Op flowcytometrie gebaseerde isolatie en therapeutische evaluatie van tumor-infiltrerende lymfocyten in een muismodel van alvleesklierkanker

We richten ons op het ontwikkelen van een methode voor het isoleren en adoptief overbrengen van tumor-infiltrerende lymfocyten, TIL's, in een pancreaskankermodel. We proberen te beantwoorden of de subsets van TIL's pancreastumoren in vivo effectief kunnen aanpakken en doden en hoe T-cellen kunnen worden geoptimaliseerd voor toekomstige klinische onderzoeken. Recente ontwikkeling in adoptieve celtherapie, waaronder het verbeteren van TIL-isolatie- en expressietechnieken, het voorzichtig aanpassen van TIL's om hun targeting te verbeteren en en het combineren van TIL-therapie met andere immunotherapieën zoals checkpointremmers of gerichte therapieën voor verbeterde antitumorwerkzaamheid.

We hebben een robuuste methode ontwikkeld voor het isoleren en uitbreiden van tumorreactieve TIL's uit het muismodel voor alvleesklierkanker. We toonden een verbeterde antitumorwerkzaamheid aan van adoptief overgebrachte tumorreactieve T-cellen. Ons protocol biedt een meer gerichte benadering van adoptieve celtherapie door de isolatie en selectie van tumorspecifieke TIL's mogelijk te maken in vergelijking met andere, minder specifieke methoden.

Het maakt ook gebruik van bioluminescente beeldvorming voor niet-invasieve tumorbewaking. Onze bevindingen zullen het veld vooruit helpen door een gestandaardiseerd preklinisch model te bieden voor het evalueren van de werkzaamheid van TIL-therapie en het optimaliseren van behandelingsparameters van T-celsubsets voor alvleesklierkanker. Om een KPC-Luciferase-celsuspensie voor te bereiden voor het induceren van een orthotope pancreastumor bij muizen, trypsiniseert u de KPC-Luciferase-cellijn gedurende één minuut bij 37 graden Celsius.

Voeg na trypsinisatie PBS toe, breng de cellen over en centrifugeer vervolgens de celsuspensie. Tel de cellen en suspendeer ze in een concentratie van 1 keer 10 tot de macht van 6 cellen per milliliter in PBS met 30% basaalmembraanmatrix. Plaats de verdoofde muis op een bedieningsplatform.

Nadat u een incisie in de linkerbuik van 0,5 tot 1 centimeter hebt gemaakt, houdt u de milt vast met een tang en legt u de alvleesklier bloot. Na het bereiden van de KPC-Luciferase cellen en basaalmembraanmatrix mix, injecteert u 50 microliter van de celsuspensie met 50.000 cellen in de alvleesklier met behulp van een 29 gauge naald. Breng de alvleesklier terug in de buikholte.

Hecht achtereenvolgens het buikvlies en de huid. Laat de muis herstellen op een warm kussentje totdat hij volledig wakker is. Injecteer de muis na zeven dagen intraperitoneaal met 60 microliter D-Luciferine-kaliumzoutoplossing voor live beeldvorming.

Plaats de muis na anesthesie in het in vivo beeldvormingssysteem voor detectie van bioluminescentie. Verwijder de muis na de beeldvorming uit het systeem en laat deze op natuurlijke wijze herstellen van de anesthesie. Plaats om te beginnen de door de donor geëuthanaseerde muis op een besturingsplatform.

Steriliseer het hele lichaam met 75%ethanol. Gebruik in een steriele kap een schaar en een tang om de buikholte te openen. Verwijder de tumor en plaats deze in PBS op ijs.

Meet de tumorgrootte met een noniuskaliber. Bereken vervolgens het tumorvolume met behulp van de formule op het scherm. Na het bereiden van de 1X-digestieoplossing met behulp van collagenase, Dispase II en DNAse I in RPMI 1640, voegt u één tot twee milliliter van de oplossing per putje toe in een plaat met 12 putjes.

Hak de tumoren met een schaar in kleine stukjes. Breng de tumorstukjes over in elk putje van een plaat met 12 putjes en verteer ze bij 37 graden Celsius terwijl je 30 minuten op 70 RPM schudt. Om de spijsvertering te beëindigen, voegt u één tot twee milliliter 10% foetaal runderserum toe en brengt u de celsuspensie over in een verzamelbuisje.

Was de putjes van een plaat met 12 putjes twee keer met PBS om de resterende cellen te verzamelen. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 micrometer, hak de weefselfragmenten fijn en plet ze om de afzonderlijke cellen los te maken met behulp van het platte uiteinde van een spuitzuiger. Centrifugeer het filtraat gedurende vijf minuten bij 400 G bij vier graden Celsius en suspendeer de pellet in 5% runderserumalbumine voor flowcytometriekleuring.

Plaats om te beginnen de cellen geïsoleerd van de tumordragende muis samen met de milt of perifere bloed mononucleaire cellen van de niet-tumordragende muis op een werkend platform. Kleur cellen met FC-blokkers en flow-antilichamen in een verdunning van 1 tot 100. Incubeer de buisjes 30 minuten op ijs in het donker.

Was de cellen na incubatie tweemaal in PBS door centrifugatie voordat u ze opnieuw suspendeert in 1% runderserumalbumine in PBS. Om CD45+CD3+cellen op een flowcytometer te sorteren, poort levende cellen op basis van FSC-A en SSC-A om poort P1 te creëren. Gate vervolgens enkele cellen van P1 op basis van FSC-A en FSC-H om gate P2 te maken. Sorteer CD45+CD3+cellen van P2 met behulp van CD45 en CD3 gating. Verzamel de gesorteerde cellen in verzamelbuisjes.

Centrifuge gesorteerde CD45+CD3+cellen bij 400 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de cellen in muizenserum in een concentratie van 1 keer 10 tot de macht van 6 cellen per milliliter en leg ze op ijs. Plaats de tumor-geïnduceerde ontvangende muis op een operatieplatform.

Gebruik een 29 gauge 1/2-inch insulinespuit om de gesorteerde immuuncellen intraperitoneaal te injecteren. Dien vervolgens interleukine-2 intraperitoneaal toe gedurende drie opeenvolgende dagen.