Extractie en detectie van geosmin en 2-methylisoborneol in water en vis met behulp van soppenextractiesondes met hoge capaciteit en GC-MS

[Verteller] In deze video demonstreren we het proces voor de extractie en detectie van geosmin en 2-methylisoborneol uit zowel water- als vismonsters met behulp van sorptie-extractiesondes met hoge capaciteit en gaschromatografie-massaspectrometrie, of GC-MS. Geosmin en 2-methylisoborneol zijn vluchtige organische stoffen van microbiële oorsprong die voorkomen in beken, vijvers, putten of zelfs recirculerende aquacultuursystemen. Deze geurstoffen kunnen onaangename geuren en smaken afgeven aan water en daarin gekweekte vis, zelfs bij extreem lage concentraties. Hier zien we een wetenschapper die water verzamelt uit een recirculerend aquacultuursysteem. Geosmin- en 2-methylisoborneol watermonsters worden verzameld in bruine glazen flesjes die geschikt zijn voor VOS zonder dat er lucht meer in de injectieflacon zit. Om dit te doen, dompelt u de injectieflacon onder water onder en sluit u deze af, zodat er geen luchtbellen achterblijven. We beginnen met het voorbereiden van onze kalibratie en interne standaarden. Bereid eerst een voorraadoplossing met het label C1 voor door 10 microliter geosmin en 2-methylisoborneoloplossing met een concentratie van 100 microgram per liter toe te voegen aan een maatkolf van 100 milliliter. Vul de kolf tot aan de volumemarkering met methanol van LC/MS-kwaliteit. Dit resulteert in een oplossing die elke analyt bevat in een concentratie van 10 microgram per liter. Vervolgens worden kalibratiestandaarden opgesteld door gespecificeerde volumes van de C1-stockoplossing toe te voegen aan de volumetrische kolven van 100 milliliter en tot volume te vullen met gedeïoniseerd water. Het is belangrijk om dagelijks nieuwe kalibratiestandaarden op te stellen, aangezien deze oplossingen uiterst bederfelijk zijn. Creëer voor de interne standaarden voorraadoplossing I1 door 10 microliter 2-isopropyl-3-methoxypyrazine, ook bekend als IPMP, toe te voegen aan een volumetrische kolf van één liter gevuld met methanol van LC/MS-kwaliteit, waardoor een voorraadoplossing van 10 milligram per liter ontstaat. Bereid vervolgens een tweede oplossing I2 voor door honderd microliter van de I1-voorraadoplossing toe te voegen aan een volumetrische kolf van honderd milliliter en te vullen met gedeïoniseerd water om een concentratie van 10 microgram per liter te bereiken. Begin met het plaatsen van een watermonster van 20 milliliter in de monstertray. Weeg 2,5 gram natriumchloride af en voeg dit toe aan elk monsterflesje. Het toevoegen van zout verbetert de overdracht van geosmin en MIB van het water naar de doorvaarthoogte. Voeg vijf milliliter van het watermonster toe aan elke injectieflacon en verrijk deze met 50 microliter van de interne standaardoplossing I2. Sluit elke injectieflacon onmiddellijk na bereiding af en sluit deze af om het verlies van de analyt te minimaliseren. De volgende stap is de extractie van de analyt. Plaats de monsterlade in de houder van de autosampler-lade en bereid de instrumentmethode voor met de volgende belangrijke instellingen: Pre-sampling roertijd op 10 minuten. Bemonsteringsparameters: Incubeer gedurende 30 minuten bij 65 graden Celsius met een roersnelheid van 400 RPM. Zorg ervoor dat de optie Wash HiSorb-sonde is ingeschakeld om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen. Sondedesorptie: 15 minuten instellen op 270 graden Celsius. Trap-instellingen: Een valbelastingstemperatuur van 25 graden Celsius en een gesplitst debiet van acht milliliter per minuut. Zodra deze instellingen zijn ingesteld, start u de autosampler in combinatie met de GC-MS-methode voor watermonsteranalyse. Voor analyse van visweefsel plaatst u één injectieflacon van 20 milliliter per vismonster in de bak. Homogeniseer het visweefsel met behulp van een keukenmachine en weeg een gram van het gehomogeniseerde weefsel in elke injectieflacon. Voeg vijf milliliter van een verzadigde natriumchlorideoplossing toe en prik elk monster met 100 microliter van de interne standaardoplossing I2. Sluit elke injectieflacon onmiddellijk af en sluit deze af. De extractiemethode voor vismonsters is vergelijkbaar met die voor water, maar met belangrijke verschillen vanwege de lipiderijke aard van visweefsel. Deze verschillen omvatten de roertijd vóór de bemonstering: ingesteld op 20 minuten. Bemonstering incubatietemperatuur: 80 graden Celsius gedurende 30 minuten met een roersnelheid van 400 RPM. Zorg ervoor dat de Wash HiSorb-sondefunctie is ingeschakeld. Zodra deze stappen zijn voltooid, voert u de autosampler uit in combinatie met de GC-MS-methode voor de analyse van vismonsters. Dezelfde GC-MS-parameters zijn van toepassing op zowel water- als visweefselmethoden. De GC is uitgerust met vijf MS kolommen van 30 meter bij 0,25 millimeter bij 0,25 micron. Als draaggas wordt een ultrazuiver helium gebruikt, met een debiet van twee milliliter per minuut. Het ovenprogramma begint met een begintemperatuur van 60 graden Celsius die drie minuten wordt aangehouden, gevolgd door een temperatuurverhoging van 10 