Snelle en specifieke detectie van Acinetobacter baumannii-infecties met behulp van een op recombinasepolymeraseamplificatie/Cas12a gebaseerd systeem

Mijn onderzoek richt zich op aandoeningen van de luchtwegen en infecties. Ik zal ingaan op de huidige technologieën die op dit gebied vorderen en op de onderzoekslacunes van het hele projectveld. De belangrijkste technologieën waar we het hier over hebben, zijn onder meer sequencing van de volgende generatie, CRISPR, eencellige RNA-sequencing en orgaananalysemodellen. Ze hebben een hard figuur met betrekking tot diagnostiek op standaard hartaandoeningen, werken en komen met een betere behandeling. Mijn protocol komt tegemoet aan de behoefte aan snelle en specifieke detectie van Acinetobacter baumannii, waarbij beperkingen in de huidige diagnostische zaken zoals tijdrovende en op cultuur gebaseerde technieken worden overwonnen.

[Verteller] Ontwerp om te beginnen 12 paar primers met behulp van primerontwerptools op basis van standaard ontwerpprincipes. Verkrijg vier voorwaartse primers en drie omgekeerde primers om 12 primerparen samen te stellen. Evalueer elk primerpaar op specificiteit en werkzaamheid met behulp van de Primer-BLAST-tool van het National Center for Biotechnology Information. Ontwerp vervolgens het CRISPR-RNA of gids-RNA of gRNA met behulp van de LbaCas12a CRISPR-RNA-scaffold-sequentie als de vaste sequentie. Neem een doelspecifiek segment op en zorg ervoor dat het protospacer-aangrenzende motief of PAM zich aan het vijf-priemgetallen van de niet-complementaire streng bevindt. Voor de constructie van het positieve recombinante plasmide wordt eerst het Acinetobacter baumannii 16S rDNA-segment versterkt met behulp van de voorwaartse en achterwaartse primersets. Bereid het PCR-reactiemengsel van 50 microliter voor zoals aangegeven op het scherm. Stel de PCR-cyclusvoorwaarden in op de PCR-machine. Na het zuiveren van het positieve PCR-product, kloon het tot een PUC57-vector die is verteerd met BamHI- en SalI-enzymen. Verdun het positieve recombinante plasmide in tienvoudige stappen met gesteriliseerd dubbel gedestilleerd water. Bewaar het verdunde plasmide bij min 20 graden Celsius voor verdere experimenten. Meng vervolgens primervrije rehydratatiebuffer, voorwaartse en achterwaartse primers van A. baumannii en dubbel gedestilleerd water tot een eindvolume van 465 microliter. Draai en draai het mengsel kort rond voordat het wordt overgebracht naar enzymreactiebuizen uit de RPA-kit. Meng grondig en voeg 25 microliter 280 millimolair magnesiumacetaat toe. Piket vervolgens een microliter van het positieve recombinante plasmide, met 10⁷ kopieën per microliter, aan oplossing A met verschillende primerparen. Incubeer de oplossing gedurende 20 minuten bij 39 graden Celsius. Zuiver vervolgens de versterkte producten met behulp van een RPA-zuiveringskit. Laat het gezuiverde product gedurende 10 minuten op een 1% agarosegel op 120 volt draaien om het primerpaar met de helderste en breedste band te identificeren. Om het RPA-versterkingssysteem te optimaliseren, moeten de concentraties van alle andere reactiecomponenten constant worden gehouden terwijl het uiteindelijke volume van oplossing A wordt aangepast aan 465 microliter. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheden RNA-vrij dubbel gedestilleerd water toe om de uiteindelijke primerconcentraties te verkrijgen zoals gegeven en incubeer. Na het zuiveren en elektroforeren van het RPA-product, identificeert u de optimale primerconcentratie en incubatietijd door de bandintensiteit en -verdeling te analyseren. Om oplossing B te bereiden, mengt u enkelstrengs DNA-reporter, CAST12a-reactiebuffer, CRISPR RNA CAST12a en dubbel gedestilleerd water tot een eindvolume van 15 microliter. Voeg vijf microliter van het recombinasepolymeraseamplificatie- of RPA-product toe aan oplossing B. Meng grondig tot een homogeen. Plaats de monsters in een fluorescentie kwantitatief PCR-instrument. Verkrijg voor specificiteitstesten DNA-sjablonen van verschillende soorten met behulp van een referentie-DNA-extractiekit of door bacteriën in water te koken. Gebruik water als negatieve controle. Breng 10 nanogram, of één microliter, van de DNA-sjablonen over in oplossing A met voorwaartse en achterwaartse primers. Piket vervolgens 25 microliter 280 millimolair magnesiumacetaat. Meng grondig en incubeer 20 minuten bij 39 graden Celsius. Voeg na de incubatie vijf microliter van het reactieproduct toe aan oplossing B en meng. Plaats de monsters in een fluorescentie kwantitatief PCR-instrument. Stel het kanaal in op FAM en lees in totaal 60 minuten elke minuut het fluorescentiesignaal af bij 39 graden Celsius. Gebruik voor de gevoeligheidsevaluatie van het op RPA-CRISPR CAST12a gebaseerde detectieplatform een positief recombinant plasmide verdund tot concentraties variërend van één tot 10⁷ kopieën per microliter als sjabloon voor de reactie. Gebruik water als negatieve controle. Breng het plasmide over naar oplossing A, voeg magnesiumacetaat toe en incubeer zoals eerder aangetoond. Lees na incubatie en overdracht naar oplossing B het fluorescerende tekenal. Het primerpaar F3-R3 werd geïdentificeerd als het meest effectief voor recombinasepolymeraseamplificatie, met de helderste en dichtste banden op agarosegelelektroforese. De optimale primerconcentratie voor amplificatie werd vastgesteld op 0,44 micromolair en de optimale reactietijd was 20 minuten. De fluorescentie-intensiteit van CRISPR RNA1 nam in de loop van de tijd toe, terwijl CRISPR RNA2 dat niet deed, wat leidde tot de selectie van CRISPR RNA1 voor A. baumannii-detectie. De specificiteitsanalyse bevestigde dat het A. baumannii-detectorsysteem uitsluitend A. baumannii-DNA detecteerde, zonder dat er fluorescentie werd waargenomen voor andere bacteriële DNA-monsters. Het systeem kon slechts één kopie per microliter DNA detecteren, waardoor het zeer gevoelig is. De laterale flowstriptest bevestigde de hoge specificiteit van de detectiemethode en toonde geen kruisreactiviteit met andere bacteriesoorten. De A. baumannii-test detecteerde met succes DNA in verdunningen van 10⁷ kopieën per microliter tot een enkele kopie per microliter, wat de robuustheid ervan onder UV-licht bevestigt.