Name: Mestcellen in de micro-omgeving van hepatocellulair carcinoom geven een gunstige prognose: een retrospectieve studie met behulp van QuPath-beeldanalysesoftware (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer hoe QuPath-beeldanalyse de kwantificering van immuuncellen in hepatocellulair carcinoom verbetert. Deze methode onderzoekt de prognostische waarde van mestcellen in tumormicro-omgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn erkentelijk voor de bijdragen van Mgr. Ondřej Šebesta (Vinicna Microscopy Core Facility, Faculteit Wetenschappen, Charles University) voor het scannen van volledige objectglaasjes en het project "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA LM2018140), dat ons de rekenkracht voor deze studie heeft geleverd. Technici Jana Dosoudilova en Jan Javurek worden erkend voor hun uitstekende technische assistentie. Dit onderzoek werd gefinancierd door het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie, subsidie nr. 856620, en het ministerie van Volksgezondheid van Tsjechië, subsidie AZV NU21-03-00506, en door het Cooperatio-programma (chirurgische disciplines). De Vinicna Microscopy Core Facility wordt medegefinancierd door het Czech-BioImaging grote RI-project LM2023050.

Dit protocol maakte deel uit van een studie die werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn vastgelegd in de Verklaring van Helsinki (versie van 2013); het werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Faculteit Geneeskunde en het Universitair Ziekenhuis in Pilsen (118/2021, 11 maart 2021). Figuur 1 geeft een overzicht van de gehanteerde methoden.
1. Selectie van FFPE-weefselblokken
<ol><li>Haal FFPE-blok-ID's op uit patiëntendossiers met behulp van behandelend artsen of pathologen.</li>
	<li>Vraag de FFPE-blokken op bij het lokale pathologiearchief.</li>
	<li>Selecteer voor elke patiënt 2-3 FFPE-blokken die levensvatbaar tumorweefsel bevatten, bij voorkeur met het omliggende peritumorgebied en de niet-tumorlever. OPMERKING: Het wordt geadviseerd om voor deze selectie het advies van een deskundige patholoog in te winnen. Histologische beoordeling van de niet-tumorlever, samen met anamnestische, klinische en laboratoriumgegevens werd gebruikt om de onderliggende etiologie van HCC te definiëren.</li>
</ol>2. Deparaffinisatie en rehydratatie van FFPE-weefsel
<ol><li>Snijd een of twee weefselsecties van 4 μm dikte uit elk van de FFPE-weefselblokken op een microtoom. OPMERKING: De dikte van de secties kan tussen 3 μm en 5 μm zijn zonder merkbare vlekkeneffecten; Een dikte van 4 μm is echter de standaard.</li>
	<li>Plaats de secties in een waterbad (42°C) om rimpels te verwijderen.</li>
	<li>Monteer de objectglaasjes door ze op te pakken en op een positief geladen glazen microscopisch objectglaasje te leggen. Breng vervolgens de glaasjes aan om gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (AT) te drogen.</li>
	<li>Plaats de glaasjes gedurende 1 uur in een thermostaat (56 °C).</li>
	<li>Gebruik een autostainer om de secties in wasoplossing-1 (30 s bij 72 °C), dewax-oplossing-2 (10 s bij 72 °C), dewax-oplossing-3 (10 s bij AT), ethanol 96%-1 (10 s), ethanol 96%-2 (10 s) en ethanol 96%-3 (10 s) te ontparaffiniseren.</li>
	<li>Gebruik een autostainer om de secties in wasoplossing-1 (10 s, AT), wasoplossing-2 (10 s, AT) en wasoplossing-3 (5 min, AT) te hydrateren.</li>
</ol>3. IHC uitvoeren in een volledig geautomatiseerde kleuringsmachine
OPMERKING: IHC wordt uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. De stappen worden hieronder kort toegelicht.
<ol><li>Methode voor het ophalen van antigeen<ol><li>Antigeen terughalen met behulp van de door warmte geïnduceerde epitoopextractie (ER)-procedure in een ER-oplossing met een hoge pH (bijv. Tris-EDTA): ER-oplossing-1 (10 s, AT), ER-oplossing-2 (10 s, AT), ER-oplossing-3 (20 min bij 100 °C), ER-oplossing-4 (12 min, AT).</li>
		<li>Spoel het objectglaasje 3x (30 s elk) en 1x (3 min) af in een wasoplossing.</li>
		<li>Blokkeer endogene peroxidase met behulp van de Peroxide Block-oplossing gedurende 5 minuten bij AT.</li>
		<li>Spoel 3x (elk 30 s) af in een wasoplossing.</li>
		<li>Blokkeer niet-specifieke binding van antilichamen met een eiwitblok voor NKp46 alleen gedurende 30 minuten bij AT.</li>
	</ol></li>
	<li>Binding met primaire antilichamen: Incubeer met primaire antilichamen gedurende 15 minuten bij AT, spoel vervolgens 3x (elk 30 s) af met een wasoplossing.</li>
	<li>Volg de onderstaande stappen voor secundaire antilichaambinding.<ol><li>Incubeer met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 8 minuten bij AT.</li>
		<li>Spoel af met een wasoplossing gedurende 2x (elk 2 minuten) en 1x met gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Visualiseer de reactie door de objectglaasjes te spoelen met diaminobenzidine (DAB)-oplossing en ze vervolgens gedurende 10 minuten bij AT te incuberen met de DAB-oplossing.</li>
		<li>Spoel 3x (30 s) af met gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Bestkleur de secties met Mayer's hematoxyline.</li>
		<li>Spoel 1x (30 s) met gedeïoniseerd water, 1x (30 s) met wasoplossing en 1x (30 s) met gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Gebruik een volledig geautomatiseerde objectglaasjeskleurer om de secties te dehydrateren in ethanol 70% (2 min), ethanol 80% (2 min), ethanol 96%-1 (3 min), ethanol 96%-2 (3 min), ethanol 100% (3 min), xyleen-1 (4 min), xyleen-2 (4 min) en xyleen-3 (4 min).</li>
		<li>Gebruik een volautomatische glazen dekglaasje om de secties op de geleiders in een montagemedium te monteren. OPMERKING: Negatieve en positieve (amandelen) weefselcontrolemonsters werden overal gebruikt.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Het verkrijgen van scans van het hele glaasje
<ol><li>Scan de bevlekte dia's met behulp van het 20x-objectief en de matig-hoge dichtheid van scherpstellen op een scanner voor hele dia's.</li>
</ol>5. IHC-analyse met behulp van de software
<ol><li>Maak een project aan voor de IHC-afbeeldingen in de software.<ol><li>Download en open QuPath-0.4.3 (of hoger).exe</li>
		<li>Maak een nieuwe map met een geschikte naam.</li>
		<li>Klik op de knop Project maken in de linkerbovenhoek van de software en selecteer de nieuw gemaakte map.</li>
		<li>Sleep gescande afbeeldingen naar het softwarevenster. Wanneer er automatisch een nieuw venster verschijnt, selecteert u Afbeeldingstype instellen > H-DAB en klikt u op Importeren (Afbeelding 2).</li>
		<li>Bekijk de lijst met afbeeldingen in het linkervenster van het menu; Dubbelklik om de afbeelding te openen.</li>
		<li>Selecteer in het hoofdmenu bovenaan Bestand om de afbeeldingen als een project op te slaan . OPMERKING: De software kan een breed scala aan afbeeldingsformaten aan, waaronder veel hele dia-indelingen. Het tiff-formaat heeft echter de voorkeur om het verlies van onbewerkte gegevens en bijbehorende metadata te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Interessante gebieden annoteren<ol><li>Selecteer het penseel of de toverstaf in het hoofdmenu bovenaan om het tumorgebied te annoteren. Voor discontinue gebieden van de tumor volgt u de stappen 5.2.1.1-5.2.1.3.<ol><li>Annoteer ze afzonderlijk.</li>
			<li>Houd de Ctrl-toets ingedrukt terwijl u alle tumorregio's selecteert</li>
			<li>Klik met de rechtermuisknop en selecteer Meerdere > Geselecteerde samenvoegen bewerken.</li>
		</ol></li>
		<li>Zorg ervoor dat de tumorannotatie is geselecteerd (randen hebben een gele kleur).</li>
		<li>Klik in het hoofdmenu op Automatiseren en selecteer Scripteditor weergeven.</li>
		<li>Kopieer het script dat beschikbaar is in Aanvullend bestand 1 of aan https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls en plak het in de Scripteditor en klik vervolgens op Uitvoeren. De ROI's: tumorcentrum (TC), binnenmarge (IM), buitenmarge (OM) en peritumorgebied (PT) worden automatisch gemaakt en gelabeld.</li>
		<li>Voor een alternatieve manier om interessante regio's te maken, volgt u de stappen 5.2.5.1-5.2.5.5.<ol><li>Selecteer het gereedschap Polylijn in het hoofdmenu bovenaan om een grens te tekenen die de kwaadaardige celnesten en aangrenzend niet-tumorweefsel scheidt.</li>
			<li>Selecteer de resulterende rand. Selecteer in het hoofdmenu bovenaan Objecten > Annotatie > Annotaties uitvouwen > 500 μm voor Expansiestraal > Vlak voor Lijnkap. Activeer Interieur verwijderen en activeer Beperken tot bovenliggend.</li>
			<li>Klik met de rechtermuisknop op de resulterende annotatie, Enkel bewerken > Splitsen. Twee afzonderlijke annotaties worden automatisch uitgebreid als regio's van 500 μm breed aan elke kant van de grens.</li>
			<li>Geef de geannoteerde gebieden de juiste naam voor IM en OM door met de rechtermuisknop op de annotatie in de lijst aan de linkerkant te klikken, Eigenschappen instellen te selecteren en de naam in te voeren.</li>
			<li>De TC vertegenwoordigt het resterende tumorgebied. Verleng het 500 μm brede PT-gebied grenzend aan het OM volgens dezelfde procedure. OPMERKING: Geannoteerde objectglaasjes en QuPath AF-detecties zijn beoordeeld door een deskundige histopatholoog.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Optimalisatie van pixelclassificatie<ol><li>Selecteer het gereedschap Rechthoek in het hoofdmenu. Annoteer vervolgens een gebied dat alle soorten pixels bevat die moeten worden onderscheiden (bijv. Hematoxyline, DAB en achtergrond).</li>
		<li>Selecteer in het hoofdmenu Analyseer > Voorbewerking > Schat Vlekvector.</li>
		<li>Wanneer het venster Visual Stain Editor automatisch verschijnt, selecteert u Auto > OK en stelt u H-DAB geschat in als de naam voor de vlekvector.</li>
		<li>Voor een alternatieve methode volgt u de stappen 5.3.4.1-5.3.4.3.<ol><li>Selecteer het gereedschap Rechthoek in het hoofdmenu en annoteer een klein gebied van een typische kern die is gekleurd met hematoxyline.</li>
			<li>Selecteer Afbeelding in het linkermenu en dubbelklik op Vlek 1 > Ja.</li>
			<li>Selecteer het gereedschap Rechthoek in het hoofdmenu en annoteer een klein gebied met positieve kleuring met DAB. Selecteer Afbeelding in het linkermenu en dubbelklik op Vlek 2 > Ja.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Beoordeling van de gebiedsfractie van positieve immuuncellen met behulp van de optie Pixelclassificatie .<ol><li>Klik in het hoofdmenu op Classificeren > Pixelclassificatie > Drempel maken.</li>
		<li>Selecteer Hoog voor de resolutie > kanaal: DAB > Voorfilter: Gaussiaans > Sigma: 0,5 > (Figuur 3) Drempelwaarde: (0,2-0,3) > Boven de drempelwaarde: Positief > Onder de drempelwaarde: Negatief.</li>
		<li>Selecteer voor de regio Elke aantekening, typ een naam voor de classificatie > Sla > meting op > OK. De DAB-positieve cellen worden veranderd in een rode kleur (Figuur 4).</li>
		<li>Kopieer de resultaten uit het menu aan de linkerkant naar een spreadsheet.</li>
		<li>Of open Meten in het bovenste hoofdmenu, selecteer Annotatiemetingen weergeven > Kopiëren naar klembord en plak de resultaten in een spreadsheet.</li>
		<li>Als u de afbeelding wilt sluiten, klikt u met de rechtermuisknop > Multiweergave > Viewer sluiten. OPMERKING: Vóór de kwantificering werden alle artefacten geëlimineerd. De drempel werd aangepast voor elk geval met een zwakke specifieke positieve kleuring. De juistheid van annotaties en pixelclassificatie werd eerst getoetst en vervolgens beoordeeld door een senior histopatholoog. Alle analyses werden op een blinde manier uitgevoerd. Meer informatie over de analyse van IHC met behulp van de software is te vinden op https://forum.image.sc/tag/QP.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Statistische methoden en gegevensanalyse
<ol><li>De eindpunten van de studie waren tijd tot recidief (TTR), ziektevrije overleving (DFS) en algehele overleving (OS). Patiënten zonder terugval of overlijden werden gecensureerd bij hun laatste follow-up. OPMERKING: Continue niet-normaal verdeelde gegevens worden uitgedrukt als mediaan (min-max). Verhoudingen worden uitgedrukt in ruwe gegevens (percentages). Gebiedsfracties van immuuncellen in verschillende interessegebieden (ROI's) werden vergeleken door Friedman ANOVA, gevolgd door de Wilcoxon-gematchte parentest met Bonferroni-correctie. Vanwege de niet-parametrische verdeling van de meeste variabelen, werd de Spearman-correlatie gebruikt om de associaties tussen paren van ordinale of kwantitatieve variabelen te evalueren. Om de prognostische waarde van individuele voorspellers voor eindpunten te bepalen, werd een univariabele gevolgd door multivariabele Cox-regressieanalyse uitgevoerd. Hazard ratio's (HR) werden berekend. HR toonde het relatieve risico voor de gecombineerde intermediaire hoge groep vergeleken met 1 voor de lage groep. Alle schattingen van de overleving werden berekend met de Kaplan-Meier-methode en vergeleken tussen de groepen door middel van de log-rank-test. GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC) werd gebruikt voor de statistische analyses. Een 2-zijdige p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.</li>
</ol>

Prognostic Significance of Immune Cell Infiltration in Hepatocellular Carcinoma

Er zijn geen financiële belangenconflicten om bekend te maken.