graden Celsius per minuut tot 100 graden Celsius, vervolgens 20 graden Celsius per minuut tot 190 graden Celsius en 30 graden Celsius per minuut tot 280 graden Celsius met een uiteindelijke wachttijd van twee minuten. De totale speelduur is ongeveer 16,5 minuten. Voor de overdrachtsleiding tussen de GC en de MS stelt u de temperatuur in op 280 graden Celsius met de ionenbron op 250 graden Celsius en de quadrupel op 200 graden Celsius. Gebruik in de MS voor scanmodus een bereik van 50 tot 350 massa-tot-ladingsverhouding. Gebruik voor geselecteerde ionenbewaking, of SIM, de volgende ionen voor kwantificering en bevestiging: IPMP, 152 en 137 massa-tot-ladingsverhouding. MIB, 95 tot 107 massa-tot-lading verhouding. En geosmin, 112 en 55 massa-tot-ladingsverhouding. Controleer ten slotte altijd handmatig de piekselecties in uw chromatografiesoftware om fouten te voorkomen. Dit protocol schetst de stappen voor de detectie van geosmin en 2-methylisoborneol in water- en vismonsters met behulp van sorptie-extractiesondes met hoge capaciteit en GC-MS. Door deze instructies zorgvuldig op te volgen, kunnen onderzoekers zorgen voor nauwkeurige en betrouwbare resultaten bij het analyseren van de aanwezigheid van deze verbindingen. Figuur één toont het effect van de sondesorptietemperatuur op de overdracht. Een laboratoriumstandaard met geosmin en 2-methylisoborneol van 20 nanogram per liter werd geanalyseerd bij drie verschillende sondesorptietemperaturen. Paneel A geeft de gemiddelde piekgebieden voor geosmin en MIB. Elke sonde werd vervolgens nog twee keer gedesorbeerd bij dezelfde begintemperatuur om de overdracht te beoordelen. De resultaten voor geosmin en MIB zijn respectievelijk weergegeven in paneel B en C. Overdrachten worden uitgedrukt als het piekgebied als percentage van het oorspronkelijke piekgebied. De foutbalken geven de standaarddeviatie weer over drie replica's. De resultaten geven aan dat een hogere desorptietemperatuur de overdracht minimaliseert zonder de gevoeligheid in gevaar te brengen. Figuur twee geeft een vergelijking weer van gecorrigeerd versus niet-gecorrigeerd gegevensherstel voor analytische standaarden bij 15 en 40 nanogram per liter met behulp van PDMS-sondes voor extractie. De monsters werden gecorrigeerd met het gebruik van 2-isopropyl-3-methoxypyrazine, of IPMP, als interne standaard. Zonder correctie was het herstel aanzienlijk lager, met correcties op ongeveer 60% van de bekende pieken. Eenmaal gecorrigeerd, was het herstel bijna 100%, wat het belang aantoont van het gebruik van interne normen voor nauwkeurige kwantificering. Figuur drie vergelijkt de herstelgegevens voor geosmin aan de linkerkant en 2-methylisoborneol aan de rechterkant met 15 nanogram per liter met behulp van twee soorten sondes: PDMS-only en driefasige sondes, die PDMS, divinylbenzeen en koolstof breed bereik bevatten. Beide sondetypes laten goede prestaties zien, hoewel sondes met alleen PDMS iets betere herstelpercentages hadden. Gezien dit resultaat en de kostenbesparingen werden toekomstige analyses uitgevoerd met sondes met alleen PDMS. Figuur vier toont de lineaire regressie van kalibratiecurven voor geosmin en MIB. Het ononderbroken bereik vertegenwoordigt geosmin met een R-kwadraatwaarde van 0,9999, en de stippellijn vertegenwoordigt MIB, ook met een R-kwadraatwaarde van 0,9999. Beide curven vertonen een uitstekende lineariteit met minimale fouten, waardoor de kwantitatieve nauwkeurigheid van de methode over het geteste concentratiebereik wordt gevalideerd. Figuur vijf illustreert de concentraties van geosmin en 2-methylisoborneol in watermonsters van zeven verschillende aquacultuursystemen. Paneel A toont de geosmin-concentraties en paneel B toont de MIB-concentraties. Elk systeem had ten minste drie replicaten en in de meeste gevallen lagen de concentraties van deze verbindingen boven de detectielimieten van de methode. Eén systeem, aangeduid als systeem één, overschreed de menselijke geurdrempel voor geosmine, wat wijst op een mogelijk probleem met de waterkwaliteit in dat systeem. Figuur zes bevat gegevens van twee vismonsters, gelabeld F1 en F2, die waren verrijkt met geosmin en 2-methylisoborneol. Beide verbindingen werden in drievoud geanalyseerd om het herstel en de precisie te bepalen. De concentraties van geosmin en MIB en de puntige vismonsters worden uitgezet, wat aantoont dat de methode in staat is om deze verbindingen nauwkeurig te detecteren, zelfs in lipiderijke visweefsels. De methoden die vandaag worden beschreven, bieden een robuust kader voor de gevoelige detectie van geosmin en 2-methylisoborneol. Door de integratie van sorptie-extractiesondes met hoge capaciteit en nauwkeurige GC-MS-analyse hebben we een techniek gedemonstreerd die onze detectiemogelijkheden aanzienlijk verbetert. Deze methodologische vooruitgang verbetert niet alleen de doorvoer, maar vermindert ook het risico op menselijke fouten en verhoogt de reproduceerbaarheid van de resultaten. Naarmate we deze technieken verder verfijnen, zullen ze ongetwijfeld onmisbare instrumenten worden op het gebied van milieumonitoring en voedselkwaliteitsbeoordeling.