Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen
6 oktober 2023
Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.
Om moleculaire en cellulaire mechanismen bij auto-immuunziekten zoals multiple sclerose te onderzoeken, is het genereren van reproduceerbare en geavanceerde celisolatieprotocollen een onvervulde behoefte. De meeste van de huidige technologieën om CZS-residente cellen te isoleren en te analyseren, vertonen ernstige tekortkomingen, zoals het focussen op slechts één celtype of alleen postnatale muizen. Het huidige protocol voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke CZS-residente celtypen uit één CZS-replicaat biedt de mogelijkheid om complexe neuronale netwerken en nieuwe ontstekingsroutes te analyseren, ex vivo uit één enkele celsuspensie, van toepassing op gezonde muizen en muizen met experimentele auto-immuunencefalomyelitis.
Bovendien neemt het aantal muizen af Ons protocol voor de gelijktijdige isolatie van alle vier de belangrijkste CZS-residente celtypen in gezonde en EAE-muizen zou kunnen worden gebruikt als een nuttig hulpmiddel voor onderzoeksgroepen die nieuwe ontstekingsroutes bestuderen, waardoor een veel nauwkeurigere analyse van complexe biomoleculaire mechanismen en cellulaire netwerken ex vivo mogelijk wordt. Nieuwe wetenschappelijke vragen die met behulp van ons protocol kunnen worden beantwoord, zijn dynamisch onderzoek in EAE tijdens verschillende stadia van het ziekteverloop, zoals neuro-inflammatie, neurodegeneratie en remissie. Ook cel-cel interacties en biochemische routes kunnen op individueel niveau worden bestudeerd.
Evenzo kunnen functionele tests worden uitgevoerd met gekweekte cellen. We zijn van plan ons te concentreren op dynamische studies van de EAE-cursus voor multi-omische analyse van één individueel CZS-homogenaat per EAE-tijdstip.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijkste residente celtypen van het centraal zenuwstelsel (CZS) uit één enkele muis, toepasbaar in zowel naïeve als experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) modellen. Deze methode is bedoeld om de beperkingen van huidige celisolatietechnieken aan te pakken, waardoor onderzoekers complexe cellulaire interacties tijdens neuroinflammatie kunnen bestuderen terwijl het aantal gebruikte muizen wordt geminimaliseerd.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Auto-immuniteitsonderzoek
Achtergrond
- Bestaande protocollen richten zich vaak op één enkel celtype of uitsluitend op postnatale muizen.
- De isolatie van cellen die in het centrale zenuwstelsel (CZS) verblijven, kan ons begrip van neuroinflammatoire processen aanzienlijk verbeteren.
- De behoefte aan een uitgebreid en reproduceerbaar protocol voor celisolatie wordt steeds belangrijker in de context van auto-immuunziekten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbaar protocol voor de isolatie van alle belangrijke in het CZS residente celtypen uit één muis.
- Het faciliteren van de analyse van cellulaire netwerken bij gezondheid en ziekte.
- Het mogelijk maken van nauwkeurigere studies naar inflammatoire routes bij neuroinflammatie.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van een methode voor celdissociatie die toepasbaar is op zowel gezonde muizen als muizen met EAE.
- De muizen worden in rugligging geplaatst, gevolgd door een gedetailleerd, stapsgewijs dissectieprotocol om hersen- en ruggenmergweefsel te verkrijgen.
- Protocollen voor celprecipitatie, wassen en zuivering worden nauwgezet beschreven, wat zorgt voor hoge opbrengsten van CNS-celtypen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol faciliteert de gelijktijdige isolatie van microglia, oligodendrocyten en andere in het centrale zenuwstelsel (CZS) aanwezige celtypen voor verdere analyses.
- Men verwacht dat deze methode inzicht biedt in de cellulaire dynamiek tijdens verschillende stadia van EAE.
- Cruciale verbeteringen omvatten een verminderd gebruik van dieren en een verbeterde datakwaliteit uit CZS-preparaten van een enkele muis.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een nieuwe techniek voor celisolatie die de onderzoeksmogelijkheden binnen de neuroimmunologie vergroot.