Door middel van het monitoren van de in situ immuunorganisatie in TME kan het vakgebied immuno-oncologie nieuwe prognostische en voorspellende biomarkers voor kanker toevoegen. Ons eerder gepubliceerde artikel over de rol van adaptieve immuuncellen in de TME van HCC toonde positieve prognostische associaties van CD3+ en CD8+ T-cellen en CD20+ B-cellen in geselecteerde ROI's tot de tijd tot recidief2. Hier werd beeldanalysesoftware QuPath gebruikt om de overvloed aan CD1a+ iDC's, CD117+ mestcellen en NKp46+ NK-cellen in verschillende verschillende regio's van HCC te beoordelen en hun prognostische betekenis te evalueren. Vanwege de onregelmatige vormen van sommige aangeboren immuuncellen kan hun kwantificering onnauwkeurig zijn. Dit is de reden waarom het evalueren van de gebiedsfractie van immuunpositieve cellen de optimale optie was. Van de drie celtypen vertoonden alleen CD117+ mestcellen een significante prognostische impact: een hogere AF van mestcellen in de IM en het PT-gebied werd geassocieerd met een langere overleving.
Mestcellen waren het meest overvloedig in alle ROI's, en de associatie van hun AF in het peritumorgebied en de binnenmarge met een betere overleving weerspiegelt de antitumorrol van mestcellen. Mestcellen kunnen in de TME worden aangetrokken door chemolokstoffen die door tumorcellen worden vrijgegeven, zoals SCF of CCL1518. Mestcellen kunnen de antitumorrespons beïnvloeden door directe cytotoxiciteit op tumorcellen27 of door pro-inflammatoire cytokines af te scheiden die de tumorgroei kunnen remmen18. Verhoogde mestceldichtheid was beschermend tegen het terugkeren van prostaatkanker28, maagkanker27 en HCC na levertransplantatie29. Een uitgebreid onderzoek, bestaande uit een groter cohort van 245 HCC-patiënten, vond een positieve correlatie tussen een significantere infiltratie van mestcellen in tumormonsters en een langere overleving na tumorresectie30. Rohr-Udilova et al. rapporteerden vergelijkbare resultaten van grotere dichtheden van mestcellen in het omliggende HCC-weefsel; Echter, alleen intratumor mestceldichtheid was geassocieerd met een lager recidiefpercentage29.
In deze studie oefenden mestcellen alleen een antitumoreffect uit in IM- en PT-lever. De TME van verschillende tumoren is heterogeen wat betreft de ruimtelijke verdeling van immuuncellen31. De prognostische betekenis van immuuncellen in TME is ook van cruciaal belang voor hun ruimtelijke verdeling 32,33. Er zijn verschillende benaderingen voorgesteld voor het annoteren van de invasieve tumormarge, waaronder een hele marge van verschillende breedtes 4,34,35, binnen- en buitenmarges, opnieuw met verschillende breedtes36,37, met of zonder PT 2,7. We volgden de reproduceerbare, gestandaardiseerde methodologie van de International Immunooncology Biomarkers Working Group om de invasieve marge te definiëren als een gebied van 1 mm gecentreerd op de grens die de kwaadaardige celnesten scheidt van het gastheerweefsel en de centrale tumor vertegenwoordigt als het resterende tumorgebied38. Aangezien de eerdere studie significante verschillen aan het licht bracht in de resultaten van de binnenste en buitenste invasieve marge2, zijn die regio's (elk 500 μm breed) afzonderlijk geanalyseerd. De ruimtelijke immuunprofilering van het peritumorgebied heeft zijn duidelijke voorspellende belang39,40, en daarom werd ook het PT-gebied opgenomen.
De analyse van TC, tumormarge en PT-lever werd uitgevoerd in WSI's, in tegenstelling tot de optie om geselecteerde gezichtsvelden in de respectieve regio's te evalueren. Beeldvorming van het hele objectglaasje is een potentieel rijke bron van gegevens41. Aangezien we geen subsampling hebben uitgevoerd, werd de "werkelijke verwachtingswaarde" op een tijdbesparende manier verkregen10. Bovendien was dit systeem redelijk omdat er slechts 1 of 2 dia's per blok werden geanalyseerd, waardoor we de bias van patchselectie42 konden vermijden. De trage workflow daagde ons uit in de vorige studie toen stereologie werd toegepast voor de kwantificering van immuuncellen2.
IHC maakt directe lokalisatie van CD1a+ iDC's, NKp46+NK en CD117+ mestcelexpressie in leverweefsel mogelijk, kwantificering van hun distributies en dus subclassificatie van het cohort. IHC-analyse geeft deze studie belangrijke voordelen ten opzichte van biochemische tests in opgelost weefsel, wat kan leiden tot vals-negatieve resultaten wanneer slechts enkele biomarker-positieve cellen aanwezig zijn43 en niet de regionale reactie van immuuncellen op histopathologische kenmerken weerspiegelen44. IHC heeft ook de voorkeur boven analyse in H&E-bevlekte secties. Studies naar colorectale kanker en kleincellige longkanker toonden aan dat de beoordeling van H&E-gekleurde secties robuuste, kwantitatieve tumor-immuunbiomarkers zou kunnen opleveren 45,46,47; Er zijn echter nog steeds beperkingen om de werkelijke aanwezigheid van specifieke subtypen weer te geven.
Hoge kwaliteit van weefselcoupes en IHC-kleuring is een voorwaarde voor een nauwkeurige beoordeling. Hoge achtergrond, randartefacten en specifieke maar ongewenste kleuring (bijv. kleuring van endotheelcellen van sinusvormige ruimten in de lever met anti-CD4-antilichamen) kunnen alle resultaten corrumperen. Een CD56-antilichaam was de eerste keuze in de huidige studie om natuurlijke killercellen te detecteren, maar werd vervangen door het NKp46-antilichaam vanwege de expressie van CD56 in onrijpe galwegen. De selectie van de meest geschikte marker in termen van specificiteit, robuust kleuringspatroon en stabiliteit in FFPE-blokken is een ander punt om te overwegen. Er werd bijvoorbeeld gekozen voor CD117 in plaats van tryptase omdat de expressie van tryptase sterk kan worden gedownreguleerd, bovendien zijn cellen die geen CD117 tot expressie brengen geen mestcellen48.
QuPath biedt de mogelijkheid om de grenzen van de ROI van buitenaf glad te strijken en om artefacten, grote vaten, necrotisch weefsel, niet-specifieke kleuring, achtergrond en aggregatie van erytrocyten te verwijderen die geen deel zouden moeten uitmaken van de ROI. De operator moet de ROI selecteren en op de "Alt"-toets drukken terwijl hij die artefacten annoteert. Niet-specifieke kleuring werd in deze studie geëlimineerd als artefacten vóór kwantificering, zodat het de resultaten niet beïnvloedde. In het geval van systematisch lage specifieke kleuring of hoge achtergrond, moet het protocol worden herzien om mogelijke vertekening te voorkomen. De drempel werd aangepast voor elk geval met een zwakke specifieke positieve kleuring. Vóór routinematig gebruik moet het protocol worden geoptimaliseerd. Alle analyses moeten op een blinde manier worden uitgevoerd en idealiter verdient de nauwkeurigheid van de drempelwaarden een kruiscontrole.
