Name: Paradigmas voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer vijf gedragsparadigma's in Drosophila voor autismespectrumstoornisonderzoek, inclusief agressie-, social spacing-, courtship-, grooming- en habituatietests. Deze methoden kwantificeren gedragsdeficiënties nauwkeurig.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) en Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) enorm dankbaar voor de opstelling van de gewennings- en geurkeuzetest, Pavan Agrawal (MAHE) voor zijn waardevolle suggesties voor de agressietest, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) voor het delen van zijn prototype van de verkeringstestkamer en Fmr1-mutantenvlieglijnen, en Gaurav Das (NCCS, Pune) voor het delen van de MB247-GAL4-lijn. We danken Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, VS), National Institute of Genetics (NIG, Kyoto, Japan), Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, India) en National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, India) voor Drosophila-lijnen. Het werk in het laboratorium werd ondersteund door subsidies van SERB-DST (ECR/2017/002963) aan AD, DBT Ramalingaswami-fellowship toegekend aan AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) en institutionele steun van IIT Kharagpur, India. SD en SM ontvangen Ph.D. beurzen van CSIR-Senior Research Fellowship; PM ontvangt een Ph.D. fellowship van MHRD, India.

Drosophila Modellen voor genetische en gedragskenmerken van autismespectrumstoornis

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Drosophila wordt gebruikt als een fijn modelorganisme voor onderzoek naar menselijke neurologische aandoeningen vanwege een hoge mate van conservering van gensequenties tussen vlieg- en menselijke ziektegenen9. Talrijke robuuste gedragsparadigma's maken het een aantrekkelijk model voor het bestuderen van fenotypes die zich manifesteren in mutanten die menselijke ziekten recapituleren. Aangezien honderden genen betrokken zijn bij autismespectrumstoornis (ASS), bestaat er geen gemeenschappelijk ASS-model in een modelorganisme. Daarom moeten onderzoekers voor elke mutant eerst ASS-achtige fenotypes in de vlieg vaststellen. In dit artikel hebben we geprobeerd het proces te stroomlijnen door het gebruik van vijf vlieggedragsparadigma's in overleg voor een dergelijke beoordeling voor te stellen. Deze paradigma's worden bij vliegen gebruikt om belangrijke en vaak voorkomende gedragsstoornissen van menselijke ASS-patiënten te beoordelen: sociale en communicatiestoornissen, verbetering van repetitief gedrag en een gewenningsdefect. Als een mutatie in het vliegengen defecten vertoont in alle of de meeste van deze vijf paradigma's, kan dit een sterke aanwijzing zijn voor een ASS-achtig scenario.
De meeste van de hier beschreven gedragsparadigma's zijn in eerdere literatuur meerdere keren gebruikt voor het oplossen van uiteenlopende onderzoeksvragen. Het is niet ongebruikelijk om variaties in de technieken te vinden tussen verschillende onderzoeken. De aanpassingen in de technieken zijn gemaakt om aan te sluiten bij de onderzoeksbehoefte en om te voldoen aan de vraag van de specifieke vraag die wordt opgelost. In de verkeringstest kan bijvoorbeeld zowel aangeboren als aangeleerd baltsgedrag worden gekwantificeerd ten opzichte van een testvlieg die een onvolwassen mannetjevan 65 kan zijn, een maagdelijk vrouwtje66,67, een voorgedekt vrouwtje 68,69,70, een door bevriezing gedode maagdelijke vrouw van 65, of zelfs een onthoofd vrouwtje19. In de methode die in dit artikel wordt beschreven, zijn wildtype voorgedekte vrouwtjes gebruikt als tester om het baltspatroon van een mannelijke ASS-modelvlieg te controleren. De suitwendige ontvankelijkheid van een voorgedekt vrouwtje is relatief lager dan die van een maagdelijke vlieg71. Als gevolg hiervan zijn het aantal mannelijke verkeringsperiodes en hun duur meer in de richting van een gedekt vrouwtje dan in de richting van een maagd; Evenzo is de latentie tot copulatie