Name: Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer hoe je netvliesletsel modellen genereert bij Xenopus-kikkervisjes voor regeneratief onderzoek. Deze methode onderzoekt de rol van Muller glia en neuro-inflammatie bij retinale regeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan M.P. van de Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) en UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in samenwerking met ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Retinale degeneratie genereren om cellulaire herstelstrategieën bij Xenopus te onderzoeken

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Voor- en nadelen van verschillende paradigma's voor netvliesbeschadiging bij Xenopus-kikkervisjes
Mechanisch netvliesletsel Verschillende chirurgische verwondingen van het neurale netvlies zijn ontwikkeld bij Xenopus-kikkervisjes. Het neurale netvlies kan ofwel volledig worden verwijderd15,16 of slechts gedeeltelijk worden weggesneden 16,17.<sup c...

Miljoenen mensen over de hele wereld lijden aan verschillende degeneratieve ziekten van het netvlies die leiden tot blindheid, zoals retinitis pigmentosa, diabetische retinopathie of leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). Tot op heden blijven deze aandoeningen grotendeels onbehandelbaar. De huidige therapeutische benaderingen die worden geëvalueerd, omvatten gentherapie, cel- of weefseltransplantaties, neuroprotectieve behandelingen, optogenetica en protheses. Een andere opkomende strategie is gebaseerd op zelfregeneratie door de activering van endogene cellen met stamcelpotentieel. Müller-gliacellen, het belangrijkste gliaceltype van het netvlies, behoren tot de cellulaire bronnen die in deze context van belang zijn. Bij letsel kunnen ze dedifferentiëren, prolifereren en neuronen genereren 1,2,3. Hoewel dit proces zeer effectief is bij zebravissen of Xenopus, is het grotendeels inefficiënt bij zoogdieren.
Desalniettemin is aangetoond dat geschikte behandelingen met mitogene eiwitten of overexpressie van verschillende factoren de terugkeer van de Müller-gliacelcyclus van zoogdieren kunnen induceren en, in sommige gevallen, hun daaropvolgende neurogenese-verbintenis kunnen veroorzaken 1,2,3,4,5. Dit blijft echter grotendeels onvoldoende voor behandelingen. Daarom is het vergroten van onze kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan regeneratie noodzakelijk om moleculen te identificeren die in staat zijn om de eigenschappen van Müller-stamcellen efficiënt om te zetten in nieuwe cellulaire therapeutische strategieën.
Met dit doel voor ogen ontwikkelden we verschillende letselparadigma's in Xenopus die retinale celdegeneratie veroorzaken. Hier presenteren we (1) een mechanisch netvliesletsel dat niet specifiek is voor het celtype, (2) een voorwaardelijk en omkeerbaar celablatiemodel met behulp van het NTR-MTZ-systeem dat zich richt op staafcellen, (3) een CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , een model van retinitis pigmentosa dat progressieve staafceldegeneratie veroorzaakt, en (4) een CoCl2-geïnduceerd cytotoxisch model dat, afhankelijk van de dosis, zich specifiek op kegeltjes kan richten of kan leiden tot bredere degeneratie van retinale cellen. We belichten de bijzonderheden, voor- en nadelen van elk paradigma.

<table><tbody><tr><td>1,2-Propanediol (propyl&egrave;ne glycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol &ge;99.8%</td><td>VWR chemicals</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)</td><td>Cell signaling</td><td>9661S</td><td>Dilution 1/300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody (chicken)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anti-M-Opsin antibody (rabbit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>Dilution 1/1,000</td></tr><tr><td>Anti-Otx2 antibody (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>Dilution 1/1,000</td></tr><tr><td>Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>Dilution 1/1,000</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin antibody (rabbit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Rhodopsin antibody (mouse)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>Dilution 1/1,000</td></tr><tr><td>Anti-S-Opsin antibody (rabbit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Stock solution 10%</td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33258 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Stock solution 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Butanol-1 &ge;99.5%</td><td>VWR chemicals</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.02382</td><td>Use at 0.1 M</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark Capillary Glass model GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>Stock solution 100 mM</td></tr><tr><td>Coverslip 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL ab diluent&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Electronic Rotary Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eosin 1% aqueous</td><td>RAL Diagnostics</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein lysine dextran&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin albumin acc. Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>Use at 3% in water</td></tr><tr><td>Hematoxylin (Mayer's Hemalun)</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES potassium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin hormone</td><td>MSD Animal Health</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich (SAFC)</td><td>1.00314</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>M3761</td><td>Use at 10 mM</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500</td></tr><tr><td>Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Ultra Microtome blade</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Needle Agani 25 G x 5/8''</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 &micro;m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin histowax without DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution (32%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>EM-15714-S</td><td>Use at 4% in 1x PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 100 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish 55 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>PicoSpritzer Microinjection system</td><td>Parker Instrumentation Products</td><td>PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Pins&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Polysucrose (Ficoll PM 400 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>Use at 3% in 0.1x MBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Powdered fry food : sera Micron Nature</td><td>sera</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>Scissors dissection</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp

modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van blindheid. Van de vele therapeutische strategieën die worden onderzocht, is het stimuleren van zelfherstel onlangs bijzonder aantrekkelijk gebleken. Een cellulaire bron van belang voor herstel van het netvlies is de Müller-gliacel, die stamcelpotentieel en een buitengewoon regeneratief vermogen in anamniotes herbergt. Dit potentieel is echter zeer beperkt bij zoogdieren. Het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regeneratie van het netvlies in diermodellen met regeneratieve vermogens zou inzicht moeten geven in hoe het latente vermogen van Müller-cellen van zoogdieren om het netvlies te regenereren kan worden ontsloten. Dit is een belangrijke stap voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën in de regeneratieve geneeskunde. Om dit doel te bereiken, ontwikkelden we verschillende paradigma's voor netvliesbeschadiging in Xenopus: een mechanisch netvliesletsel, een transgene lijn die nitroreductase-gemedieerde voorwaardelijke ablatie van fotoreceptoren mogelijk maakt, een retinitis pigmentosa-model op basis van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , en een cytotoxisch model aangedreven door intraoculaire CoCl2-injecties . Door hun voor- en nadelen te benadrukken, beschrijven we hier deze reeks protocollen die verschillende degeneratieve aandoeningen genereren en de studie van retinale regeneratie bij Xenopus mogelijk maken.

Mechanisch netvliesletsel Retinale secties van kikkervisjes die onderhevig zijn aan de mechanische verwonding beschreven in protocolsectie 1 tonen aan dat de retinale laesie alle lagen van het weefsel omvat, terwijl het beperkt blijft tot de punctieplaats (Figuur 2A,B).
Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeem De ogen van verdoofde Tg(rho:GFP-NTR) transgene kikkervisjes die...

We hebben verschillende protocollen ontwikkeld om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te induceren bij kikkervisjes van Xenopus laevis . Deze modellen bieden de mogelijkheid om retinale regeneratiemechanismen te bestuderen.

Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Mijn lab werkt aan retinale regeneratie. We gebruiken de Xenopus-kikker als modelsysteem. Deze amfibie is inderdaad behoorlijk fascinerend omdat hij, in tegenstelling tot zoogdieren, zoals wij, zijn netvlies zeer efficiënt kan regenereren in geval van verwonding.En we bestuderen het onderliggende mechanisme omdat het in de toekomst nuttig zou kunnen zijn om retinale regeneratie op gang te brengen bij menselijke patiënten die lijden aan retinale neurodegeneratieve ziekten. We hebben onlangs ontdekt dat naast stamcellen in de periferie van het netvlies en het retinale gepigmenteerde epitheel, ook neurogliale cellen kunnen worden gerekruteerd voor retinale regeneratie in geval van letsel. En dus bestuderen we nu de verbanden tussen neuro-inflammatie en het regeneratieve vermogen van deze cellen.Het lijkt er inderdaad op dat de neuro-inflammatoire niche een belangrijke speler is in de modulatie van de regeneratie van het netvlies. Om de cellulaire en moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de regeneratie van het netvlies, hebben we verschillende paradigma's voor netvliesletsel ontwikkeld in Xenopus. De eerste is een mechanisch netvliesletsel.De tweede is een transgene lijn die nitroreductase-gemedieerde voorwaardelijke ablatie van fotoreceptoren mogelijk maakt. De derde is een retinitis pigmentosa-model op basis van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out, en, om te eindigen, een cytotoxisch model aangedreven door intraoculaire injectie van kobaltchloride of CoCl2. Mijn gastlaboratorium heeft aangetoond dat Xenopus weliswaar zijn netvlies kan regenereren, maar dat de efficiëntie zeer variabel is en afhangt van de stadia van het kikkervisje of van de soort, Xenopus laevis of tropicalis.Dit maakt Xenopus een fantastisch model voor het illustreren van de moleculaire mechanismen die de regeneratie van het netvlies in gang zetten of beperken.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Xenopus laevis een ideaal model voor het bestuderen cellen lot specificatie en fysiologische functie van individuele retinale cellen in primaire celkweek. Hier wordt een methode voor het ontleden retinale weefsels en genereren primaire celculturen die afgebeeld voor calcium activiteit en geanalyseerd door in situ hybridisatie.

Dissection, Cultuur en Analyse van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonale netvliesweefsel

The video demonstrates a method for culturing primary retinal ganglion cells from zebrafish embryos. Early-stage embryos undergo dissection to isolate the eyes, which are subsequently mechanically dissociated into a suspension of retinal ganglion cells. This cell suspension is cultured on coverslips coated with adhesive proteins to facilitate axon development.

Generation of Primary Retinal Ganglion Cell Cultures From Zebrafish Embryos

This video demonstrates a procedure to induce retinal degeneration in adult zebrafish using laser injury. The laser targets photoreceptor cells in the retina, triggering cell death and a degenerative process. This damage activates Müller glia (MG) cells, leading to their dedifferentiation into stem cell progenitors that aid in retinal regeneration.

Modeling Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury

Meerdere lichte schade protocollen zijn beschreven schade fotoreceptoren en dientengevolge een netvlies regeneratie respons bij volwassen zebravissen induceren. Dit protocol beschrijft een verbeterde werkwijze die kan worden gebruikt in gepigmenteerde dieren en beschadigt de meeste staafjes en kegeltjes fotoreceptoren over de gehele retina.

A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis

Xenopus laevis kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank. Dit gedrag wordt gestuurd door hun visie. Op basis van dit probleem presenteren we een eenvoudige test om de visuele functie kikkervisjes testen.

Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in<em&gt; Xenopus laevis</em

Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.

Hele netvlies Explantaten van kippenembryo&#39;s voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Leer hoe je netvliesletsel modellen genereert bij Xenopus-kikkervisjes voor regeneratief onderzoek. Deze methode onderzoekt de rol van Muller glia en neuro-inflammatie bij retinale regeneratie.

Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

Meer video's verkennen