QuPath is een gebruiksvriendelijke, intuïtieve, uitbreidbare, open-source oplossing voor digitale pathologie en beeldanalyse van het hele glaasje9, eerder getest voor beeldanalyse bij HCC49 en verschillende vormen van kanker50,51. De eenvoudige bediening van de software voor WSI's en de mogelijkheden voor annotatie van interessegebieden (bijv. tumorale of peritumorale gebieden) zijn de belangrijkste voordelen.
Toepassing van bestaande, gewijzigde of de novo gemaakte scripts kan de analyse aanzienlijk versnellen. Het script om annotaties voor ROI's te maken werd toegepast, waardoor snelle en nauwkeurige regionale segmentatie mogelijk werd in plaats van handmatige afbakening. Het script staat niet vast en kan gemakkelijk worden aangepast tot marges van minder dan 500 μm voor regio's met onvoldoende weefselgrenzen. De breedte van het IM-, OM- of PT-gebied kan worden aangepast via Automate > Show script editor > de regel 30 Double Expand Margin Microns = 500 μm aan te passen aan de beschikbare breedte > Run. ROI's kunnen ook worden toegevoegd of verwijderd. Over het algemeen liggen de workflows in de software niet vast en staat het de operator vrij om ze te ontwikkelen en aan te passen.
Een overvloed aan beschikbare softwaretools voor pathologische beeldanalyse, waaronder CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser en andere, is nu beschikbaar. QuPath onderscheidt zich echter door een reeks voordelen, zoals een open-sourcearchitectuur, een gebruiksvriendelijke interface, mogelijkheden voor het aanpassen van algoritmen en integratie van geavanceerde machine learning-tools. Die functies positioneren deze beeldanalysesoftware gezamenlijk als een robuuste keuze voor de genuanceerde analyse van kankerweefsels op het gebied van digitale pathologie.
QuPath vertoonde de laagste variabiliteit in vergelijking met commerciële software HALO (IndicaLab) en QuantCenter (3DHistech) voor de detectie van Ki67-expressie bij borstkanker52. De software heeft ook de mogelijkheid om te worden geïnstrueerd om een script uit te voeren voor alle projectafbeeldingen op een reproduceerbare batchverwerkingsmanier.
QuPath stelde ons in staat om kwantitatieve continue gegevens te creëren in plaats van ordinale (semi-kwantitatieve) gegevens. Ordinale gegevens verkregen door visuele scores zijn beladen met problemen als gevolg van subjectiviteit in interpretatie, variabiliteit tussen waarnemers en slechte reproduceerbaarheid53. De snelheid van de huidige analyse werd verbeterd door het feit dat personen zonder uitgebreide histopathologische achtergrond en programmeerexpertise automatische analyses kunnen uitvoeren, op voorwaarde dat de nauwkeurigheid van de annotaties werd gecontroleerd door een patholoog. Een onderzoek naar hoofd-halstumoren toonde de geschiktheid van QuPath aan voor een snelle en reproduceerbare beoordeling van de prognostische waarde van CD57+ tumor-infiltrerende lymfocyten50. De studie toonde ook een substantiële overeenstemming tussen menselijke waarnemers en QuPath. Een hoge concordantie tussen handmatige observatie en beoordeling met behulp van QuPath werd ook gepresenteerd bij mondkanker54 en borstkanker55. Het eerder genoemde artikel vergeleek de IHC-kwantificering van 5 klinische biomarkers voor borstkanker met behulp van QuPath en 2 commerciële softwareproducten (Definiens Tissue Studio en inForm) met een handmatige score door een patholoog. Gedurende dit onderzoek vertoonde QuPath consequent de beste prestaties en de minste tijd om in te stellen en toe te passen, waardoor het een uitstekend toekomstig alternatief bleek te zijn voor visuele monitoring en commerciële software. Zelfs in vergelijking met ImageJ, de bekendste open-source software voor biomedische beeldanalyse, blinkt QuPath uit in het omgaan met grote WSI's56.
Er is een open online forum voor QuPath waar gebruikers hun vragen over methoden van digitale pathologie stellen en een actieve en betrokken gemeenschap presenteren om de ontwikkeling van tools voor beeldanalyse (https://forum.image.sc/tag/qupath) te ondersteunen.
Het cohort dat in deze studie werd gebruikt, was uniek en niet representatief voor de algemene populatie met HCC, omdat het alleen patiënten omvatte die in aanmerking kwamen voor leverresectie. Over het algemeen komt een minderheid van de patiënten met HCC (20%-30%) in aanmerking voor leverresectie57. Dit zou ook een reden kunnen zijn waarom minder patiënten cirrose hadden bevestigd, omdat patiënten met deze etiologie van HCC waarschijnlijk hogere Child-Pugh-scores hadden en niet als reseceerbaar werden beschouwd. Het cohort was ook vrij klein en de meeste patiënten hadden een vroeg TNM-stadium van de ziekte. Daarom moet de extrapolatie van de resultaten naar andere populaties met de nodige voorzichtigheid worden uitgevoerd.
In de huidige studie is de overvloed aan aangeboren immuuncellen in de HCC-micro-omgeving geschat door de beoordeling van hun AF, omdat nauwkeurige telling van onregelmatig gevormde immuuncellen zoals dendritische cellen moeilijk kan blijken te zijn. Aan de andere kant correleert de oppervlaktefractie van immuuncellen meestal sterk met hun dichtheden58. Immunoperoxidase-etikettering biedt gegevens voor lokalisatie van het antigeen, de oppervlaktefractie of de dichtheid van cellen die het tot expressie brengen, maar de intensiteit van de kleuring is niet-lineair gerelateerd aan de hoeveelheid antigeen. Daarom mag IHC niet worden gebruikt om het expressieniveau van een bepaald eiwit kwantitatief te beoordelen. De nauwkeurigheid van de methode hangt ook af van de uniformiteit van de sectiedikte, de beeldkwaliteit en de geselecteerde resolutie voor pixelclassificatie. Alle resultaten van beeldanalyse moeten worden gevalideerd en met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. Omdat een enkele marker de complexiteit van immuuncellen niet volledig kan vastleggen, zijn meer IHC-markers en multiplexkleuring nodig om een betrouwbaar beeld te krijgen van de immuun-TME van HCC. Het gebruik van slechts één IHC-marker voor fenotypering van immuuncellen vertegenwoordigt een benadering en de resultaten moeten met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.
Door gebruik te maken van de QuPath-beeldanalysesoftware om IHC-gekleurde objectglaasjes te evalueren, konden we de verdeling en oppervlaktefractie van lokale iDC's, mestcellen en NK's in tumoren en peritumoren van HCC-patiënten beoordelen en vervolgens hun relaties met de prognose analyseren. De overvloed aan mestcellen in de binnenmarge en peritumorlever van HCC wordt geassocieerd met langere DFS en OS, wat de antitumoreffecten van die aangeboren immuuncellen benadrukt. De analytische workflow van QuPath is gebruiksvriendelijk, snel en gebruiksvriendelijk, met handige standaardinstellingen en eenvoudige gegevensexport. Deze software is onderschreven als een veelbelovend platform voor digitale beeldanalyse, dat zou kunnen voldoen aan de behoefte aan reproduceerbaarheid, consistentie en nauwkeurigheid in digitale pathologie.

