Name: Effectieve detectie van Hoechst-zijpopulatiecellen door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Leer hoe je Hoechst-zijpopulatiecellen effectief detecteert met flowcytometrie door alternatieve laserexcitatie bij 375 nm en 405 nm te gebruiken. Deze methode biedt een kosteneffectief alternatief voor de traditionele 355 nm UV-laser.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de subsidies aan J.H. van de National Natural Science Foundation of China (nr. 81800207). De hulp van Beckman Coulter, Inc. bij het bieden van ondersteuning voor flowcytometrie en parameterkalibratie wordt zeer op prijs gesteld. We danken Jiao Chen van het State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University en Yu Qi van Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University, voor hun hulp bij het verzamelen van flowcytometriegegevens.

De experimenten in deze studie gebruikten in totaal 10 C57BL/6 muizen in de leeftijd tussen 8 en 12 weken. Experimentele operaties werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Sichuan University (#201609309). Experimentele materialen en de parameters van flowcytometrie die in dit artikel worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel.
1. Isolatie en verzameling van beenmergcellen van muizen
<ol><li>Euthanaseer muizen in strikte overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Om bewusteloosheid bij de muis op te wekken, dient u inhalatie-anesthetica toe, beginnend met 2% isofluraan, gevolgd door een geleidelijke verhoging van de dosering tot 5% isofluraan tot stopzetting van de ademhaling.</li>
	<li>Ontleed de muizen in de operatiekamer of de zuurkast. Reinig en steriliseer de muizen met 70% ethanol.</li>
	<li>Knip de huid en spier van het been volledig af met een scherpe schaar en ontleed de dijbenen.</li>
	<li>Plet het dijbeen voorzichtig met een maalstaaf in een vijzel en spoel de beenmergcellen weg met DMEM-medium totdat het bot wit wordt.</li>
	<li>Filtreer de verkregen beenmergcellen met een filter van 100 μm in buisjes van 15 ml. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi het supernatans weg en lyseer de resterende rode bloedcellen met 1 ml lysebuffer voor rode bloedcellen gedurende 1 minuut bij 4 °C. Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Na het centrifugeren opnieuw wassen met DMEM medium.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 2 ml incubatieoplossing (DMEM-medium + 5% FBS), tel de cellen met een automatische celteller en pas de celconcentratie aan naar 1,0 x 106 cellen/ml met incubatieoplossing.</li>
</ol>2. Cellulaire kleuring
<ol><li>Vul 2 ml beenmergcelsuspensie van elke muis aan met 5 μg/ml Hoechst 33342. Voeg aan nog eens 1 ml aliquot 100 μM verapamil toe als negatieve controle.</li>
	<li>Incubeer in een waterbad bij 37 °C gedurende 90 minuten met zacht schudden om de 30 minuten.</li>
	<li>Koel de cellen na incubatie 5 minuten af op ijs en centrifugeer vervolgens 5 minuten op 250 x g bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in een koudlopende oplossing (HBSS + 2% FBS). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspendeer de resulterende celpellet in 500 μl stromende oplossing per monster. Voorafgaand aan de FCM-analyse vult u de cellen aan met 2 μg/ml propidiumjodide (PI) en plaatst u ze ongeveer 5 minuten op ijs.</li>
</ol>3. Flowcytometrie
OPMERKING: Voor een overzicht van de verschillende gebruikte systemen en configuraties, zie Tabel 1.
<ol><li>Kalibreer de waarden van de variatiecoëfficiënt (CV) van de vereiste kanalen met behulp van fluorosferen voor dagelijkse kwaliteitscontrole (QC) in de FCM's en voer monstertests uit na de succesvolle voltooiing van de kwaliteitscontrole.<ol><li>Selecteer de snelkoppeling op het bureaublad van de software en start de software.</li>
		<li>Selecteer QC/Standaardisatie starten in het menu QC/Standaardisatie om het QC-experiment te openen.</li>
		<li>Steek de QC-fluorosferen bemonsteringsbuis in de buishouder.</li>
		<li>Selecteer Start om het voorbeeld te laden en begin met het uitvoeren van de QC-procedure. FCM's zijn klaar voor gebruik nadat QC is geslaagd.</li>
	</ol></li>
