Name: Arterioveneuze metabolomics om in vivo metabolietuitwisseling in bruin vetweefsel te meten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 55 s
Description: Ontdek arterioveneuze metabolomics voor bruin vetweefselonderzoek met GC-MS in muismodellen. Deze methode versnelt validatie van genetische modellen en biedt inzicht in metabole uitwisseling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken alle leden van de laboratoria van Choi en Jung voor de methodologische discussie. Wij danken C. Jang en D. Guertin voor hun advies en feedback. We danken M.S. Choi voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NRF-2022R1C1C1012034 aan S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 aan D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 aan S.M.J. en D.W.C. Dit werk werd ondersteund door Chungnam National University voor W.T.K. Figuur 1 en Figuur 2 zijn gemaakt met behulp van BioRender (http://biorender.com/).

Alle experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van de Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De muizen werden gehuisvest in een door de IACUC goedgekeurde dierenfaciliteit in een cleanroom met een temperatuur van 22 °C en een luchtvochtigheid van 45%, volgens een dagelijkse licht/donkercyclus van 12 uur. Ze werden gehouden in geventileerde rekken en hadden toegang tot een standaard chow-dieet ad libitum (bestaande uit 60% koolhydraten, 16% eiwit en 3% vet). Strooisel en nestmateriaal werden wekelijks ververst. Voor deze studie werden mannelijke C57BL/6J-muizen van 12 weken oud met een gewicht tussen 25 g en 30 g gebruikt. Deze dieren waren afkomstig van een commerciële leverancier (zie Materiaaltabel).
1. Modulatie van de metabole activiteit van het bruine vetweefsel door temperatuuracclimatisatie en farmacologische stimulatie
OPMERKING: Temperatuuracclimatisatie gedurende enkele dagen tot weken of farmacologische stimulatie met behulp van β-adrenerge receptoragonisten zijn veelgebruikte methoden voor het moduleren van BBT-activiteit1. Daarom wordt hieronder een beknopt overzicht van de methode gegeven om lezers in staat te stellen de juiste aanpak te kiezen als dat nodig is. Om metabolisch inactieve (minder thermogene) BBT te verkrijgen, wordt voor C57BL/6J-muizen een basistemperatuur voor warme warmte (28-30 °C) gekozen, ook wel thermoneutraliteit genoemd. Dit bereik zorgt ervoor dat de muizen geen extra energie hoeven te verbruiken om een constante lichaamstemperatuur te behouden. Om metabolisch bescheiden of zeer actieve (thermogene) BBT te verkrijgen, kan respectievelijk worden gekozen voor milde koude (20-22 °C) of zeer koude (6 °C) temperaturen. Voor de doeleinden van dit experiment werden muizen grootgebracht onder standaard huisvestingsomstandigheden bij 22 °C, die, hoewel licht koud voor muizen, geen farmacologische stimulaties met zich meebrachten.
<ol><li>Temperatuur acclimatisatie<ol><li>Scheid de muizen om 1 of 2 muizen per kooi te huisvesten, ten minste 1 week voorafgaand aan de start van de temperatuuracclimatisatie. Bereid knaagdierbroedmachines voor die zijn uitgerust met luchtventilatie, temperatuur- en vochtigheidsregeling met de gewenste omstandigheden.</li>