Het is bewezen dat de ruimtelijke organisatie en overvloed aan tumor-infiltrerende immuuncellen de overleving bij verschillende vormen van kanker beïnvloeden, hepatocellulair carcinoom (HCC) inbegrepen 1,2,3,4. De prognostische significantie van tumor-infiltrerende lymfocyten bij kankers werd voor het eerst aangetoond op met hematoxyline en eosine (H&E) gekleurde secties 5,6. Vervolgens toonde een baanbrekende studie van Galon et al. met behulp van immunohistochemie (IHC) associaties aan van de dichtheden van CD3+ en CD8+ T-cellen in darmkankerweefsel met prognose4.
IHC is een gouden standaard voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in tumorweefsel voor verdere associatie met klinische uitkomsten7. IHC biedt verschillende voordelen, zoals lage kosten, wijdverbreide beschikbaarheid en compatibiliteit met in formaline gefixeerd paraffine ingebed (FFPE) weefsel8. Nauwkeurige beoordeling van IHC-gekleurde immuuncellen is echter een grote uitdaging. Traditionele scoring in geselecteerde microscopische gezichtsvelden is tijdrovend en niet langer voldoende om de hoogwaardige, reproduceerbare, objectieve analyse te garanderen die essentieel is voor de selectie van kandidaat-biomarkers en een betrouwbare klinische correlatie9. Scans van het hele glaasje kunnen worden beoordeeld als een volledig beeld of na subsampling10.
Geautomatiseerde kwantitatieve beoordeling van de overvloed aan immuuncellen in weefselmonsters kan zorgen voor praktische, nauwkeurige, betrouwbare en klinisch relevante gegevens11. QuPath is gratis, open-source software die de digitale beeldanalyse van IHC-gekleurde objectglaasjes mogelijk maakt en de hoeveelheid informatie die wordt verkregen uit individuele monsters maximaliseert12.
Aangezien onrijpe dendritische cellen (iDC's), natural killer (NK)-cellen en mestcellen betrokken zijn bij antitumor-immuunresponsen en waarvan is aangetoond dat ze correleren met de uitkomsten van patiënten 13,14,15, presenteren we hier een stapsgewijs protocol voor het beoordelen van hun ruimtelijke verdeling in FFPE HCC-weefsel en het onderzoeken van hun prognostische impact. CD1a komt voornamelijk tot expressie op het membraan van onrijpe dendritische cellen, waarvan de dichtheid in verband is gebracht met klinische resultaten bij een verscheidenheid aan menselijke tumoren16,17. Mestcellen kunnen een protumor- of antitumorrol spelen binnen de tumormicro-omgeving (TME)18. Ze kunnen angiogenese ondersteunen en metastase vergemakkelijken19. Omgekeerd is gemeld dat mestcellen apoptose van tumorcellen kunnen mediëren door de productie van IL-420. Anti-CD117-kleuring wordt vaak gebruikt om mestcellen in het tumorweefsel te visualiseren en te kwantificeren21. Aangenomen wordt dat NK-cellen bijdragen aan de bewaking en controle van HCC22 door kankercellen te doden23. NKp46-expressie door NK is een cruciale parameter voor hun antitumoractiviteit24. NKp46+ NK-cellen correleerden echter positief met de tumordiameter bij HCC-patiënten25. Desondanks is er weinig bekend over hun correlatie met de overleving van de patiënt.
We wilden de overvloed aan CD1a+ iDC's, CD117+ mestcellen en NKp46+ NK-cellen in verschillende regio's van HCC kwantitatief beoordelen en hun prognostische betekenis benadrukken. In totaal werden 70 opeenvolgende patiënten met pathologisch bevestigde stadium I-IV HCC, die in aanmerking kwamen voor resectie volgens de BCLC-richtlijnen en tussen 1997 en 2019 een curatieve leverresectie ondergingen in het Universitair Ziekenhuis van Pilsen, opgenomen in de huidige retrospectieve studie. Pathologierapporten van de patiënten werden beoordeeld. Geen van de patiënten die in deze studie waren opgenomen, had metastasen op afstand en had ook geen neoadjuvante therapie zoals chemotherapie of radiotherapie gekregen vóór de operatie. In totaal werden 3 patiënten met histologische monsters van slechte kwaliteit uitgesloten en de overige 67 patiënten werden in het onderzoek opgenomen (tabel 1).