	<li>Prikkel de Hoechst 33342-kleurstof van dezelfde monsters met een laser van respectievelijk 355 nm, 375 nm en 405 nm voor de detectie van Hoechst-rood in het 690/50 nm-kanaal en Hoechst-blauw in het 450/50 nm-kanaal.<ol><li>Maak een nieuw experiment door Nieuw experiment te selecteren in het menu Bestand, geef het bestandspad op en sla het experiment op.</li>
		<li>Selecteer Kanaal instellen in het menu Instellingen. Schakel het selectievakje voor het kanaalsignaal in (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660) en voeg vervolgens de naam van het reagens toe in de kolom Label (Y585: PI; V450: Hoechst Blauw-405 nm; V660: Hoechst rood-405 nm; NUV450: Hoechst Blauw-375 nm; NUV660: Hoechst Blauw-375 nm; UV450: Hoechst Blauw-355nm; UV660: Hoechst Blauw-355 nm).</li>
		<li>Klik op de pictogrammen Pseudo-kleurplots in het tekengebied om plots te maken. Selecteer de naam van een as om te wijzigen welk kanaal wordt weergegeven.</li>
		<li>Klik op Buis toevoegen in het scherm Reageerbuis om nieuwe monsterbuisjes te maken en hun namen te wijzigen.</li>
		<li>Selecteer Uitvoeren om het voorbeeld te laden, de plots weer te geven en de poorten in te stellen. Pas de versterkings- en drempelinstellingen aan. Selecteer Opnemen om de gegevens op te slaan.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontwerp de logica voor het instellen van de poort.<ol><li>Klik voor de eerste grafiek op de X-as om FSC-W te selecteren en klik op de Y-as om FSC-A te selecteren. Selecteer Polygoonpoort om poort A te tekenen om de individuele cel te omcirkelen en aanhangende cellen uit te sluiten (Figuur 1A).</li>
		<li>Klik voor de tweede grafiek op de X-as om FSC-A te selecteren en klik op de Y-as om SSC-A te selecteren. Selecteer Polygoon Gate om gate B te tekenen om niet-fragmentarische cellen te scheiden en cellulair puin uit te sluiten (Figuur 1B).</li>
		<li>Klik voor de derde grafiek op de X-as om PI-A te selecteren en klik op de Y-as om SSC-A te selecteren. Selecteer de Polygoonpoort om poort D te tekenen. Selecteer Levende cellen met negatieve PI (Figuur 1C) en teken poort C om levende cellen te verkrijgen.</li>
		<li>Voor de vierde tweedimensionale plot klikt u op de X-as om Hoechst Rood te selecteren en klikt u op de Y-as om Hoechst Blauw te selecteren. Klik met de rechtermuisknop op de plot en selecteer Eigenschap in het vervolgkeuzemenu. Selecteer Lineair formaat voorzowel de X-as als de Y-as. Selecteer Polygoon Gate om gate SP te tekenen om SP-cellen te krijgen (Figuur 1D).</li>
	</ol></li>
	<li>Om te beoordelen of het monster in aanmerking komt, gebruikt u 355 nm van een specifieke flowcytometer23 voor SP-celdetectie.</li>
	<li>Gebruik de lasers van 355 nm (laservermogen: 20 mW) en 405 nm (laservermogen: 80 mW) tegelijkertijd om zowel de controlecellen (met toegevoegde verapamil) als experimentele cellen te detecteren.</li>
	<li>Verkrijg fluorescentiesignalen op de kanalen 690/50 nm en 450/50 nm die overeenkomen met de twee lasers. Let op de effectieve stimulatie van de Hoechst 33342 kleurstof door 355 nm en 405 nm lasers met heldere SP-cellen (Figuur 2B-C).</li>
	<li>Gebruik voor dezelfde monsters de lasers van 375 nm (laservermogen: 60 mW) en 405 nm (laservermogen: 80 mW) voor celdetectie.</li>
</ol>

Alternatieve laserexcitatiemethode voor eenvoudige detectie van zijpopulatiecellen

<ol><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li>
<li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li>
<li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li>
<li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+%27side+population%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li>
<li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li>
<li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+still+an+elusive+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).</li>
<li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+PTEN%2FmTOR%2FSTAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).</li>
<li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658(2021).</li>
<li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten gemeld.