		<li>Verplaats de kooien naar hun respectievelijke knaagdierincubators op geschikte dagen voor het gekozen type temperatuuracclimatisatie.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de verdeling van het aantal muizen gelijkmatig is over alle groepen, met 1 of 2 muizen per kooi. Eenpersoonshuisvesting heeft de voorkeur omdat deze gevoeliger is voor door temperatuur veroorzaakte fysiologische veranderingen in vergelijking met groepshuisvesting43. Dit zijn de specifieke huisvestingsvoorwaarden voor elke groep:<ol><li>Thermoneutraliteitsgroep (30 °C): Houd de muizen in deze groep gedurende maximaal vier weken continu op een temperatuur van 30 °C.</li>
			<li>Ernstige koudegroep: Huisvest de muizen in eerste instantie in deze groep bij 18 °C zonder nestmateriaal. Ze zullen een geleidelijke wekelijkse temperatuurdaling ervaren, die in de vierde week 6 °C bereikt. Het temperatuurverloop is als volgt: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.</li>
			<li>Milde koude groep (20-22 °C): Huisvest de muizen in deze groep in broedmachines voor knaagdieren onder dezelfde omstandigheden als de eerder genoemde standaard huisvestingsomstandigheden.</li>
			<li>Acute koude-uitdagingen: Voor acute koude-uitdagingen, plaats 1-2 muizen per kooi zonder nestmateriaal en stel ze bloot aan een knaagdierincubator die is ingesteld op 6 °C gedurende maximaal 8 uur. OPMERKING: Deze huisvestingsomstandigheden en temperatuurvariaties zijn essentieel voor het bestuderen van de effecten van verschillende temperatuuromgevingen op de BBT-activiteit en het metabolisme.</li>
		</ol></li>
		<li>Verander elke week van kooi en vul voedsel en water aan. Pre-acclimatiseer de kooien ten minste 24 uur voorafgaand aan de suppletie, op hun respectievelijke temperatuur (knaagdierincubator). OPMERKING: Om verstoring van de juiste temperatuurprikkel te voorkomen, is het belangrijk om geen muizenverrijkingen te geven die tot nestbouw zouden kunnen leiden. Als reactie op ernstige verkoudheid verbruiken muizen meer energie om de lichaamstemperatuur op peil te houden, wat resulteert in een verhoogde voedselinname en hogere uitscheidingssnelheden. Daarom is het van cruciaal belang om de kooien minstens twee tot drie keer per week te controleren (volgens de lokale institutionele richtlijnen) om er zeker van te zijn dat de muizen voldoende voedsel en water hebben en dat de kooien niet te nat zijn. Deze monitoring is essentieel om het welzijn en de gezondheid van de muizen tijdens het onderzoek te behouden.</li>
	</ol></li>
	<li>Farmacologische stimulatie1 met behulp van de β3-adrenerge receptoragonist CL316,243<ol><li>Om het stimulerende effect te maximaliseren, moeten de muizen 2-4 weken vóór injecties in thermoneutraliteit (30 °C) worden gehuisvest.</li>
		<li>Injecteer na de acclimatisatieperiode intraperitoneaal 1 mg/kg CL316,243. OPMERKING: Voor chronische stimulatie met de β3-adrenerge receptoragonist (bijv. van 3 dagen tot week 1,44,45) zijn dagelijkse injecties vereist vanwege de stabiliteit van het geneesmiddel. Verdund CL316,243 moet op de dag van injectie worden bereid vanwege de stabiliteit.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Arterioveneuze bloedafname
OPMERKING: Muizen ouder dan 12-14 weken worden het best aanbevolen voor arterioveneuze bloedafname. Jongere muizen hebben mogelijk niet voldoende grote Sulzer-aderen, een duidelijk bloedvat dat specifiek veneus bloed afvoert uit het interscapulaire BAT46.