ook langer dan die van maagdelijke testervrouwtjes, in welk geval vroege copulatie leidt tot een verminderde verkeringsindex, waardoor de ruimte voor effectieve vergelijking tussen genotypen wordt verkleind. Daarom biedt het gebruik van een gepremateerd vrouwtje als tester een betere vergelijkende analyse van het baltsgedrag van een ASS-vlieg versus een wildtype vlieg. Aan de andere kant kan het gebruik van maagdelijke vrouwtjes aanvullende informatie opleveren die kan worden gemaskeerd wanneer gedekte vrouwtjes worden gebruikt. Het gebruik van gedekte vrouwtjes kan ook het baltsgedrag van mannetjes beïnvloeden en veranderen. Kortom, er wordt gesuggereerd dat onderzoekers hun experimentele strategie en detail kiezen, afhankelijk van de noodzaak van het specifieke experiment.
Men moet hier voorzichtig zijn voordat men de techniek toepast in een of alle vlieghomologen van ASS-genen. Al deze gedragsparadigma's worden gereguleerd door een specifiek en klein aantal neuronen. De expressie van een bepaald gen moet eerst worden vastgesteld voordat wordt overgegaan tot een specifiek gedragsparadigma. Als de vlieghomoloog van een ASS-geassocieerd gen bijvoorbeeld niet tot expressie wordt gebracht in lichaamsneuronen van paddenstoelen of glutamaterge neuronen, dan worden verkerings- en verzorgingsgedrag mogelijk niet beïnvloed bij de mutant.
Een ander punt waar onderzoekers voorzichtig mee moeten zijn, is dat het ontbreken van een defect niet altijd betekent dat de mutatie geen rol speelt. Bijvoorbeeld, in de experimenten met vlooiengedrag met Fmr1-mutanten is het totale aantal vlooien niet significant lager bij mutanten dan bij controles, terwijl andere parameters zoals vlooienindex, enz. een defect in vlooiengedrag aantonen. Dit kan worden verklaard door de verlenging van elke verzorgingsperiode bij Fmr1-mutanten , wat resulteert in een laag aantal van de totale aanval, ondanks dat de totale duur van de aanval veel hoger is. Dit benadrukt de noodzaak van kwantificering van meerdere parameters voor elk gedragspatroon. Bovendien moet eraan worden herinnerd dat de term ASS een breed scala aan ziekten omvat die worden veroorzaakt door variaties in een van de honderden genen, wat resulteert in heterogene fenotypes met verschillende gradaties van penetrantie onder de getroffen individuen. Een gewenningstekort wordt bijvoorbeeld bij sommige patiënten waargenomen, maar niet bij alle. Hetzelfde zou worden verwacht in vliegmodellen van de ziekte.
Voor de analyse van agressief gedrag werd in deze studie rekening gehouden met verschillende soorten agressieve parameters: longeren, vleugeldreiging, worstelen, enz. (Figuur 1)30. Elke wedstrijd moet worden geïdentificeerd en geteld als een individueel type wedstrijd of als een totaal aantal wedstrijden. Het is belangrijk om eerst kennis te maken met de agressiepatronen van mannetjesvliegen, die zijn beschreven in 59,72 en weergegeven in Figuur 1. Bij het tellen van agressieve aanvalsnummers moeten het begin- en eindpunt van een enkele agressie-gebeurtenis duidelijk worden geïdentificeerd; Meerdere soorten agressiepatronen kunnen worden getoond binnen een enkele wedstrijd, gevolgd door het einde van de wedstrijd. Een agressieaanval wordt als voorbij beschouwd wanneer een vlieg ofwel stopt met het vertonen van agressief gedrag of beweging gedurende 2 seconden of de aanval stopt en begint weg te lopen.
De meeste van deze gedragsparadigma's hebben meerdere variaties en ontwikkelingen die door meerdere laboratoria zijn beschreven. Elk van de specifieke aanpassingen was gemaakt om te voldoen aan de behoeften van een specifiek doel. Evenzo hebben geautomatiseerde en op algoritmen gebaseerde kwantificerings- of analysetechnieken deze technieken bevrijd van de kans op handmatige fouten. In dit artikel zijn de meest basale technieken gedemonstreerd met de minste materiaalvereisten, in de hoop dat deze technieken gemakkelijk kunnen worden overgenomen en gebruikt door een maximaal aantal onderzoekers.