<table><tbody><tr><td>Anti-CD1a</td><td>Leica Biosystems</td><td>PA0235</td><td>Identifier- onrijpe dendritische cellen; RTU, Protocol F, ER2/20 min</td></tr><tr><td>Anti-CD117</td><td>Leica Biosystems</td><td>&nbsp;PA0007</td><td>Identifier- mestcellen; RTU, Protocol F, ER2/20 min</td></tr><tr><td>BOND Plus Microscoopglazen</td><td>Leica Biosystems, Germany</td><td>S21.2113.A</td><td></td></tr><tr><td>BOND RXm</td><td>Leica Biosystems</td><td>49.1501</td><td>Volledig geautomatiseerde IHC-kleuringsmachine&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Bond Aspiratie Sonde Reinigingskit</td><td>Leica Biosystems</td><td>CS9100</td><td></td></tr><tr><td>Bond&nbsp;Dewax&nbsp;Solution</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Bond&nbsp;Polymer Refine Detection Kit</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9800</td><td></td></tr><tr><td>BondTM Epitope Retrieval 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>BondTM Primaire Antilichaam Diluent</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>BondTM Wasoplossing 10X Concentraat</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>Computer Specificaties: Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz&nbsp;&nbsp; 3.10 GHz Geïnstalleerd RAM: 128 G</td><td>Intel</td><td></td><td>Een 64-bits besturingssysteem met Windows 7. Elke computer met een op Java gebaseerd besturingssysteem en Excel beschikbaar</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Leica Biosystems, Germany</td><td>14071135636</td><td></td></tr><tr><td>CV Mount</td><td>Leica Biosystems, Germany</td><td>14046430011</td><td></td></tr><tr><td>CV5030 Volledig geautomatiseerde Glasdekglasjesmachine</td><td>Leica Biosystems</td><td>149CVTS5025</td><td></td></tr><tr><td>Droogoven UN30</td><td>Memmert GmbH&nbsp;</td><td>UN30</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9.0</td><td>GraphPad Software LLC&nbsp;</td><td></td><td>Versie 12</td></tr><tr><td>Human NKp46/NCR1 Antilichaam, Monoklonaal Muis IgG2B Kloon # 195314</td><td>R&amp;D Systems, Inc., United States</td><td>MAB1850</td><td>Identifier- natuurlijke killercellen; Verdunning 1:150, Protocol F + BLOK, ER2/20 min</td></tr><tr><td>Leica HI1210 - Waterbad</td><td>Leica Biosystems</td><td>14041521466</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne Blok</td><td>Agilent Dako, United States</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2 of hogere versies</td><td></td><td></td><td>&nbsp;versie (QuPath v.0.3.2)&nbsp;</td></tr><tr><td>RM2235 Roterende Microtoom</td><td>Leica Biosystems</td><td>149AUTO00C1</td><td></td></tr><tr><td>ST5020 Multikleuringsmachine voor Glijmiddelen</td><td>Leica Biosystems</td><td>DEV-ST5010-CV5030</td><td></td></tr><tr><td>Statistica</td><td>StatSoft Inc.</td><td></td><td>versie 7</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scan.Z1</td><td>ScienceServices GmbH, Germany</td><td>430038-9000-000&nbsp;</td><td>Glijmiddelenscanner&nbsp;</td></tr></tbody></table>