We gebruikten het beschreven protocol om drie experimenten uit te voeren, waarbij elke proef 3-4 muizen betrof, wat resulteerde in een totaal van 10 muizen. Het aandeel SP-cellen varieerde van 0,05% tot 0,76%. Het is belangrijk op te merken dat individuele variaties werden waargenomen bij de muizen. We gebruikten vier flowcytometers om de Hoechst-monsters te analyseren. Opgemerkt wordt dat de excitatie van Hoechst-kleurstof door een 20 mW 355 nm laser op de nieuwe versie van flowcytometrie gelijk is aan die van een 100 mW 355 nm laser op ouderwetse flowcytometrie. Dit fenomeen kan worden toegeschreven aan de variatie in lasertypes die in beide systemen worden gebruikt. De mogelijke reden voor het waargenomen effect van 375 nm en 405 nm lasers kan worden toegeschreven aan het aanzienlijke vermogen van beide lasers in combinatie met het gebruik van de lawine fotodiode (APD) detector. Het Hoechst Red-A-kanaal ving de bijna-rode lange golflengte van 690 nm op, waarbij de foto-elektrische conversie-efficiëntie van de fotomultiplicatorbuis (PMT) relatief laag was. De APD toonde echter een foto-elektrische conversie-efficiëntie aan die ongeveer tien keer hoger was dan die van PMT24. Daarom onderscheiden APD-detectoren, in combinatie met krachtige lasers van 375 nm en 405 nm, SP-cellen efficiënt. De 405 nm-laser detecteert niet alleen effectief SP-cellen, maar vertoont ook een superieur vermogen om een subset van zwak Hoechst Red-positieve populaties te onderscheiden in vergelijking met de 355 nm-laser.
De cruciale stap van het protocol is het gebruik van flowcytometrie met een 375 nm laser of een 455 nm laser om cellen te detecteren met 690/50 nm (Hoechst-rood) en 450/50 nm (Hoechst-blauw) kanalen. Hoewel de techniek SP-cellen detecteert met 375 nm en 405 nm lasers in plaats van 355 nm laser (traditionele laser voor het analyseren van SP-cellen1), die vaker voorkomen in FCM's, zijn krachtige 375 nm en 405 nm lasers vereist. Dit leidt tot de beperkingen van deze technologie. Het belang van de methode is om het bereik van lasers die worden gebruikt om Hoechst-kleurstoffen te detecteren uit te breiden, zodat andere modellen van flowcytometrie kunnen worden gebruikt voor SP-celdetectie.