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) omvat een heterogene groep van neurologische aandoeningen. Het omvat een reeks complexe neurologische ontwikkelingsstoornissen die worden gekenmerkt door multicontextuele en aanhoudende tekorten in sociale communicatie en sociale interactie en de aanwezigheid van beperkte, repetitieve gedrags- en activiteitspatronen en interesses1. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) wordt wereldwijd 1 op de 100 kinderen gediagnosticeerd met ASS met een man-vrouwverhouding van 4,22. De ziekte wordt duidelijk in het tweede of derde levensjaar. ASS-kinderen tonen een gebrek aan interesse in sociaal-emotionele wederkerigheid, non-verbale communicatie en relatievaardigheden. Ze vertonen repetitief gedrag zoals stereotiepe motorische bewegingen, onbuigzame en geritualiseerde routinematige volgorde, en intense focus op beperkte interesses. ASS-kinderen vertonen een hoge mate van respons op aanraking, geur, geluid en smaak, terwijl pijn- en temperatuurrespons relatief laag is1. De penetrantie van deze aandoening is ook verschillend tussen verschillende patiënten die lijden aan ASS en daarom neemt de variabiliteit toe.
De huidige klinische diagnose van ASS is gebaseerd op gedragsbeoordeling van de individuen, aangezien er geen bevestigende, op biomarkers gebaseerde of gemeenschappelijke genetische test is die alle vormen vanASS omvat. Het ontcijferen van de genetische en neurofysiologische basis zou nuttig zijn bij het richten van behandelingsstrategieën. In het afgelopen decennium heeft een grote hoeveelheid onderzoek geresulteerd in de identificatie van honderden genen die zijn verwijderd of gemuteerd of waarvan de expressieniveaus zijn veranderd bij ASS-patiënten. Lopend onderzoek benadrukt de validatie van de bijdrage van deze kandidaat-genen met behulp van modelorganismen zoals de muis of fruitvlieg, waarbij deze genen worden uitgeschakeld of uitgeschakeld, gevolgd door tests voor ASS-achtige gedragsstoornissen en opheldering van onderliggende genetische en moleculaire routes die de anomalieën veroorzaken. Een muismodel dat Copy Number Variations (CNV's) recapituleert in de menselijke chromosomale loci 16p11.2 toont enkele van de ASS-gedragsdefecten 4,5,6. Prenatale blootstelling aan een teratogeen geneesmiddel, valproïnezuur (VPA) is een ander muismodel dat eigenschappen vertoont die lijken op menselijke ASS 7,8. Daarnaast bestaat er een reeks muismodellen die genetisch syndroom-geassocieerd autisme vertonen, bijvoorbeeld syndromale modellen met één gen veroorzaakt door mutaties in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c en niet-syndromale modellen met één gen veroorzaakt door mutaties in genen zoals Cntnap2, Shank, Neurexine of Neuroligin-genen 5.
Fruitvlieg (Drosophila melanogaster) is een ander prominent modelorganisme voor het bestuderen van de cellulaire, moleculaire en genetische basis van een overvloed aan menselijke aandoeningen9, waaronder ASS. Drosophila en mensen delen sterk geconserveerde biologische processen op moleculair, cellulair en synaptisch niveau. Fruitvliegjes zijn met succes gebruikt in ASS-studies 10,11,12 om genen te karakteriseren die verband houden met ASS en hun exacte rol te ontcijferen bij synaptogenese, synaptische functie en plasticiteit, neurale circuitassemblage en rijping; vlieghomologen van ASS-geassocieerde genen bleken een rol te spelen bij de regulatie van sociaal en/of repetitief gedrag 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. De fruitvlieg heeft ook gewerkt als model voor de screening van ASS-genen en hun varianten 15,22,23. De grootste uitdaging in ASS-onderzoek bij vliegen is dat er, in tegenstelling tot andere ziektemodellen, niet één ASS-vliegmodel is. Om de impact van mutaties of het uitschakelen van een specifiek ASS-gen te begrijpen, moet een onderzoeker valideren of de gedragsfenotypes de symptomen van ASS-patiënten voldoende nabootsen en vervolgens doorgaan met het begrijpen van de moleculaire of fysiologische onderbouwing van de fenotypes.
Daarom is de detectie van ASS-achtige fenotypes van vitaal belang voor ASS-onderzoek in het vliegenmodel. In de loop der jaren zijn er een handvol gedragstechnieken ontstaan die ons in staat stellen om afwijkingen op te sporen, zoals tekorten in sociaal gedrag/interactie, communicatie, repetitief gedrag en reactievermogen op stimuli. Bovendien zijn er in verschillende laboratoria verschillende aanpassingen en upgrades van deze gedragstechnieken doorgevoerd om aan specifieke eisen te voldoen, zoals opschaling, automatisering van assays, uitlezingen, kwantificering en vergelijkingsmethoden. In dit video-artikel worden de meest basale versies van vijf gedragsparadigma's gedemonstreerd, die in combinatie kunnen worden gebruikt om ASS-achtige gedragsuitkomsten op de gemakkelijkste manier te detecteren.
Agressie is een evolutionair geconserveerd aangeboren gedrag dat overleving en voortplanting beïnvloedt24. Agressief gedrag ten opzichte van soortgenoten wordt beïnvloed door 'motivatie voor socialisatie'25,26 en 'communicatie'27, die beide in het gedrang komen bij personen met ASS. Agressief gedrag is goed beschreven in Drosophila en de kwantificeerbaarheid ervan door de robuuste agressietest 28,29,30 en een goed begrepen genetische en neurobiologische basis 31 maakt het een geschikt gedragsparadigma32 voor het beoordelen van het ASS-fenotype in een vliegmodel. Agressie wordt beïnvloed door sociaal isolement, weg van een sociale omgeving, wat leidt tot verhoogde agressie; Hetzelfde is waargenomen wanneer mannetjesvliegen een paar dagen in afzondering worden gehuisvest33,34. Een andere gedragstest die de sociabiliteit bij vliegen kwantificeert, is de Social Space Assay35, die afstanden meet tussen naaste buren en interfly-afstanden in een kleine groep vliegen, waardoor het perfect geschikt is voor het testen van de rollen van ASS-genorthologen in vlieg 12,21,36,37 evenals door het milieu geïnduceerde ASS-vliegmodellen 38, 39. okt.
De Drosophila-verkeringstest is een ander gedragsparadigma dat vaak wordt gebruikt om te testen op verandering in sociale en communicatieve vaardigheden bij circuit of genetische manipulatie, inclusief autisme-gerelateerde genen 18,19,21,40. Repetitieve gedragspatronen komen veel voor bij ASS-patiënten, wat bij vliegen wordt gerecapituleerd door verzorgingsgedrag - een reeks afzonderlijke, stereotiepe acties die worden uitgevoerd voor schoonmaken en andere doeleinden. Het is met succes gebruikt om de impact van ASS-genmutaties bij vliegente testen 21,41, evenals blootstelling aan chemicaliën38,39. Meerdere ontwikkelingen en automatisering in de test zijn beschreven vóór 16,41,42,43; Hier demonstreren we het meest elementaire testpatroon, dat gemakkelijk kan worden aangenomen en gekwantificeerd.
Het is bekend dat ASS bij sommige patiënten invloed heeft op het vermogen tot gewenning, leren en geheugen 44,45,46,47,48,49,50, ASS-modelorganismen 51,52 en veroorzaakt ook tekorten in verschillende olfactorische gedragingen50. Drosophila light-off jump habituation is eerder gebruikt om te screenen op ASS-genen23. Gewenning kan worden getest met een eenvoudige methode van olfactorische gewenningstest 53,54,55. We beschrijven de methode om olfactorische gewenning te induceren en testen de uitkomst met behulp van een klassieke, op Y-doolhof gebaseerde binaire geurkeuzetest56 die kan worden gebruikt om defecten in gewenning te detecteren bij ASS-genmutant of genknockdown-aandoening. Om te beoordelen of de impact van een mutatie (of gen knock-down) of een farmacologische behandeling op het gedrag van een vlieg neerkomt op een ASS-achtig fenotype, kan men een combinatie van deze 5 hier beschreven testen gebruiken.

