Basement Membrane Matrix Ingekapselde Celaggregatie voor het onderzoeken van de vorming van miltweefsel bij muizen

Het algemene doel van dit protocol is om cellen samen te voegen en in te kapselen in een halfvaste matrix. Ingebedde celaggregaten kunnen vervolgens stroomafwaarts worden gebruikt in driedimensionale in-vitrokweek of als vehikel voor in vivo transplantatie-experimenten. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het een eenvoudige methodologie en apparatuur gebruikt om celaggregatie te bereiken.

Het kan ook worden toegepast op een reeks celtypen en nummers. Deze techniek heeft een specifiek celtype onthuld dat nodig is om de milt te laten regenereren. Het zou verdere regulatoren van miltweefselregeneratie aan het licht kunnen brengen, of kunnen dienen als een platform voor bredere weefselmanipulatiestudies.

Begin met het voorkoelen van een pipetpuntdoos van 200 microliter in een vriezer van min 20 graden Celsius. Dompel Parafilm vervolgens 10 minuten onder in 80% ethanol, gevolgd door een wasbeurt van 10 minuten in PBS. Om de celoplossing te bereiden, aliquoteert u het gewenste celnummer in een conische buis van 14 milliliter.

Centrifugeer de cellen op 200 g en 4 graden Celsius gedurende 5 minuten. Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op en laat ongeveer 20 microliter volume achter. De celpellet kan vervolgens opnieuw worden gesuspendeerd in het resterende supernatantvolume.

Zuig met behulp van een voorgekoelde pipetpunt 2 microliter ijskoude Matrigel op. Draai voorzichtig en werp uit om de pipetpunt te verwijderen. Span een voorgesteriliseerde strook Parafilm uit en plaats deze over het uiteinde van de pipetpunt, zorg ervoor dat u de film niet doorboort.

Blijf de Parafilm om de zijkant wikkelen om ervoor te zorgen dat de punt is verzegeld. Breng vervolgens de celoplossing voorzichtig aan op de Matrigel. Laat de pipetpunt op ijs liggen en maak een conische buis van 14 milliliter klaar met daarin een clusterbuis van 1,2 milliliter.

De pipetpunt kan vervolgens in de geneste buisconfiguratie worden gestoken en gedurende 5 minuten worden gecentrifugeerd op 400 g en 4 graden Celsius. Incubeer de buis gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. De buis kan op ijs worden geplaatst totdat het verder nodig is.

Verwijder de Parafilm voorzichtig van de pipetpunt, steek vervolgens een dunne draadzuiger in en verwijder de Matrigel-plug in het weefselkweekmedium. De geaggregeerde cellen kunnen worden gekweekt bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Scheer de vacht met een elektrische tondeuse en veeg de huid af met 80% ethanol.

Maak een incisie van twee centimeter in de huid loodrecht op de wervelkolom en leg de peritoneale wand bloot. Vervolgens wordt een tweede kleinere incisie gemaakt in de buikwand boven de nier. Oefen druk uit en exterioriseer de nier.

Zorg ervoor dat de nier vochtig wordt gehouden door regelmatig steriele PBS toe te passen. Knijp in het nierkapsel met een ultrafijne pincet en scheur met een tweede paar voorzichtig in tegengestelde richtingen. Scheid het capsulemembraan voorzichtig van het nierparenchym.

Til het nierkapsel op met één pincet en schuif de pipetpunt langzaam door de opening. Steek voorzichtig een draadzuiger in de pipetpunt en verwijder de Matrigel-plug. Bevochtig de nier met PBS en reïnteer opnieuw in de peritoneale holte.

Sluit de peritoneale wand met 5-O-Vicryl-hechtingen en sluit de huidincisie met een AutoClip-applier en twee wondclips van 9 millimeter. Een belangrijke stap in dit protocol is het samenvoegen van cellen in een halfvaste matrix. Een positionering van de middelste laag wordt bereikt door optimale centrifugatiesnelheden.

Hogere snelheden stuwen cellen naar het uiterste puntje van de pipet, terwijl onvoldoende snelheden de celbeweging door de matrix verhinderen. Na stolling kan het Matrigel-construct uit de pipetpunt worden uitgeworpen. Miltstromale constructies die in vitro worden gekweekt, vormen driedimensionale bolvormige organoïde structuren.

Organoïden vertonen een niet-holle structuur met cellen die over de gehele diameter van het weefsel aanwezig zijn. Ze bestaan uit drie brede celpopulaties, waaronder witte bloedcellen, rode bloedcellen en niet-hemopoëtische stromale en endotheelcellen. Constructen kunnen ook onder het nierkapsel worden getransplanteerd voor weefselregeneratiestudies.

Na vier weken kan een georganiseerde miltweefselstructuur worden waargenomen, waaronder centrale arteriolen, B-celfollikels, fibroblastische reticulaire cellen, myeloïde cellen van rode pulpa, metallofiele macrofagen in de marginale zone, sinusoïden van rode pulpa en folliculaire dendritische celnetwerken, T-celzone, macrofagen van rode pulpa en reticulaire cellen in de marginale zone. Bij het proberen van celaggregatie en inkapseling is het belangrijk om te onthouden om snel te werken en alle materialen op ijs te houden. De belangrijkste stap bij transplantaties is het verwijderen van de Matrigel-plug terwijl de pipetpunt uit de nier wordt getrokken.

Er moet voor worden gezorgd dat het capsulemembraan niet wordt geperforeerd of dat het nierparenchym niet scheurt. Dit protocol werd gebruikt om de vereisten voor twee stromale celpopulaties bij miltweefselregeneratie te onderzoeken. In dit representatieve experiment slaagden alleen aggregaten zonder bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor-bèta-positieve MAdCAM-negatieve cellen er niet in om weefselgroei op gang te brengen, wat suggereert dat deze specifieke celpopulatie essentieel is voor de milt om te regenereren.