<ol><li>Verdoof voorzichtig met behulp van de gekalibreerde verdamper met 3% isofluraan voor inductie (in een kamer van 205 x 265 x 200 mm) en 2% isofluraan voor onderhoud (met een gasanesthesiemasker). OPMERKING: De volledige arterioveneuze bloedafnameprocedure moet onmiddellijk na anesthesie worden uitgevoerd. Een met water verwarmd verwarmingskussen kan tijdens de anesthesie worden gebruikt om de kerntemperatuur van het lichaam op peil te houden. LET OP: Isofluraan is zeer vluchtig en giftig bij inademing. Daarom moet primaire anesthetisatie worden uitgevoerd onder een zuurkast.</li>
	<li>Controleer de reflexen van het dier, zoals het terugtrekken van de poten, om te bevestigen dat de verdoving de juiste diepte heeft bereikt.</li>
	<li>Het verzamelen van veneus bloed uit de ader van Sulzer<ol><li>Plaats de muis om de dorsale huid bloot te leggen, bevestig de diepte van de anesthesie via een teenknijp vlak voordat u de incisie maakt. Bevochtig de dorsale huid met voldoende 70% ethanol om loslating van het haar te voorkomen, en maak een incisie langs de rug van het onderste deel van de thorax helemaal tot aan de nek. OPMERKING: De interscapulaire BAT bevindt zich direct onder de huid en bestaat uit twee vetkussentjes bedekt met dun wit vetweefsel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de muis onder narcose blijft door middel van het gasanesthesiemasker.</li>
		<li>Til de interscapulaire BAT voorzichtig op met een pincet met gebogen punt en snijd voorzichtig de aangehechte weefsels, waarvan de meeste spieren zijn. Til het vetkussen op in de richting van het hoofd, blijf de aangehechte weefsels doorsnijden en open het gebied voorzichtig totdat de ader van Sulzer (een groot 'Y'-vormig donkerrood vat dat is verbonden met beide vetkussentjes van interscapulaire BAT) bloot komt te liggen. OPMERKING: Pas op dat u de capillaire vaten van spierweefsels die verbonden zijn met het voor- en zijgebied van interscapulaire BAT niet doorsnijdt, omdat dit de hoeveelheid en kwaliteit van het bloed dat uit de ader van de Sulzer stroomt aanzienlijk zal verminderen.</li>
		<li>Snijd voorzichtig de ader van Sulzer door en verzamel ongeveer 40 μl bloed met behulp van pipetpunten van 200 μl en een P100-pipet. Bewaar het bloed in een bloedafnamebuisje en bewaar het buisje op ijs tot het serumafnameproces. OPMERKING: Het is belangrijk om bloed te verzamelen van net onder het Y-vormige scheidingspunt van de ader van Sulzer, om bloedbesmetting van de superieure vena cava47 te voorkomen. Het verzamelen van te veel bloed zal de kenmerken van de ader van Sulzer verminderen. Zorg er dus voor dat u de minimale hoeveelheid bloed verzamelt die nodig is uit de ader van Sulzer voor analyse. Wees bedachtzaam bij het selecteren van bloedafnamebuisjes, aangezien serum en plasma verschillende metabolietprofielen opleveren 48,49,50. Voor plasmaverzameling is het noodzakelijk om met heparine gecoate buisjes te gebruiken. In dit experiment werden stollingsactivator-gecoate buisjes gekozen om serum te verkrijgen. In geen geval mogen EDTA-gecoate buizen worden gebruikt, aangezien EDTA een aanzienlijke invloed heeft op massaspectrometriesignalen51,52.</li>
	</ol></li>