<table><tbody><tr><td>Aggression arena:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standaard 24-wellplaat gemaakt van transparant polystyreen</td><td></td><td></td><td>12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter van een enkele well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; diepte = 1 cm</td></tr><tr><td>Transparante plastic/acrylplaat</td><td></td><td></td><td>Alternatief: een geperforeerd deksel van een celkweekplaat</td></tr><tr><td>Social Space Assay:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binderclips</td><td></td><td></td><td>19 mm</td></tr><tr><td>Glas- en acrylplaten van aangepaste maten</td><td></td><td></td><td>Dikte = 5 mm</td></tr><tr><td>Courtship assay:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moer en bout met schroefdraad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perspexplaten van aangepaste vormen</td><td></td><td></td><td>i) Deksel: Een op maat gemaakte ronde transparante Perspex-schijf (2-3 mm dikte, 70 mm diameter) met een laadgat in de perifere regio en een tweede schroefgat in het midden (diameter ~ 3 mm voor elk); ii) Een tweede transparante dikkere Perspex-schijf (3-4 mm dikte, 70 mm diameter), met 6-8 perforaties met een diameter van 15 mm, gelijkmatig verdeeld vanaf het centrum; iii) Basis: Hetzelfde als het deksel, behalve zonder het laadgat</td></tr><tr><td>Grooming assay:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diffuus met glas bedekte LED-paneel</td><td></td><td></td><td>10&ndash;15-Watt plafondmontage LED-paneel</td></tr><tr><td>Habituatie en Y-labyrint assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klimkamers</td><td></td><td></td><td>x2, Borosilicaatglas</td></tr><tr><td>Adapter voor het aansluiten van Y-labyrint met invoerviaal</td><td></td><td></td><td>Perspex, op maat gemaakt, metingen in Figuur 5A</td></tr><tr><td>Duidelijke reagentiaflesjes</td><td></td><td></td><td>Borosil #1500017</td></tr><tr><td>Gaswasstopper</td><td></td><td></td><td>Borosil #1761021</td></tr><tr><td>Glasbuisje</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x Hoogte= 85 mm; Borosilicaatglas</td></tr><tr><td>Geurmiddel (Ethyl Butyraat)</td><td></td><td></td><td>Merck #E15701</td></tr><tr><td>Paraffinewas (vloeibaar) licht</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>Rollerklemmen</td><td></td><td></td><td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>Siliconen buizen</td><td></td><td></td><td>OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; rollerklemmen voor stroomcontrole</td></tr><tr><td>Vacuümpomp</td><td></td><td></td><td>Hana #HN-648 (Elke aquariumpomp met manuele stroomrichtingsomkering)</td></tr><tr><td>Y-labyrint</td><td></td><td></td><td>Borosilicaatglas</td></tr><tr><td>Y-vormige glazen buis (borosilicaatglas)</td><td></td><td></td><td>Op maat gemaakt, metingen in Figuur 5A</td></tr><tr><td>Algemene items:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elke software voor videoweergave (bijv. VLC media player)</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>Computer voor videogegevensanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vliegblikjes</td><td></td><td></td><td>OD= 60 mm x Hoogte= 140 mm; glas/polypropyleen</td></tr><tr><td>Vliegbuisjes</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x Hoogte= 85 mm; Borosilicaatglas</td></tr><tr><td>Graph-pad Prism-software</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr><tr><td>ImageJ-software</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videocamera met videorecorder-setup</td><td></td><td></td><td>Een camcorder of een mobiele telefooncamera zal werken</td></tr><tr><td>Voor Fly Aspirator:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katoen</td><td></td><td></td><td>Absorbeerbaar, geautoclaveerd</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Sigma-aldrich #P7793</td></tr><tr><td>Pipettipjes</td><td></td><td></td><td>200 &micro;L of 1000 &micro;L, kies afhankelijk van de buitendiameter van de siliconenbuis</td></tr><tr><td>Siliconen/rubberbuis</td><td></td><td></td><td>lengte= 30-50 cm. De buis moet geurloos zijn</td></tr><tr><td>Samenstelling van vliegvoer:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingrediënten (hoeveelheid voor 1 L voer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar (8 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)</td></tr><tr><td>Maïsmeel (80 g)</td><td></td><td></td><td>Organisch, lokaal betrokken</td></tr><tr><td>D-Glucose (20 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)</td></tr><tr><td>Propionzuur (4 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)</td></tr><tr><td>Sucrose (40 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)</td></tr><tr><td>Tego (Methyl para hydroxy benzoaat) (1,25 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)</td></tr><tr><td>Gistpoeder (10 g)</td><td></td><td></td><td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td>Vlieglijnen gebruikt in de experimenten in deze studie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wild type (Canton S of CS)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 64349</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>BDSC # 3605</td></tr><tr><td>w[1118]; Fmr1[&Delta;50M]/TM6B, Tb[+]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>w[*]; Fmr1[&Delta;113M]/TM6B, Tb[1]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>LN1-GAL4</td><td></td><td></td><td>NP1227, NP consortium, Japan</td></tr><tr><td>row-shRNA</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