De zijpopulatiecellen (SP) worden geïdentificeerd door middel van Hoechst 33342-kleuring en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie (FCM). De SP-cellen worden gekenmerkt door het pompen van de fluorescerende DNA-kleurstof uit de cellen via hun ATP-bindende cassette (ABC) transporter 1,2. De methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor het isoleren van hematopoëtische stamcellen (HSC's) uit het muizenbeenmerg1. De SP-cellen van het beenmerg werden verrijkt met een populatie van HSC's die werden gekenmerkt door CD117+Sca-1+Lin-Thy1 lage expressie 3,4. Daarna werd de methode veel gebruikt om stamcellen te isoleren en te verrijken uit andere weefsels, waaronder hartspier5, lever6, long7, nier8 en voorhersenen9. In het bijzonder is de methode in het afgelopen decennium toegepast om kankerstamcellen (CSC's) te isoleren. CSC's vertegenwoordigen een kleine populatie cellen die de eigenschappen bezitten van tumorinitiatie, zelfvernieuwing, resistentie tegen chemotherapie en metastatisch potentieel10. CSC's werden aanvankelijk geïdentificeerd bij hematopoëtische maligniteiten11 en vervolgens waargenomen in verschillende solide tumoren zoals de prostaat12, eierstokcarcinomen13, maagcarcinomen14, borst15 en longcarcinomen. Ondanks de beschikbaarheid van verschillende technieken voor CSC-identificatie, blijft de SP-techniek een favoriete keuze vanwege de brede toepasbaarheid in diverse weefsels en cellijnen. Bovendien is het een waardevolle techniek die CSC's isoleert met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)16,17,18. De experimentele bevindingen tonen aan dat SP-cellen een uitgesproken tumorigeniciteit vertonen en verhoogde expressieniveaus van stamcel-geassocieerde genen vertonen19,20. Onze vorige studie21 heeft ook aangetoond dat transcriptomische analyse van geïsoleerde SP-cellen in multipel myeloom verrijking onthult van signaalroutes die verband houden met stamcellen, zoals de egelroute. Ondertussen voerden we pathway-verrijkingsanalyses uit op de genen die differentieel tot expressie komen in de SP-cellen van acute myeloïde leukemie22. De veranderde genen werden verrijkt in stamcelgerelateerde routes (Wnt/β-catenine, TGF-β, Hedgehog, Notch). We ontdekten dat 1 x 105 SP-cellen tumoren konden vormen in BALB/c null muizen22, terwijl niet-SP-cellen dat niet konden, wat aangeeft dat SP-cellen kenmerken hadden van leukemiestamcellen. De doeltreffendheid van de Hoechst SP-methode bij de identificatie van CSC's is evident.
Het Hoechst SP-protocol is verfijnd en verbeterd door de voortgang van het onderzoek. Het protocol omvat een strikte controle van de kleurstofconcentratie, celdichtheid, incubatietemperatuur en -duur, buffersamenstelling en pH-waarde. De celmonsters die in overeenstemming met dit protocol waren bereid, werden onderworpen aan flowcytometrische analyse. Vanwege de excitatie van Hoechst-kleurstof met een UV-laser bij 355 nm en de detectie van de fluorescentie-emissie met zowel een 690/50 nm-filter (Hoechst Red) als een 450/50 nm-filter (Hoechst Blue), is een 350 nm-laser vereist voor FCM. 350 nm-lasers zijn echter niet vaak uitgerust in de meeste FCM's vanwege hun hoge kosten. Daarom hebben we geprobeerd een alternatieve benadering te vinden voor kleurstofexcitatie voor de effectieve detectie van SP-cellen door middel van flowcytometrie. In deze studie werd het vermogen van de 375 nm en 405 nm lasers om SP-cellen te detecteren beoordeeld en vergeleken met dat van de 355 nm laser. Onze bevindingen tonen een opmerkelijke gelijkenis aan tussen de SP-cellen die worden gedetecteerd door de 355 nm, 375 nm en 405 nm lasers. Deze resultaten suggereren dat de krachtige lasers van 375 nm en 405 nm kunnen dienen als haalbare alternatieven voor de 355 nm-laser voor SP-celdetectie. De toevoeging van extra excitatielichtbronnen voor Hoechst 33342 vergemakkelijkt het gebruik van meer flowcytometriemodellen.

<table><tbody><tr><td>Automatische celteller</td><td>Countstar</td><td>1M1200</td><td></td></tr><tr><td>Celfilter(100 &micro;m)</td><td>BIOFIL</td><td>CSS-013-100</td><td></td></tr><tr><td>Dagelijkse kwaliteitscontrole fluorosferen</td><td>Beckman Coulter</td><td>B5230</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's aanpassing van Eagle's Medium met 4,5g/L glucose (DMEM-medium)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CVRC</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>CORNING</td><td>35-081-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Hyclone</td><td>SH30030.02</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Rode bloedcel lysisbuffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr></tbody></table>