	<li>Arterieel bloed verzamelen uit de linker hartkamer<ol><li>Draai de muis om zonder het contact met de neuskegel te verliezen, om de ventrale huid bloot te leggen. Bevestig de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen voordat u de incisie maakt. Bevochtig de ventrale huid met een ruime hoeveelheid 70% ethanol om loslating van het haar te voorkomen, en open de borstholte voorzichtig met een schaar om het hart bloot te leggen zonder de interne structuur te beschadigen.</li>
		<li>Prik nauwkeurig in het topgebied van de linker hartkamer met een spuit van 1 ml met een naald van 29 G (1/2"). Steek tweederde van een 1/2'' naald tot 3-5 mm rechts horizontaal van de top van het hart (Figuur 1B) en trek de spuit terug om bloed uit de linker hartkamer (50-100 μL) te verzamelen. Bloed uit de linker hartkamer is zuurstofrijk arterieel bloed dat helderrood is. Bewaar het bloed in een bloedafnamebuisje en bewaar het buisje op ijs tot het serumafnameproces. OPMERKING: Er moet een minimale incisie in de borstholte worden gemaakt voor toegang tot het hart. Overmatige incisie kan leiden tot lokale bloedingen, wat vervolgens kan leiden tot lage bloeddruk. Dit kan van invloed zijn op de kwaliteit van het arteriële bloed dat uit de linker hartkamer wordt verzameld. Vermijd het draaien of omdraaien van het hart, omdat dit het moeilijk maakt om de precieze positie van de linker hartkamer te bepalen.</li>
		<li>Voer euthanasie uit en zorg ervoor met een geschikte methode volgens de richtlijnen van de lokale instellingen. Euthanasie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door middel van cervicale dislocatie en worden bevestigd door het stoppen van de hartslag.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugeer bloedmonsters bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Vang het supernatans voorzichtig op met behulp van een pipet. Het supernatans moet serum of plasma bevatten, afhankelijk van het type bloedafnamebuisje dat wordt gebruikt. Men kan hier stoppen en de monsters opslaan bij -20 °C tot serumverwerking voor GC-MS-analyse. OPMERKING: Hemolyse kan mogelijk zijn opgetreden als roodgekleurd supernatans wordt waargenomen. Om hemolyse te voorkomen, moet u het monster vortex voordat de stolling is voltooid. Sommige met rode bloedcellen verrijkte metabolieten, waaronder glutamine en lactaat, kunnen leiden tot verkeerde interpretatie van gegevens, hoewel de meeste metabolieten mogelijk niet significant worden beïnvloed door hemolyse. Het wordt aanbevolen om het serum/plasma binnen een week te analyseren.</li>
</ol>3. Metabolietextractie uit serum en chemische derivatisering
<ol><li>Voorbereiding voor de extractie OPMERKING: Alle methoden, inclusief metabolietextractie, derivatisering en gegevensanalyse, zijn licht gewijzigde versies van eerder beschreven methoden53,54.<ol><li>Bereid de extractiebuffer voor door 100 μM-oplossing van DL-norvaline, interne standaard (zie materiaaltabel), toe te voegen aan methanol van MS-kwaliteit.</li>
		<li>Zorg ervoor dat alle experimentele procedures op ijs worden uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng 10 μL muizenserum geëxtraheerd uit de ader van Sulzer of de linker hartkamer over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 40 μL extractiebuffer.</li>