mestcellen in de micro-omgeving van hepatocellulair carcinoom geven een gunstige prognose: een retrospectieve studie met behulp van qupath-beeldanalysesoftware 

Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software

De inzichten die worden verkregen door in-situ detectie van immuuncellen binnen hepatocellulair carcinoom (HCC) kunnen informatie opleveren over de resultaten voor de patiënt. Studies die de expressie en lokalisatie van immuuncellen in tumorweefsels onderzoeken, worden in verband gebracht met verschillende uitdagingen, waaronder een gebrek aan nauwkeurige annotatie voor tumorregio's en willekeurige selectie van microscopische gezichtsvelden. QuPath is een open-source, gebruiksvriendelijke software die zou kunnen voldoen aan de groeiende behoefte aan digitale pathologie in WSI-analyse (Whole Slide Image).
De infiltratie van HCC en aangrenzende weefsels door CD1a+ onrijpe dendritische cellen (iDC's), CD117+ mestcellen en NKp46+ natural killer cells (NK's) werd immunohistochemisch beoordeeld in representatieve monsters van 67 patiënten met HCC die curatieve resectie ondergingen. De gebiedsfractie (AF) van positief gekleurde cellen werd automatisch beoordeeld in WSI's met behulp van QuPath in het tumorcentrum (TC), de binnenmarge (IM), de buitenmarge (OM) en het peritumorgebied (PT). De prognostische betekenis van immuuncellen werd geëvalueerd voor tijd tot recidief (TTR), ziektevrije overleving (DFS) en algehele overleving (OS).
De AF van mestcellen was significant groter dan de AF van NK's, en de AF van iDC's was significant lager in vergelijking met NK's in elk interessegebied. Hoge AF's van mestcellen in de IM- en PT-gebieden werden geassocieerd met langere DFS. Bovendien werd een hoge AF van mestcellen in IM geassocieerd met een langer besturingssysteem.
Computerondersteunde analyse met behulp van deze software is een geschikt hulpmiddel voor het verkrijgen van prognostische informatie voor tumor-infiltrerende immuuncellen (iDC's, mestcellen en NK's) in verschillende regio's van HCC na resectie. Mestcellen vertoonden de grootste AF in alle interessegebieden (ROI's). Mestcellen in het peritumorgebied en IM vertoonden een positieve prognostische significantie.