effectieve detectie van hoechst-zijpopulatiecellen door flowcytometrie

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

De zijpopulatiecellen (SP) worden geïdentificeerd door middel van Hoechst 33342-kleuring en geanalyseerd met behulp van flowcytometrie (FCM). De Hoechst SP-methode wordt gebruikt voor de isolatie van stamcellen op basis van de kleurstofeffluxeigenschappen van ATP-bindende cassette (ABC) transporters. De methode werd aanvankelijk gebruikt voor de identificatie en isolatie van hematopoëtische stamcellen (HSC's), maar is nu geëvolueerd om zich voornamelijk te richten op de identificatie en isolatie van kankerstamcellen (CSC's). De traditionele detectiemethode van FCM maakt gebruik van een laser van 355 nm om de kleurstof te exciteren om SP-cellen te detecteren. Door deze studie hebben we met succes alternatieve benaderingen voor kleurstofexcitatie geïdentificeerd die de detectie van SP-cellen met behulp van een 355 nm-laser effectief kunnen vervangen. Dit wordt bereikt door het gebruik van krachtige lasers van 375 nm of 405 nm. Dit stelt ons in staat om een verbeterde selectiviteit uit te oefenen bij de detectie van SP-cellen in plaats van alleen beperkt te zijn tot de 355 nm laserflowcytometrie.

In figuur 2 werd de controlegroep behandeld met verapamil, dat ABC-transporters in stamcellen blokkeert om de eliminatie van Hoechst 33342 te voorkomen. Daarbij verdrijven de stamcellen van de niet-verapamilgroep Hoechst 33342 en vormen ze een negatieve celpopulatie die bekend staat als SP-cellen. De 355 nm laser heeft de Hoechst 33342 kleurstof effectief geëxciteerd, wat resulteert in een duidelijke waarneming van SP-cellen van het beenmerg (Figuur 2A). De SP-cellen van dezelfde monsters die door de 355 nm-laser en de 405 nm-laser werden gedetecteerd, bleken in wezen identiek te zijn (figuur 2D).
Uit figuur 2 en figuur 3 zagen we dat andere modellen van niet-traditionele flowmeters ook SP-cellen kunnen identificeren. De resultaten geven aan dat zowel 375 nm als 405 nm lasers Hoechst 33342 effectief exciteerden om SP-cellen te verkrijgen (Figuur 3A-B). Wanneer het nodig is om CSC's of HSC's te detecteren of te isoleren, kunnen we kiezen voor een 375 nm of 405 nm laser in plaats van een 355nm laser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig01.jpg"> Figuur 1: Op flowcytometrie gebaseerde poortinstellingslogica voor het detecteren van SP-cellen. (A) FSC-A en FSC-W werden gebruikt om aanhangende cellen uit te sluiten. Poort A vertegenwoordigt de eencellige cluster. (B) De parameters van FSC-A en SSC-A werden gebruikt voor de verwijdering van cellulair afval. Gate B vertegenwoordigt de niet-fragmentarische celcluster. (C) Levende cellen met negatief propidiumjodide (PI) werden geselecteerd. Gate C vertegenwoordigt de levende celcluster. (D) Fluorescentiesignalen werden verkregen via de kanalen 690/50 nm (Hoechst-rood) en 450/50 nm (Hoechst-blauw). Gate SP vertegenwoordigt het SP-cellencluster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig02.jpg"> Afbeelding 2: Een krachtige laser van 405 nm detecteert SP-cellen net zo effectief als de laser van 355 nm. (A) De Hoechst 33342-kleurstof werd geëxciteerd door de 355 nm-laser van een conventionele flowcytometer om de SP-cellen van het beenmerg te detecteren. (B, C) De SP-cellen van het beenmerg werden geïdentificeerd door de 355 nm en 405 nm lasers van dezelfde FCM. (D) De SP-cellen van dezelfde monsters die door de 355 nm-laser en de 405 nm-laser werden gedetecteerd, bleken in wezen identiek te zijn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig03.jpg"> Afbeelding 3: Krachtige lasers van 375 nm en 405 nm zijn in staat om SP-cellen te detecteren. (A) Een krachtige laser van 375 nm kan SP-cellen detecteren. (B) De SP-cellen van het beenmerg kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van de lasers van 405 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Soort laser</td>
			<td>De golflengte van de laser (nm)</td>
			<td>Laservermogen (mW)</td>
			<td>Hoechst rood filter (nm)</td>
			<td>Hoechst blauw filter (nm)</td>
		</tr><tr><td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td>Het gas van Argon</td>
			<td>355</td>
			<td>100</td>
			<td>692/75</td>
			<td>448/59</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">CytoFLEX LX</td>
			<td rowspan="2">Halfgeleider</td>
			<td>355</td>
			<td>20</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>CytoFLEX S</td>
			<td>Halfgeleider</td>
			<td>375</td>
			<td>60</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr><tr><td>CytoFLEX SRT</td>
			<td>Halfgeleider</td>
			<td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Samenvatting van de configuraties van flowcytometers.