	<li>Om celresten en eiwitten te verwijderen, vortex u de serummonsters kort, gevolgd door centrifugeren op maximale snelheid (18.000 x g) gedurende 30 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng na het centrifugeren voorzichtig 40 μl supernatans over in een glazen injectieflacon, gevolgd door 3 uur drogen in een vacuümcentrifuge bij 4 °C. NOTITIE: Een glazen inzetstuk (zie Materiaaltabel) wordt aanbevolen in plaats van plastic buizen vanwege plastic-reactieve chemicaliën die tijdens de volgende derivatisatiestap worden gebruikt.</li>
	<li>Onderwerp de gedroogde monsters aan twee opeenvolgende derivatisatiestappen voor de GC-MS-analyse van de serummetabolieten. NOTITIE: De volgende stappen moeten onder een zuurkast worden uitgevoerd vanwege irritatierisico's van de oplosmiddelen.<ol><li>Resuspendeer de gedroogde serumextracten in 30 μl 10 mg/ml methoxyaminehydrochloride (zie materiaaltabel) opgelost in pyridine en incubeer dit gedurende 30 minuten bij 37 °C.</li>
		<li>Derivatiseer monsters voor silylering van metabolieten met 70 μl N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoracetamide (MTBSTFA, zie materiaaltabel) bij 70 °C gedurende 1 uur. OPMERKING: Het gebruik van een glazen spuit wordt aanbevolen in plaats van een plastic punt in de volgende stappen vanwege de derivatisatieoplosmiddelen die reageren met plastic.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Metabolomics-analyse met behulp van GC-MS
OPMERKING: Single quadruple GC-MS (zie Tabel met materialen) werd gebruikt om de verschillende serummetabolieten te meten, waaronder koolhydraten, aminozuren en TCA-cyclustussenproducten in afgeleide monsters van de Sulzer-ader en de linker hartkamer. Andere kolommen kunnen ook worden gebruikt, hoewel de experimentele instellingen, inclusief het temperatuurprogramma, kunnen variëren afhankelijk van het type kolommen dat wordt gebruikt.
<ol><li>Injecteer 1 μL van het afgeleide monster in de GC in splitless modus bij 280 °C (inlaattemperatuur), waarbij helium wordt gebruikt als draaggas met een debiet van 1.500 ml/min (setpoint).</li>
	<li>Stel de quadrupool in op 200 °C met GC-MS interface op 300 °C. OPMERKING: Het ovenprogramma voor alle metabolietenanalyses begint bij 60 °C, wordt gedurende 1 minuut aangehouden en wordt vervolgens verhoogd met een snelheid van 10 °C/min totdat de temperatuur 320 °C bereikt.</li>
	<li>Verzamel gegevens door elektronenionisatie (EI) ingesteld op 70 eV en verkrijg de monstergegevens in scanmodus (50-550 m/z)53. Alle metabolieten die in deze studie werden gebruikt, werden eerder gevalideerd met standaarden om massaspectra en retentietijden te bevestigen.</li>
	<li>Piekgebiedsintegratie uitvoeren met behulp van in de handel verkrijgbare analysesoftware (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Stem de verbindingen af op het production van elk TBMDS-derivaat. Verkrijg vervolgens het extractie-ionenchromatogram (EIC) door de m/z-waarde van het fragmentionen in het overeenkomstige piekgebied te integreren en exporteer het vervolgens. Fragmentionen zijn weergegeven in tabel 1. OPMERKING: De EIC van elke verbinding werd genormaliseerd door die van DL-norvaline in elk monster. De gegevens worden weergegeven door de ader van Log2 Sulzer naar de linker hartkamer (Log2(SV/LV)) met behulp van elke genormaliseerde EIC-waarde.</li>
</ol>