De demografische en klinische kenmerken van de patiënten worden weergegeven in tabel 1. De mediane leeftijd van de patiënten was 69 jaar, en de meesten waren mannen (77,6%). Wat de etiologie van HCC betreft, was chronische niet-virale hepatitis de meest voorkomende achtergrondziekte, met een prevalentie van niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) (23,9%). Slechts 15 patiënten (22,4%) hadden cirrose als achtergrondziekte. Een meerderheid van de patiënten (68,7%) had TNM stadium I. Meer gedetailleerde klinische en pathologische bevindingen werden beschreven in ons eerder gepubliceerde werk 2,26.
Resultaten Bij de laatste follow-up werd bij 29 (41,8%) patiënten een tumorrecidief waargenomen, van wie 89,7% een lokaal recidief had en 38 (56,7%) patiënten waren overleden. 5 jaar na de operatie was het aandeel DFS 33,2%, het aandeel OS 49,4% en het recidiefvrije aandeel (RFP) 48,7% (tabel 2).
Verdeling van immuuncellen in verschillende interessegebieden Het CD117-eiwit werd voornamelijk aangetroffen in het cytoplasmatische membraan van afgeronde cellen (Figuur 5A). In de TC en IM waren ze meestal gelokaliseerd in het stroma en in de perivasculaire ruimte. In de OM- en PT-gebieden werden de CD117+-cellen waargenomen in het tumorkapsel en in de perivasculaire ruimte.
Het NKp46-eiwit werd voornamelijk aangetroffen in het cytoplasmatische membraan van afgeronde cellen, die aanwezig waren in sinusoïde-achtige ruimtes in de TC en IM, en ook geassocieerd waren met het stroma (Figuur 5B). In het OM- en PT-gebied werden NKp46+-cellen waargenomen in capsules rond tumornesten en in het stroma van portaalkanalen.
Het CD1a-eiwit werd aangetroffen in de TC en IM, voornamelijk in het cytoplasmatische membraan van afgeronde cellen (verspreid of in aggregaten) in het stroma, binnen en langs de grenzen van sinusoïde-achtige ruimtes (Figuur 5C). In het PT-gebied werd CD1a+ DC waargenomen in en langs de grenzen van sinusoïden en in het galepitheel in de portale banen.
De AF van mestcellen was significant groter dan de AF van NKp46+ cellen (p < 0,001) (Figuur 6). CD1a+ iDC's vertoonden in elke ROI de laagste AF in vergelijking met mestcellen en NK-cellen (p < 0,001) (Figuur 6). De AF van CD117+- en NKp46+-cellen in TC of IM was significant kleiner dan die in het PT-gebied en OM (p < 0,001) (Figuur 6). Voor CD1a+-cellen verschilde de AF niet significant tussen de regio's.
Significante associaties voor individuele immuuncellen tussen alle ROI's worden weergegeven in Tabel 3. Figuur 7 toont de heatmap voor significante associaties tussen verschillende immuuncellen binnen verschillende regio's. De AF van CD117 + mestcellen in TC correleerde significant met de AF van CD1a in de TC en IM.
Prognostische waarde van klinische en pathologievariabelen Van de klinische en pathologische variabelen was alleen een jongere leeftijd geassocieerd met een groter risico op recidief (HR = 0,96, BI: 0,93-0,99, p = 0,007), terwijl geen enkele variabele geassocieerd was met DFS en OS (tabel 4).
Prognostische waarden van infiltrerende immuuncellen Een hoge AF van CD117+ mestcellen in IM was geassocieerd met langere DFS (HR = 0,48, CI: 0,241 - 0,935, p = 0,031) en OS (HR = 0,34, CI: 0,167 - 0,703, p = 0,004) (Figuur 8, Tabel 5). Bovendien was een hoge AF van CD117+ mestcellen in het PT-gebied geassocieerd met langere DFS (HR = 0,48, BI: 0,247 - 0,945, p = 0,034) (Figuur 8, Tabel 5). Daarentegen waren de AF's van iDC- en NK-cellen niet geassocieerd met een van de uitkomsten. CD117+ mestcellen in de binnenmarge behielden significante associaties met DFS (HR = 0,46, BI: 0,23-0,91, p = 0,027) en OS (HR = 0,33, BI: 0,16-0,68, p = 0,003) na correctie voor TNM-stadium (Tabel 6). Wat mestcellen in het PT-gebied betreft, bleef de associatie met DFS ook significant (HR = 0,47, BI: 0,24-0,93, p = 0,029) (Tabel 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig01.jpg"> Figuur 1: Representatief schema voor de methoden. Schematisch diagram van de werkstroom voor de identificatie van de prognostische rol van mestcellen, dendritische cellen en natural killer-cellen in HCC. Afkortingen: FFPE, ingebedde formaline-gefixeerde paraffine; H&E, Hematoxyline en Eosine; ROI's, regio's van belang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig02.jpg"> Figuur 2: Screenshot van het softwarevenster. Een beschrijvende schermafbeelding die de stap van het importeren van afbeeldingen in een project in de software laat zien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig03.jpg"> Figuur 3: Screenshot van de optie van oppervlaktebreuk. Een screenshot van de software met de geselecteerde parameters om de oppervlaktefractie van positieve kleuring te kwantificeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig04.jpg"> Figuur 4: Screenshot van de optie van pixelclassificatie. Screenshot van de software met de DAB-positieve cellen voor en na pixelclassificatie. De bruinachtige DAB-kleuring is na pixelclassificatie omgezet in een rode kleur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig05.jpg"> Figuur 5: Representatieve immunokleuring van aangeboren immuuncellen bij HCC-patiënten. Representatieve immunokleuring van (A) CD117+, (B) NKp46+ en (C) CD1a+ cellen in TC (400x) en TIM (200x) van HCC. Afkortingen: HCC, hepatocellulair carcinoom; TC, tumorcentrum; TIM, tumorinvasieve marge, met binnenmarge (IM) en buitenmarge (OM). De stippellijn geeft een grens weer tussen de tumor en niet-tumorweefsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig06.jpg"> Figuur 6: Statistiek die de gebiedsfractie van aangeboren immuuncellen bij HCC-patiënten beschrijft. Statistieken voor de gebiedsfractie van CD1a+ dendritische cellen, CD117+ mestcellen en NKp46+ NK-cellen) in de TC-, IM-, OM- en PT-gebieden van HCC. Zwarte lijnen zijn medianen. Wilcoxon-matchingparentest met Bonferroni-correctie werd gebruikt voor vergelijkingen. Afkortingen: HCC, hepatocellulair carcinoom; TC, tumorcentrum; IM, binnenmarge; OM, buitenmarge; PT, peritumorgebied. : p <0,001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig07.jpg"> Figuur 7: Heatmap van significante correlaties tussen gebiedsfracties van mestcellen, DC's en NK's in verschillende interessegebieden. Heatmap van significante correlaties tussen gebiedsfracties van CD117+ mestcellen, CD1a+ DC's en NKp46+NK's in TC, IM, OM en PT (Spearman ρ, p < 0,05). Afkortingen: TC, tumorcentrum; IM, binnenmarge; OM, buitenmarge; PT, peritumorgebied; DC, dendritische cellen; NK, natuurlijke killercellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig08.jpg"> Figuur 8: Kaplan-Meier DFS- en OS-curven voor tumor-infiltrerende mestcellen bij HCC-patiënten. Kaplan-Meier-analyse van DFS en OS volgens lage versus hoge AF van tumor-infiltrerende mestcellen in de binnenmarge (A, C) en PT (B) van HCC. Afkortingen: HCC, hepatocellulair carcinoom; DFS, ziektevrije overleving; IM, innerlijk invasief; PT, peritumorgebied. De figuur is aangepast met toestemming van Ali et al.26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Klinische achtergrond van patiënten met ingeschreven hepatocellulair carcinoom. Klinische achtergrond van ingeschreven gevallen van hepatocellulair carcinoom. Afkortingen: NAFLD, niet-alcoholische leververvetting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Geschatte waarschijnlijkheid van uitkomsten in Kaplan-Meier-analyse. De geschatte waarschijnlijkheid van RFP, DFS en OS in Kaplan-Meier-analyse. Afkortingen: RFP, herhalingsvrije verhouding; DFS, ziektevrije overleving; OS, algehele overleving. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%202.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Correlatie tussen de gebiedsfractie van tumor-infiltrerende mestcellen, dendritische cellen en natural killer-cellen in verschillende ROI's. Spearman-correlatie (ρ) tussen de gebiedsfractie van tumor-infiltrerende mestcellen, dendritische cellen en natuurlijke killercellen in verschillende ROI's, p < 0,038. Afkortingen: TC, tumorcentrum; IM, binnenmarge; OM, buitenmarge; PT, peritumorgebied; ROI's, regio's van belang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%203.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 4: Univariabele analyse van klinische en pathologische variabelen die verband houden met de tijd tot recidief (TTR), ziektevrije overleving (DFS) en totale overleving (OS). Nee", vrouwelijk geslacht of "A" waren de referentiecategorieën voor dichotome variabelen. Vetgedrukte waarden geven statistische significantie aan op het niveau van p < 0,05. Afkortingen: HR, hazard ratio; BI, betrouwbaarheidsinterval; TTR, tijd tot herhaling; DFS, ziektevrije overleving. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%204.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 5: Univariabele analyse van de associatie van gebiedsfractie van CD117+ mestcellen, CD1a+denderitische cellen en NKp46+natural killer-cellen met TTR, DFS en OS per individuele interesseregio met behulp van de Cox-regressie (67 HCC-patiënten). De oppervlaktefractie van immuuncellen per gebiedssectie (mm2) werd omgezet in percentielen en vervolgens gecategoriseerd in laag (0-25 percentiel) versus hoog (25-100 percentiel). Hazard ratio's geven het relatieve risico weer vergeleken met 1 voor de lage AF. Vetgedrukte waarden geven statistische significantie aan op het niveau van p < 0,05. Afkortingen: AF, oppervlaktefractie; DFS, ziektevrije overleving; OS, algehele overleving; HR, hazard ratio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%205.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 6: De oppervlaktefractie van CD117+ mestcellen per individuele ROI geassocieerd met ziektevrije overleving en totale overleving (multivariabele analyse). Multivariabele analyse van de associatie van de gebiedsfractie van CD117+ mestcellen met DFS en OS in het IM- en PT-gebied met behulp van Cox-regressie (67 HCC-patiënten). De oppervlaktefractie van immuuncellen per gebiedssectie (mm2) werd omgezet in percentielen en vervolgens gecategoriseerd in laag (0-24 percentiel) versus hoog (25-100 percentiel). Hazard ratio's geven het relatieve risico weer vergeleken met 1 voor de lage AF. Vetgedrukte waarden geven statistische significantie aan op het niveau van p > 0,05. Afkortingen: AF, oppervlaktefractie; DFS, ziektevrije overleving; OS, algehele overleving; HR, hazard ratio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%206.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Script voor het maken van ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Supplemental%20File%20(Script%20for%20ROI).zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