- Het vermogen van de methode om complexe biomoleculaire mechanismen te analyseren op basis van minder monsters heeft belangrijke implicaties voor het bestuderen van ziektemodellen van het CZS.
- Over het algemeen kan het protocol helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot neuroinflammatie en therapeutische interventies bij auto-immuunziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Gelijktijdige isolatie van alle belangrijkste cellen in het centraal zenuwstelsel van volwassen EAE-muizen maakt een uitgebreid onderzoek naar neuro-inflammatoire mechanismen in een enkel experiment mogelijk. Deze aanpak ondersteunt high-content, multi-omische analyses terwijl het verbruik van dieren wordt verminderd, wat een directe impact heeft op vroege ontdekking en doelwitvalidatie in neuro-immunologische portfolio's. Het protocol verhoogt het voorspellend vertrouwen voor het verminderen van risico's bij signaalpaden en de ontwikkeling van translationele biomarkers in autoimmune modellen van ziekten van het CZS.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt ex vivo analyse van complexe neuronale en gliale netwerken uit individuele CZS-monsters mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door dynamisch onderzoek naar neuroinflammatie, neurodegeneratie en remissiefasen toe te staan.
- Faciliteert functionele targetvalidatie door isolatie van levensvatbare, hoogzuivere CZS-celpopulaties.
- Vermindert biologische variabiliteit door alle celtypen uit hetzelfde dier te verkrijgen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gevalideerde enkelcel-suspensies met een hoge levensvatbaarheid voor downstream functionele en fenotypische assays.
- Standaardiseert celisolatie over verschillende CNS-celtypen, wat de reproduceerbaarheid en de vergelijkbaarheid van assays verbetert.
- Maakt schaalbare preparatie van CNS-residente cellen mogelijk voor compound-screening en het onderzoeken van signaalpaden.
- Ondersteunt kwantitatieve beoordelingen van zuiverheid en levensvatbaarheid via flowcytometrie om de gereedheid van de assay vast te stellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt overeen met ziekterelevante EAE-modellen voor de ontdekking en validatie van translationele biomarkers.
- Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door meerfasige ziekteanalyse mogelijk te maken.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door uitgebreide cellulaire gegevens van individuele dieren te leveren.
- Ondersteunt het onderzoek naar cel-celinteracties en biochemische routes die relevant zijn voor menselijke auto-immuniteit van het centrale zenuwstelsel.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door gelijktijdige analyses van meerdere celtypen uit EAE- en gezonde muizen mogelijk te maken, wat zowel hypothesegestuurd als exploratief onderzoek ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Bevordert hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door dynamische, stadiumspecifieke analyse van cellen uit het centrale zenuwstelsel (CZS) mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, hoogzuivere celsuspensies voor robuuste assay-ontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metrieken voor levensvatbaarheid en zuiverheid via flowcytometrie voor vergelijkingen tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en preklinische fasen door biomarker-afstemming in ziekterelateerde modellen te ondersteunen.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor de isolatie van CZS-cellen dat toepasbaar is binnen diverse onderzoeksprogramma's naar neuro-inflammatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in auto-immuunonderzoek naar het centrale zenuwstelsel.
- Operationele waarde: Standaardiseert celisolatie, verbetert de reproduceerbaarheid en minimaliseert het gebruik van dieren.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door multiparametrische analyses uit individuele dieren mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van neuro-inflammatoire targets en biomarkers.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in dissectie van het CZS, celdissociatie en magnetisch-geactiveerde cel sortering (MACS).
- Vereist toegang tot flowcytometrie- en cel-sorteerinstrumentatie voor kwaliteitscontrole.
- Noodzaakt standaardisatie van weefselverwerking en analytische protocollen tussen verschillende teams.
- Aanpasbaar aan zowel EAE- als gezonde volwassen muismodellen voor brede toepasbaarheid.
- Afhankelijk van zorgvuldige behandeling om de celviabiliteit en zuiverheid te behouden, zoals ondersteund door de brondata.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:58
Preparation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
3:54
Dissociation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
5:25
Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice
7:18
Isolation of CNS Cell Types Using Magnetic Beads in Naive and EAE Mice