paradigma's voor gedragsbeoordeling in het drosophila-model van autismespectrumstoornis

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

Autismespectrumstoornis (ASS) omvat een heterogene groep neurologische ontwikkelingsstoornissen met veel voorkomende gedragssymptomen, waaronder tekorten in sociale interactie en het vermogen om te communiceren, verbeterd beperkt of repetitief gedrag, en ook, in sommige gevallen, leerstoornissen en motorische stoornissen. Drosophila heeft gediend als een ongeëvenaard modelorganisme voor het modelleren van een groot aantal menselijke ziekten. Omdat veel genen betrokken zijn bij ASS, zijn fruitvliegjes naar voren gekomen als een krachtige en efficiënte manier om de genen te testen die vermoedelijk betrokken zijn bij de aandoening. Aangezien honderden genen, met verschillende functionele rollen, betrokken zijn bij ASS, is een enkel genetisch vliegmodel van ASS onhaalbaar; in plaats daarvan zijn individuele genetische mutanten, gen-knockdowns of op overexpressie gebaseerde studies van de vlieghomologen van ASS-geassocieerde genen de gebruikelijke middelen om inzicht te krijgen in moleculaire routes die ten grondslag liggen aan deze genproducten. Er zijn tal van gedragstechnieken beschikbaar in Drosophila die het gemakkelijk maken om tekorten in specifieke gedragscomponenten af te lezen. Het is aangetoond dat sociale ruimtetest en agressie- en baltstests bij vliegen nuttig zijn bij het beoordelen van defecten in sociale interactie of communicatie. Verzorgingsgedrag bij vliegen is een uitstekende uitlezing van repetitief gedrag. Gewenningstest wordt gebruikt bij vliegen om het vermogen tot gewenningsleren te schatten, dat bij sommige ASS-patiënten wordt aangetast. Een combinatie van deze gedragsparadigma's kan worden gebruikt om een grondige beoordeling te maken van de menselijke ASS-achtige ziektetoestand bij vliegen. Met behulp van Fmr1-mutante vliegen, het recapituleren van het Fragile-X-syndroom bij mensen en POGZ-homologe row-knockdown bij vliegneuronen, hebben we kwantificeerbare tekorten aangetoond in sociale afstand, agressie, baltsgedrag, verzorgingsgedrag en gewenning. Deze gedragsparadigma's worden hier in hun eenvoudigste en ongecompliceerde vorm gedemonstreerd, in de veronderstelling dat het het wijdverbreide gebruik ervan voor onderzoek naar ASS en andere neurologische ontwikkelingsstoornissen in vliegmodellen zou vergemakkelijken.

