenmerken niet in detail onderzocht. Gezien hun veelbelovende wetenschappelijke en klinische toepassingen, is het noodzakelijk om de isolatie, zuivering, identificatie en kenmerken van LNC samen te vatten.

isolation-and-identification-of-limbal-niche-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Wij rapporteren een methode voor de fabricage van micropockets binnen electrospun membranen waarin celgedrag te bestuderen. Specifiek beschrijven we een combinatie van microstereolithography en elektrospinnen voor de productie van PLGA (poly (lactide-co-glycolide)) corneale biomateriaal inrichtingen voorzien microfeatures.

Combinatie van Microstereolithography en Electrospinning naar Membranen Uitgerust met Niches voor cornearegeneratie Produce

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Een voorbeeld van adenovirale gentherapie in humane diabetische orgaan-gecultiveerde hoornvliezen wordt gepresenteerd met als doel de normalisatie van vertraagde wondgenezing en een duidelijk verminderde expressie van epitheliale stamcelmarkers in deze hoornvliezen. Het beschrijft ook de optimalisering van dit proces in stamcel-verrijkte limbale epitheelculturen.

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

Het volgende artikel biedt een eenvoudige, reproduceerbare techniek om effectief een duurzame muismodel van limbale stamcellen deficiëntie (LSCD). Dit diermodel is bruikbaar bij het testen en vergelijken van de werkzaamheid van behandelingen voor limbale stamcellen ziekten.

Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse

Het blootgestelde normale oculaire oppervlak bestaat uit hoornvlies en conjunctiva. Epitheliale cellen, spekcellen en immuuncellen zijn aanwezig in de conjunctiva. Hier wordt een niet-invasieve techniek van impressie cytologie beschreven met behulp van een impressie cytologie apparaat en flow cytometrie om immuuncellen in de conjunctiva te analyseren.

Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en versterking van aerobe en facultatieve anaerobe muisconjunctivale commensale bacteriën met behulp van een uniek oogswab en op cultuur gebaseerde verrijkingsstap met daaropvolgende identificatie door microbiologische methoden en MALDI-TOF massaspectrometrie.

Conjunctivale commensale isolatie en identificatie bij muizen

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

Dit protocol beschrijft een methode om een nauwkeurig en reproduceerbaar hoornvlies- en limbaal alkalisch letsel te induceren in een muismodel. Het protocol is voordelig omdat het een gelijkmatig verdeelde verwonding van het sterk gekromde hoornvlies en de limbus van de muis mogelijk maakt.

Inductie van hoornvlies- en limbale alkalische letsels met behulp van een punch-trephine-techniek in een muismodel

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen te verkrijgen via sequentiële vertering met collagenase A en trypsine. Deze methode levert levensvatbare individuele cellen met hoge RNA-integriteit op, waardoor ze compatibel zijn met downstream-toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometriey.

Een protocol voor het oogsten van single-cel suspensie uit muizenhoornvliezen

Leer de isolatie en identificatie van humane limbal nichecellen voor stamcelbiologie en regeneratieve geneeskunde. Deze methode ondersteunt onderzoek naar behandeling van limbal stamceldeficiëntie.

Isolatie en identificatie van limbale nichecellen

Meer video's verkennen