Onderzoek naar metabolietuitwisseling in bruin vetweefsel

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten te melden hebben.

Een cruciale stap in het begrijpen van het metabolische potentieel van BAT in de energiebalans van het hele lichaam is om te bepalen welke voedingsstoffen het verbruikt, hoe ze metabolisch worden verwerkt en welke metabolieten in de bloedsomloop vrijkomen. Dit protocol introduceert een gespecialiseerde arterioveneuze bemonsteringstechniek die toegang geeft tot het veneuze vaatstelsel van interscapulaire BAT en systemische arteriële vasculatuur in C57BL/6J-muizen, die onlangs is ontwikkeld en gevalideerd door Park et al<s...

Bruin vetweefsel (BAT) bezit een unieke eigenschap van energieverbruik die bekend staat als niet-rillende thermogenese (NST), waarbij zowel mitochondriale ontkoppelingsproteïne 1 (UCP1)-afhankelijke als UCP1-onafhankelijke mechanismenbetrokken zijn 1,2,3,4,5. Deze onderscheidende kenmerken impliceren BAT bij de regulatie van het systemische metabolisme en de pathogenese van stofwisselingsziekten, waaronder obesitas, diabetes type 2, hart- en vaatziekten en kankercachexie 6,7,8. Recente retrospectieve studies hebben een omgekeerd verband aangetoond tussen BAT-massa en/of de metabole activiteit ervan met obesitas, hyperglykemie en cardiometabole gezondheid bij mensen 9,10,11.
Onlangs is BBT voorgesteld als een metabolische put die verantwoordelijk is voor het in stand houden van NST, aangezien het aanzienlijke hoeveelheden circulerende voedingsstoffen vereist als thermogene brandstof 6,7. Bovendien kan BAT bioactieve factoren genereren en afgeven, bruine adipokines of BATokines genoemd, die fungeren als endocriene en/of paracriene signalen, wat wijst op zijn actieve betrokkenheid bij metabole homeostase op systeemniveau 12,13,14,15. Daarom zou het begrijpen van het nutriëntenmetabolisme van BBT ons begrip van de pathofysiologische betekenis ervan bij mensen moeten vergroten, naast zijn conventionele rol als thermoregulerend orgaan.
Metabolomische studies waarbij gebruik wordt gemaakt van stabiele isotopentracers, in combinatie met klassieke nutriëntenopnamestudies met niet-metaboliseerbare radiotracers, hebben ons begrip van welke nutriënten bij voorkeur door BBT worden opgenomen en hoe ze worden gebruikt aanzienlijk verbeterd 16,17,18,19,20,21,22,23,24,2526,27. Radioactieve tracerstudies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat koud geactiveerde BAT glucose, lipoproteïne-gebonden vetzuren en vertakte aminozuren opneemt 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recente isotopentracering in combinatie met metabolomische studies heeft ons in staat gesteld om het metabole lot en de flux van deze voedingsstoffen in weefsels en gekweekte cellen te meten 24,25,26,28,29,30. Deze analyses richten zich echter voornamelijk op het individuele gebruik van voedingsstoffen, waardoor we beperkte kennis hebben van de rol van BAT op systeemniveau bij de uitwisseling van orgaanmetabolieten. Vragen over de specifieke reeks circulerende nutriënten die door BBT worden geconsumeerd en hun kwantitatieve bijdragen in termen van koolstof en stikstof blijven ongrijpbaar. Bovendien is het onderzoek naar de vraag of BAT metaboliet-afgeleide BATokines (bijv. lipokines) kan genereren en vrijgeven met behulp van voedingsstoffen nog maar net begonnen 12,13,14,15,31,32.
Arterioveneuze bloedanalyse is een klassieke fysiologische benadering die wordt gebruikt om de specifieke opname of afgifte van circulerende moleculen in organen/weefsels te beoordelen. Deze techniek is eerder toegepast op de interscapulaire BAT van ratten om zuurstof en verschillende metabolieten te meten, waardoor BAT de belangrijkste plaats van adaptieve thermogenese is geworden met zijn katabole potentieel 33,34,35,36,37. Onlangs werd een arterioveneuze studie met behulp van interscapulaire BAT bij ratten gekoppeld aan een trans-omics-benadering, wat leidde tot de identificatie van onontdekte BATokines die vrijkomen door thermogeen gestimuleerde BAT38.
Recente ontwikkelingen op het gebied van hooggevoelige gaschromatografie en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (GC-MS en LC-MS) gebaseerde metabolomics hebben de belangstelling voor arterioveneuze studies voor de kwantitatieve analyse van orgaanspecifieke metabolietuitwisseling opnieuw aangewakkerd 39,40,41. Deze technieken, met hun hoge oplossend vermogen en massanauwkeurigheid, maken de uitgebreide analyse van een breed scala aan metabolieten mogelijk met behulp van kleine monsterhoeveelheden.
In overeenstemming met deze vooruitgang heeft een recente studie met succes arterioveneuze metabolomics aangepast voor het bestuderen van BAT op muisniveau, waardoor de kwantitatieve analyse van metabolietuitwisselingsactiviteiten in BBT onder verschillende omstandigheden mogelijk is42. Dit artikel presenteert een BAT-gericht arterioveneuze metabolomics-protocol met behulp van GC-MS in een C57BL/6J-muismodel.