Agressie test Als ASD-model voor vliegen zijn Fmr1-mutante vliegen63,64 gebruikt. w1118 mannetjes werden gebruikt als controle en Fmr1 trans-heterozygoot Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 mannetjes als experimentele vliegen; Volwassen mannetjes werden gedurende 5 dagen in isolatiebuizen gehuisvest. Homotypische mannetjes (zelfde genotype, zelfde huisvestingsomstandigheden) werden geïntroduceerd in de agressie-arena en hun gedrag werd gedurende 20 minuten geregistreerd. Het totale aantal agressieve aanvallen in 20 minuten werd geteld voor elk genotype. Het aantal agressieve aanvallen gedurende 20 minuten bleek significant verminderd te zijn in het geval van gemuteerde mannetjes dan in de controlemannetjes (Figuur 1E). Deze verminderde agressiviteit bij Fmr1-vliegen kan te wijten zijn aan verminderde interesse in sociale interactie met een andere vlieg. Daarentegen vertonen groeps-/sociaal gehuisveste Fmr1-mutante mannetjesvliegen vergelijkbare aantallen agressieaanvallen als die van sociaal gehuisveste w1118-vliegen (gegevens niet getoond), wat waarschijnlijk wijst op een positieve rol van de sociale omgeving bij de inductie van sociaal gedrag.
Sociale ruimte-test De sociale ruimtetest werd uitgevoerd in w1118 en ASD-model (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M) vliegen. De afstand tot de dichtstbijzijnde buur werd voor elke vlieg berekend en voor elk genotype werden 10 biologische replicaten uitgevoerd. De gemuteerde vliegen vertonen significant grotere afstanden tot de dichtstbijzijnde buren dan de controle-tegenhangers (Figuur 2D), wat wijst op een voorkeur voor een grotere afstand tot andere vliegen.
Verkeringstest De baltstest van mannetjesvliegen met één huis werd uitgevoerd om het aangeboren baltsgedrag van twee afzonderlijke ASS-modelvliegen te kwantificeren. Eerst werd het baltsgedrag van Fmr1 transheterozygote vliegen vergeleken met dat van w1118; Fmr1-vliegen vertoonden een significant lagere baltsindex en een verminderd aantal pogingen tot copulatie (Figuur 3E1). In een tweede experiment, rij, werd een Drosophila-ortholoog van het menselijke POGZ-gen (een veel voorkomend ASS-risicogen20), uitgeschakeld door een microRNA met een korte haarspeld tegen rij tot expressie te brengen in neuronen van het paddenstoelenlichaam met behulp van de MB247-GAL4-driverlijn. Deze row-knockdown ASD-modelvliegen werden getest op elk defect in het aangeboren baltspatroon; De verkeringsindex en het aantal pogingen tot copulatie werden berekend op basis van video's van 15 minuten. De rij knockdown vliegen vertoonden een significant verminderde baltsindex en tellingen van pogingen tot copulatie (Figuur 3E2), wat wijst op hun gebrekkige communicatie met vrouwtjes.
Grooming gedrag Grooming-gedrag wordt gebruikt als uitlezing voor repetitief gedrag in Drosophila 16,42,43. Het verzorgingsgedrag werd gekwantificeerd in Fmr1 transheterozygote vliegen en vergeleken met dat van w1118. De latentie tot de eerste vachtverzorging is significant afgenomen bij Fmr1-vliegen, terwijl de gemiddelde duur van de vachtperiode en de vachtindex significant zijn verhoogd bij Fmr1-vliegen (Figuur 4C), wat wijst op verbeterd vlooigedrag (of repetitief) gedrag bij ASS-modelvliegen. Daarentegen bleek het totale aantal vlooien bij de gemuteerde vliegen niet significant te zijn veranderd in vergelijking met dat van controlevliegen.
Olfactorische gewenningstest Gewenning blijkt defect te zijn bij een groot aantal autistische personen en het kan worden gebruikt als een test voor hetzelfde in Drosophila23. Hier werd olfactorische gewenning getest in het ASS-model door een rij neer te halen in olfactorische lokale interneuronen aangedreven door LN1-GAL4. Een aversieve geurstof, 20% ethylbutyraat, is in deze experimenten gebruikt om gewenning bij deze vliegen op te wekken. De resultaten laten zien dat row-knockdown vliegen niet gewend raakten na een 3-daagse blootstelling aan geurstof (de laatste twee balken in de grafiek in Figuur 5E laten geen significant verschil zien tussen naïeve versus gewende vliegen) in vergelijking met wildtype, vliegen die typische gewenning vertonen na blootstelling aan ethylbutyraat gedurende 3 dagen (blootgestelde vliegen vertonen een significante daling van de prestatie-index in vergelijking met naïeve vliegen). Dit geeft aan dat row-knockdown vliegen niet gewend raken na blootstelling aan ethylbutyraat gedurende 3 dagen en worden afgestoten door de weerzinwekkende geurstof, wat bewijst dat deze ASS-vliegen een gewenningstekort hebben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg"> Figuur 1: Agressie-arena en representatieve gedragspatronen. (A) De opstelling van de agressie-arena in een plaat met 24 putjes en een geperforeerd deksel voor het betreden van vliegen. Inzet: Afmetingen van een enkele arena met vliegenvoer erin. (B) Foto van een buis met één behuizing met een enkele, geïsoleerde mannetjesvlieg en een flesje met groepshuisvesting met mannelijke en vrouwelijke vliegen, die een sociale omgeving recapituleert. (C) Een aspirator voor het overbrengen van vliegen via mondaspiratie. Items die nodig zijn voor het monteren van een vliegenzuiger, met vermelding van de zijkanten van de buis voor het binnendringen van vliegen (vlieguiteinde) en de kant die in de mond zou worden ingebracht (monduiteinde) (C1) en een gemonteerde vliegaspirator (C2). (D) Representatieve man-man agressieve gedragspatronen: benadering, vleugeldreiging, schermen, vasthouden, longeren, boksen en worstelen. (E) Fmr1 mutante mannetjesvliegen vertonen minder agressief gedrag ten opzichte van andere mannetjes in vergelijking met controles. Boxplot met het aantal agressieve aanvallen voor sociaal geïsoleerde mannetjes van w1118 (controle) versus Fmr1 transheterozygote vliegen (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg"> Figuur 2: Opstelling van de sociale ruimte-assay arena. (A) Diagram met de afmetingen en opstelling van glasplaten en acrylafstandhouders. (B) De uiteindelijke opstelling van de arena-componenten waarbij de acrylafstandhouders tussen de glasstukken zijn ingeklemd, waardoor er aan de onderkant een kleine opening overblijft voor het binnendringen van vliegen. De driehoekige ruimte die ontstaat tussen glasstukken en afstandhouders is de SSA-arena voor de vliegen, hier kunnen vliegen alleen in twee dimensies bewegen. (C) Foto van de uiteindelijke opstelling van de SSA-arena met vliegen in de kamer. Afkorting: SSA = social space array. (D) ASS-model (Fmr1 transheterozygote) vliegen vertonen een grotere afstand tot elkaar in de sociale ruimtetest in vergelijking met w1118. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg"> Figuur 3: Verkeringsarena en representatieve gedragspatronen. Diagrammen met (A) ontwerp en (B) opstelling van de schijven in een baltstestarena. (C) Foto van de baltsarena na de definitieve regeling. (D) Representatieve afbeeldingen die de verkeringsgedragspatronen van een naïef mannetje ten opzichte van een gedekt vrouwtje laten zien: jagen, oriëntatie, flikkeren van de vleugels, likken, poging tot copulatie en copulatie. (E) Grafieken met de baltsindex en het aantal pogingen tot copulatie in twee ASD-modellen: (E1) Fmr1-mutante vliegen vertonen een significante vermindering van de baltsindex en poging tot copulatie in vergelijking met w1118-controle . (E2) row knockdown-vliegen werden gebruikt als een ander ASS-model waarbij row-shRNA tot expressie werd gebracht in neuronen van paddenstoelen(MB247-GAL4); Een significante vermindering van het baltsgedrag werd waargenomen bij het neerhalen van de rij. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg"> Figuur 4: Opstelling van de arena en representatieve gedragspatronen van verzorgingsgedrag. (A) De schijf- of wielvormige arena (dezelfde baltsarena weergegeven in figuur 3) is opgesteld op een LED-paneel met een diffuser voor uniforme verlichting vanaf de onderkant en de video is van bovenaf vastgelegd. Dit zorgt voor een hoger contrast dat nodig is voor het identificeren van fijne bewegingen van aanhangsels tijdens het trimmen. (B) Foto's van verzorgingsgedragspatronen die zijn waargenomen bij volwassen mannelijke vliegen. T1 = 1paar poten, T2 = 2e paar poten, T3 = derde paar poten. Intuïtieve verkorte nomenclatuur wordt gebruikt voor verzorgingspatronen in B: T1-hoofd = hoofd gewreven met de eerste poten; T1-T1 = eerste paar benen tegen elkaar gewreven, enzovoort. Afkorting: LED = light-emitting diode. (C) Grafieken met de resultaten van de vachttest uitgevoerd bij Fmr1 transheterozygote vliegen en vergeleken met w1118. Fmr1-mutante vliegen vertoonden een significant verminderde latentie voor de eerste verzorgingsperiode, wat wijst op een vroege start van de vachtverzorging in vergelijking met de controlegroep. Bovendien waren de gemiddelde duur van de vachtperiode en de vlooienindex significant verhoogd bij Fmr1-mutanten , wat wijst op verbeterd repetitief gedrag bij ASS-modelvliegen. Daarentegen was het totale aantal vlooien niet significant veranderd bij de gemuteerde vliegen in vergelijking met de controlegroep. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg"> Figuur 5: Inductie- en testopstelling voor olfactorische gewenning en representatief resultaat na de test. (A) Componenten van de binaire geurkeuzetestopstelling: (A1) het Y-doolhof, (A2) de adapter, (A3) de opstelling van deze twee, (A4) een paar verzamelbuisjes voor bevestiging aan de bovenkant van de Y-doolhofarmen, (A5) de glazen fles en glazen buisjes voor het bewaren van de geuroplossing of het water waardoor lucht zal borrelen voordat het naar het Y-doolhof gaat. (B) Opstelling van de vliegvoedselfles voor inductie van olfactorische gewenning; cartoondiagram (B1) laat zien hoe de geurstofhoudende microfuge-buis halverwege de fles aan een koperdraad wordt gehangen; (B2) ten slotte wordt de opening van de fles afgedekt met katoen en verzegeld met bruine papieren enveloppen. (C) Foto van de totale opstelling van de Y-doolhofopstelling. (D) Foto's van de verspreiding van vliegen in verzamelkamers na afloop van een experiment. (D1) Naïeve vliegen (alleen blootgesteld aan geurloze paraffine, controle) vertonen afkeer van de aversieve geurstof (20% ethylbutyraat gebruikt voor inductie van gewenning in deze studie) en kiezen in de arm van het Y-doolhof gevuld met gewone lucht, terwijl (D2) blootgestelde (gewone) vliegen gelijkmatig over beide armen verdelen. Afkorting: ID = inwendige diameter. (E) Olfactorische gewenningstestresultaten van row-knockdown vliegen vertoonden een gewenningsdefect. Vliegen van het wilde type (Canton S) vertoonden na 3 dagen blootstelling aan ethylbutyraat een significante vermindering van de prestatie-index in vergelijking met naïeve vliegen, wat wijst op gewenning. Wanneer nakomelingen van LN1-GAL4 x row-shRNA-vliegen gedurende 3 dagen werden blootgesteld, bleek de prestatie-index niet significant te verschillen van die van naïeve vliegen; dit toont aan dat deze row-knockdown-vliegen niet gewend raakten aan 3-daagse blootstelling aan geurstof, wat een menselijk ASS-achtig symptoom recapituleert. Afkortingen: ASS = autisme spectrum stoornis; shRNA = kort haarspeld-RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) wordt geassocieerd met verminderd sociaal en communicatief gedrag en het ontstaan van repetitief gedrag. Voor het bestuderen van de onderlinge relatie tussen ASS-genen en gedragsstoornissen in het Drosophila-model , worden in dit artikel vijf gedragsparadigma's beschreven voor het bepalen van sociale afstand, agressie, verkering, verzorging en gewenningsgedrag.

Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

Autismespectrumstoornis treft kinderen, wat leidt tot verminderde communicatie, sociaal gedrag en verbeterd repetitief gedrag. Drosophila is een steeds populairder wordend model voor autismeonderzoek om onderliggende moleculaire routes te ontcijferen. We beschrijven een set standaardtechnieken voor gedragskarakterisering van vliegenautismemodellen.Voor het decoderen van de moleculaire onderbouwing van autismespectrumstoornis bij vliegen, moeten de gedragsmanifestaties ervan nauwkeurig worden vastgesteld. Het kwantificeren van menselijke gedragskenmerken van autisme bij Drosophila melanogaster is een behoorlijk uitdagende taak. Er is geen enkel gedragsparadigma bij vliegen dat alle gedragsafwijkingen van deze aandoening aanpakt.We hebben een reeks van vijf gevestigde gedragsparadigma's in Drosophila beschreven, namelijk agressietest, sociale ruimtetest, vachtvorm, verzorging en gewenningstest. Al deze kunnen worden gebruikt in ASS-vliegmodellen om het niveau van stoornissen in communicatief gedrag, repetitief gedrag en sociaal gedrag te karakteriseren en te kwantificeren. We hebben deze vijf technieken in hun eenvoudigste vorm beschreven, zodat elk laboratorium met een minimale vliegonderzoeksfaciliteit ze gemakkelijk kan toepassen en experimenten kan uitvoeren op het vliegmodel van een autismespectrumstoornis, en kan bijdragen aan de vooruitgang van ons begrip van deze ziekte.

paradigms-for-behavioral-assessment-drosophila-model-autism-spectrum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we een protocol om de vermijding van gestreste individuen te kwantificeren. Dit paradigma is krachtig maar gebruiksvriendelijk en kan worden gebruikt om de invloed van genen en omgeving op een soort sociale interactie bij Drosophila melanogaster te beoordelen.

Ongecompliceerd Assay voor de kwantificering van Sociale Avoidance in Drosophila melanogaster

Gecompliceerdere, beperkte, repetitieve gedragingen (RRB's) verstoren het leven van getroffen individuen. Dit gedrag is moeilijk te modelleren bij knaagdieren, waardoor fundamenteel biomedisch onderzoek naar mogelijke behandelingen of interventies voor RRB's moeilijk wordt. Hier beschrijven we de exploratie van nieuwe objecten als een potentiële test voor complexere RRB's bij muizen.

Novel Object Exploration als een potentiële test voor hogere orde repetitief gedrag in Muizen

Knaagdiermodellen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van kerngedrag dat verband houdt met autismespectrumstoornis (ASS). In dit artikel gaan we dieper in op twee gedragstests voor het modelleren van de kernkenmerken van ASS bij muizen: zelfverzorging, die repetitief gedrag beoordeelt, en de driekamertest voor sociale interactie, die sociale beperkingen documenteert.

Strategieën voor het beoordelen van autistisch-achtig gedrag bij muizen

De procedure beschreven in dit protocol laat zien dat testosteron administratie en folk overtuigingen over testosteron kan gepaard gaan met direct tegenover sociaal gedrag.

De combinatie van Behavioral Endocrinologie en Experimentele Economie: Testosteron en Sociaal Decision Making

Het testen van β-amyloïde toxiciteit met behulp van een transgene C. elegans Model

Als handvaardigheid is een voorrecht vooral primaten, zijn gedrag taken ontwikkeld in makaken. Vier te bereiken en te begrijpen grijpfunctie taken, het meten van de hand manipulatie vermogen en kracht, laat het functioneel herstel tot stand na een laesie van het centrale zenuwstelsel en het effect van een behandeling te testen.

Behavioral Assessment van de handvaardigheid in de niet-menselijke primaten

Reageert voor voedsel of drug-gepaarde signalen toeneemt in de loop van een periode van onthouding en dit kan betrekking hebben op een verhoogde gevoeligheid voor terugval gedrag. Hier hebben we een detail procedure voor het beoordelen van deze "incubatie van craving" bij ratten die in eigen beheer sucrose hebben.

Een algemene methode voor het evalueren van Incubatie van sucrose Craving in ratten

Circadiane ritmes in vrijwillige wiel lopende activiteit bij zoogdieren zijn nauw gekoppeld met de moleculaire oscillaties van een moederklok in de hersenen. Als zodanig kunnen deze dagelijkse ritme in gedrag worden gebruikt om de invloed van genetische, farmacologische en omgevingsfactoren op de werking van deze circadiane klok bestuderen.

Registratie en analyse van circadiane ritmen bij Running-wheel activiteit in knaagdieren

Dit protocol beschrijft een eenvoudige, kosteneffectieve manier om individueel Drosophila of andere insecten te identificeren. Demonstratiegegevens die het succes van het paren onderzoeken over drie soorten Drosophila laten zien dat deze methode vergelijkbaar of beter is dan het gebruik van CO2 anesthesie.

Verven Insecten for Behavioral Testen: het paargedrag van verdoofde<em&gt; Drosophila</em

Om nieuwe mutaties die de mechanosensatie beïnvloeden te identificeren, ontwierpen we een test die de gedragsreactie op tactiele stimulatie van vliegborsten meet in mutante klonen die gegenereerd zijn door de MARCM-methode. De combinatie van technieken maakt het mogelijk om mechanogevoelige mutaties te identificeren die anders dodelijk zouden zijn.

Een Behavioral Assay voor Mechanosensation van MARCM-gebaseerde klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Leer vijf gedragsparadigma's in Drosophila voor autismespectrumstoornisonderzoek, inclusief agressie-, social spacing-, courtship-, grooming- en habituatietests. Deze methoden kwantificeren gedragsdeficiënties nauwkeurig.

Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis

Meer video's verkennen