De aanwezigheid van mestcellen in de binnenmarge en peritumorgebieden van hepatocellulair carcinoom na resectie verleent een gunstige prognose. Deze studie onderschrijft QuPath-software voor beeldanalyse als een veelbelovend platform dat zou kunnen voldoen aan de behoefte aan reproduceerbaarheid, consistentie en nauwkeurigheid in digitale pathologie.

Mestcellen in de micro-omgeving van hepatocellulair carcinoom geven een gunstige prognose: een retrospectieve studie met behulp van QuPath-beeldanalysesoftware 

The insights provided by in-situ detection of immune cells within hepatocellular carcinoma (HCC) might present information on patient outcomes. Studies ...

We richtten ons op het evalueren van de verdeling van immuuncellen binnen de micro-omgeving van de tumor. Ten eerste helpen we bij de infiltratie van immuuncellen in tumormonsters en aangrenzend niet-tumorweefsel, en vervolgens bepalen we hun prognostische impact bij hepatocellulair carcinoom. De eerste uitdaging is de complexiteit van de tumorstructuren, die de scheiding tussen tumor- en niet-tumorweefsel uitdagend maakt.Bovendien zijn handmatige raketten voor certificering tijdrovend. Ook is niet-specifieke kleuring een erfelijk probleem voor alle immunohistochemische methoden. Boost van de prognose verleend door hoofdcellen in het begraven tumorgebied en de binnenmarge pleit voor verder onderzoek naar hoofdcellen in het hepatocellulair carcinoom en andere kankers.Een dergelijke analyse zou baat hebben bij het gebruik van energieanalysesoftware voor nauwkeurige annotatie van het interessegebied en om de kwantificering van de immuuncellen te corrigeren.

mast-cells-microenvironment-hepatocellular-carcinoma-confer-favorable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.

Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Hier presenteren we een protocol om orthotopische hepatocellulaire carcinoom xenografts met en zonder ligatie van de leverslagader te creëren en niet-invasieve positronemissietomografie (PET) beeldvorming van tumorhypoxie uit te voeren met behulp van [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) en [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG).

Niet-invasieve PET/MR-beeldvorming in een orthotopisch muismodel van hepatocellulair carcinoom

In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.

Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor

Dit protocol schetst een uitgebreide massacytometrie (cytometrie door time-of-flight [CyTOF]) analysemethode voor het evalueren van zowel systemische als lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom (HCC). De aanpak is bedoeld om inzicht te geven in het immuunlandschap van HCC en een beter begrip te bieden van de micro-omgeving van de tumor en de bijbehorende immuunmechanismen.

Massacytometrie-analyse van systemische en lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom

Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om de morfologie van leverstellate cellen in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. Deze benadering combineert fluorescerende labeling van fibroblasten met behulp van muisgenetica, in situ leverperfusie-gebaseerde weefselvoorbereiding en een aangepaste iDISCO-weefselreinigingsmethode om optische transparantie te bereiken.

Mapping van de morfologie van hepatische stellate cellen in muismodellen van leverfibrose

De recellulariseerde extracellulaire matrix van een decellulaire rattenlever kan worden gebruikt als een gehumaniseerd, driedimensionaal ex vivo model om de distributie en transgenexpressie van een virus of vireel vector te bestuderen.

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

Muizen die het Colon-26 (C26) carcinoom dragen, vertegenwoordigen een klassiek model van kankercachexie. Progressieve spierverlies treedt op in combinatie met tumorgroei, overexpressie van spierspecifieke ubiquitine ligasen en verminderingen in spierdoorsnede. Vetverlies wordt ook waargenomen. Cachexie wordt op een tijdsafhankelijke manier bestudeerd met toenemende ernst van vermageringsverschijnselen.

De Colon-26 carcinoom Tumor-dragende Mouse als een model voor de studie van kankercachexia

Dit protocol fungeert als een regeling voor de oprichting van een functioneel Tet-ON systeem in cellijnen van kanker en het latere gebruik ervan, in het bijzonder voor de studie van de rol van tumor cel afkomstige eiwitten in de aanwerving van monocyten/macrofagen aan de communicatie van de tumor.

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

Low-veld (L-band, 1,2 GHz) elektron paramagnetisch resonantie met behulp van oplosbare nitroxyl en trityl sondes is voor beoordeling van fysiologisch belangrijke parameters in de communicatie van de tumor in muismodellen van borstkanker aangetoond.

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

Leer hoe QuPath-beeldanalyse de kwantificering van immuuncellen in hepatocellulair carcinoom verbetert. Deze methode onderzoekt de prognostische waarde van mestcellen in tumormicro-omgevingen.

Mestcellen in de micro-omgeving van hepatocellulair carcinoom geven een gunstige prognose: een retrospectieve studie met behulp van QuPath-beeldanalysesoftware (Video) | JoVE Journal

Mestcellen in de micro-omgeving van hepatocellulair carcinoom geven een gunstige prognose: een retrospectieve studie met behulp van QuPath-beeldanalysesoftware

Meer video's verkennen