<table><tbody><tr><td>0.5-20 &micro;L Filter Tips</td><td>Axygen</td><td>AX.TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe met bijgevoegde naald - 26 G 5/8"</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 5977B GC/MSD (massa selectieve detector)</td><td>Agilent</td><td>G7077B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7693A Autosampler</td><td>Agilent</td><td>G4513A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 8890 GC Systeem</td><td>Agilent</td><td>G3542A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent J&amp;W GC kolom (Capillaire kolom) HP-5MS UI</td><td>Agilent</td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Kwantitatieve analyse(Quant-My-way)</td><td>Agilent</td><td>G3335-90240</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J muis</td><td>DBL</td><td>C57BL/6JBomTac</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -50 &deg;C Koude Vanger (met Roestvrijstalen Deksel)</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td>7811041</td><td></td></tr><tr><td>DL-Norvaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7502-25G</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Glazen inzet 250 &mu;L&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5181-1270</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS graad)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q34966-1L</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microvette&nbsp;200 Serum, 200 &micro;L, rode dop, vlakke bodem</td><td>Sarstedt</td><td>20.1290.100</td><td></td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>394882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine(watervrij, 99,8%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde CentriVap Complete Vaccum Concentrators</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td>7310041</td><td></td></tr><tr><td>Knaagdier dieet</td><td>SAFE</td><td>SAFE R+40-10</td><td></td></tr><tr><td>Knaagdier incubator</td><td>Power scientific</td><td>RIT33SD</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Fine Pen Naalden - 29 G 1/2"</td><td>BD Biosciences</td><td>328203</td><td></td></tr><tr><td>Flesdop 9 mm</td><td>Agilent</td><td>5190-9067</td><td></td></tr><tr><td>Flesje, ambr scrw wrtn 2 mL</td><td>Agilent</td><td>5190-9063</td><td></td></tr><tr><td>Flesje, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr></tbody></table>

arterioveneuze metabolomics om in vivo metabolietuitwisseling in bruin vetweefsel te meten

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

Bruin vetweefsel (BAT) speelt een cruciale rol bij het reguleren van metabole homeostase door middel van een uniek energieverbruiksproces dat bekend staat als niet-rillende thermogenese. Om dit te bereiken, maakt BAT gebruik van een gevarieerd menu van circulerende voedingsstoffen om de hoge metabolische vraag te ondersteunen. Bovendien scheidt BAT van metabolieten afgeleide bioactieve factoren af die kunnen dienen als metabole brandstoffen of signaalmoleculen, waardoor BAT-gemedieerde communicatie tussen weefsels en/of tussen weefsels wordt vergemakkelijkt. Dit suggereert dat BAT actief deelneemt aan de uitwisseling van systemische metabolieten, een interessant kenmerk dat begint te worden onderzocht. Hier introduceren we een protocol voor in vivo geoptimaliseerde BAT-arterioveneuze metabolomics op muisniveau. Het protocol richt zich op relevante methoden voor thermogene stimulaties en een arterioveneuze bloedafnametechniek met behulp van de ader van Sulzer, die selectief interscapulier BAT-afgeleid veneus bloed en systemisch arterieel bloed afvoert. Vervolgens wordt een op gaschromatografie gebaseerd metabolomics-protocol gedemonstreerd met behulp van die bloedmonsters. Het gebruik van deze techniek zou het inzicht in de uitwisseling van BBT-gereguleerde metabolieten op het niveau tussen organen moeten vergroten door de netto-opname en afgifte van metabolieten door BBT te meten.

Figuur 1 illustreert het experimentele schema van BAT-geoptimaliseerde AV-metabolomics. Zoals vermeld in de sectie Protocol, ondergaan muizen temperatuuracclimatisatie met behulp van knaagdierincubators om differentieel gestimuleerd bruin vetweefsel te verkrijgen of krijgen ze farmacologische toediening zoals β-adrenerge receptoragonisten. Vervolgens worden muizen verdoofd en worden bloedmonsters verzameld voor metabolomische analyse (Figuur 1A). Voor bloedafnam...

In dit protocol worden methoden geschetst die relevant zijn voor BAT-geoptimaliseerde arterioveneuze metabolomics met behulp van GC-MS in een muismodel. Deze methoden maken het mogelijk om waardevolle inzichten te verwerven in de uitwisseling van BBT-gemedieerde metabolieten op organismaal niveau.