Hier laten we zien dat krachtige lasers van 375 nm en 405 nm Hoechst 33342 effectief kunnen exciteren en kunnen dienen als een levensvatbaar alternatief voor de 355 nm-laser voor celdetectie van zijpopulaties (SP), waardoor het bereik van beschikbare lasers in flowcytometrietoepassingen wordt uitgebreid.

Effectieve detectie van Hoechst-zijpopulatiecellen door flowcytometrie

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

effective-detection-of-hoechst-side-population-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

The following protocol describes a method for isolating the side population of T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL) tumor cells, consisting of stem cells, from an adult Zebrafish. The side population lacks prominent cell markers and hence we use Hoechst 33342 dye efflux assay to isolate them.

Side Population Assay: A Method to Isolate Side Population of Tumor Cells from Zebrafish

In this video, we describe the isolation of a subpopulation of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines using fluorescence-activated cell sorter or FACS. The isolated side population of cells can be used for further downstream analysis.

Cancer Side Population Discrimination Assay: A Method to Isolate Cancer Stem-like Cells Using Hoechst Dye Efflux Assay

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Het begrijpen van de rol van kanker-stamcel-achtige cellen bij tumorrecidieven en resistentie tegen therapieën is in het afgelopen decennium een onderwerp van groot belang geworden. Dit artikel beschrijft de isolatie en karakterisering van de subpopulatie van kanker-stamcel-achtige cellen uit hoofd-hals-plaveiselcelcarcinoom cellijnen (HNSCC).

Isolatie en karakterisering van een hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom subpopulatie hebben van Stem Cell Kenmerken

Het blootgestelde normale oculaire oppervlak bestaat uit hoornvlies en conjunctiva. Epitheliale cellen, spekcellen en immuuncellen zijn aanwezig in de conjunctiva. Hier wordt een niet-invasieve techniek van impressie cytologie beschreven met behulp van een impressie cytologie apparaat en flow cytometrie om immuuncellen in de conjunctiva te analyseren.

Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

Methoden die de karakterisering en isolatie van stamcellenpopulaties van biologische monsters mogelijk maken, zijn cruciaal voor het voorschot van stamcelgerichte behandelingen in kanker en daarbuiten. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor kanker stamcellenisolatie met behulp van het kleurstof geactiveerde zijpopulatie fenotype.

De DNA-kleurstof geactiveerde zijbevolkingsfenotype gebruiken om de kankerstamcellen van biologische monsters te detecteren en te zuiveren

Hier beschrijven we een techniek om de zijkant populatie cellen te isoleren uit een zebravis model van myc-geïnduceerde T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Deze side population test is zeer gevoelig en beschreven voor zebravis T-ALL, maar kan toepasbaar zijn op andere maligne en niet-maligne types zebravis cel.

Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Een handige, snelle en kosteneffectieve methode om het aandeel zijpopulatiecellen in solide tumorcellijnen te meten, wordt gepresenteerd.

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Leer hoe je Hoechst-zijpopulatiecellen effectief detecteert met flowcytometrie door alternatieve laserexcitatie bij 375 nm en 405 nm te gebruiken. Deze methode biedt een kosteneffectief alternatief voor de traditionele 355 nm UV-laser.

Effectieve detectie van Hoechst-zijpopulatiecellen door flowcytometrie

Meer video's verkennen