Arterioveneuze metabolomics om in vivo metabolietuitwisseling in bruin vetweefsel te meten

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Ons lab is geïnteresseerd in het identificeren van mechanismen waarmee signaalroutes en metabole routes samenwerken om het metabolisme en de fysiologie van vetweefsel te reguleren. En met die aanpak willen we een manier vinden om stofwisselingsziekten veroorzaakt door energie-onevenwichtigheden zoals obesitas en diabetes te voorkomen of aan te pakken. Het grote voordeel van ons protocol is dat we zijn overgestapt van het conventionele rattenmodel naar het gebruik van een muismodel voor arteriële veneuze bloedafname en metabolomische analyse.Wij geloven dat deze overgang ons in staat zal stellen om onze bevindingen sneller te valideren met behulp van de gouden standaard genetische modellen voor onderzoek naar bruin vet.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De hier gepresenteerde methode gebruikt 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emissie tomografie / computertomografie (PET-CT) en vet-water gescheiden magnetische resonantie beeldvorming (MRI), elk afgetast na 2 uur blootstelling aan thermisch (24 ° C ) en koude omstandigheden (17 ° C) om bruin vetweefsel (BAT) bij volwassen proefpersonen kaart.

Human Brown VetWeefsel Depots automatisch gesegmenteerd op basis van Positron Emissie Tomografie / Computed Tomography en geregistreerde Magnetic Resonance Images

Met behulp van gratis, open-source software, hebben we een analytische aanpak om te kwantificeren van totale en regionale bruin vetweefsel (BAT) volume en metabole activiteit van BBT met 18F-FDG PET/CT.

Hele lichaam en regionale kwantificering van actieve mens bruin vetweefsel met 18F-FDG PET/CT

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

Functionele beeldvorming en kwantificering van thermogene vetdepots bij muizen met behulp van een micro-PET / MR-beeldvormingsgebaseerde benadering.

Visualisatie en kwantificering van bruine en beige vetweefsels bij muizen met behulp van [18F] FDG Micro-PET / MR Imaging

Dit manuscript beschrijft een protocol om de basale stofwisseling en de oxidatieve capaciteit van thermogene adipocyten bij zwaarlijvige muizen te meten.

Het bepalen van het basale energieverbruik en de capaciteit van thermogene adipocyten om energie te besteden aan zwaarlijvige muizen

Hier presenteren we een protocol om de fysiologische betekenis van de impact van bruin vetweefsel (BAT) activiteit op het menselijk metabolisme te kwantificeren. Dit wordt bereikt door koolhydraatbelasting en indirecte calorimetrie te combineren met metingen van supraclaviculaire temperatuurveranderingen. Deze nieuwe aanpak kan helpen bij het ontwikkelen van een farmacologisch doelwit voor BBT-thermogenese bij mensen.

Met behulp van een combinatie van indirecte calorimetrie, infraroodthermografie en bloedglucosespiegels om de thermogenese van bruin vetweefsel bij mensen te meten

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

Dit manuscript beschrijft hoe om te screenen op thermostabilizing mutaties, zuiveren de menselijke serotonine transporter, het genereren van antilichamen met hoge affiniteit, en kristalliseren de serotonine transporter antilichaam-complex gebonden aan het antidepressivum citalopram S. Dit protocol kan worden aangepast aan de studie van andere uitdagende membraantransporteiwitten, receptoren en kanalen.

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Het doel van het protocol is te bereiden keratine hydrolysaat van kippenveren door alkalische-enzymatische hydrolyse en om te testen of het toevoegen van keratine hydrolysaat in een cosmetica zalf basis verbetert de barrièrefunctie van de huid (verhooging hydratatie en afnemen van transepidermal waterverlies). Tests zijn uitgevoerd op mannen en vrouw vrijwilligers.

Voorbereiding van keratine hydrolysaat van kippenveren en haar toepassing in cosmetica

Ontdek arterioveneuze metabolomics voor bruin vetweefselonderzoek met GC-MS in muismodellen. Deze methode versnelt validatie van genetische modellen en biedt inzicht in metabole uitwisseling.

Arterioveneuze metabolomics om in vivo metabolietuitwisseling in bruin vetweefsel te meten

Meer video's verkennen