Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca²⁺ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Het onderzoek heeft tot doel in-vitro-cardiale microfysiologische modellen te bevorderen door materiaalgebaseerde fotostimulatiemethoden te integreren. Het richt zich op het overwinnen van beperkingen in levensduur en stimulatie-invasiviteit, het bieden van betrouwbare hulpmiddelen voor het bestuderen van hartfysiologie, het verbeteren van screeningprocessen voor geneesmiddelen en het bevorderen van toepassingen in ziektemodellering. De recente ontwikkelingen in de hefboomwerking van biostimulatie, zoals voor nauwkeurige niet-invasieve cellulaire controle.

Optogenetica maakt genetische modificatie mogelijk om cellulaire activiteit te reguleren, terwijl opkomende op materiaal gebaseerde fototransducers niet-genetische alternatieven bieden. Deze innovatie zorgt voor een belangrijke doorbraak in het bestuderen en moduleren van neuronen, cardiomyocyten en skeletspiercellen in diverse toepassingen. Huidige experimentele uitdagingen zijn onder meer het bereiken van consistente lichtafgifte aan diepe weefsels, het optimaliseren van de biocompatibiliteit en stabiliteit van fototransducers en het verbeteren van de precisie van op licht gebaseerde stimulatietechnieken.

Bovendien blijft de integratie van deze methoden met complexe biologische systemen met behoud van cellulaire levensvatbaarheid en functionaliteit een belangrijke hindernis. Dit protocol pakt de onderzoekskloof aan van de behoefte aan niet-invasieve nauwkeurige stimulatietechnieken in cardiale microfysiologische modellen. Door gebruik te maken van op materiaal gebaseerde fototransducers, zoals Ziapin2, overwint deze benadering de beperkingen van traditionele elektrische stimulatie en optogenetica, en biedt het een verbeterde temporele en ruimtelijke contour met behoud van de levensvatbaarheid en functie van het weefsel.

Mijn bevindingen zullen het onderzoek bevorderen door de introductie van een niet-invasieve, op materiaal gebaseerde lichtstimulatietechniek die meer precisie en controle biedt over cellulaire activiteit in hartweefsels. Deze benadering elimineert de noodzaak van genetische modificaties en biedt een veelzijdig hulpmiddel voor het modelleren van de hartfunctie, het bestuderen van ziektemechanismen en het ontwikkelen van effectievere therapeutische strategieën. Plak om te beginnen twee lagen laboratoriumtape, een witte en een blauwe, op een één millimeter dikke heldere, kras- en ultravioletbestendige acrylplaat.

Snijd het chippatroon op de tape volgens het beoogde ontwerp en snijd vervolgens met behulp van een koolstofdioxidelasergraveerder de acrylplaat in cirkels. Verwijder de twee lagen tape in de binnenste lijn met een pincet. Week de frites 30 minuten tot een uur in puur bleekmiddel om dikke lijnen en donkere vlekken van het snijden te verwijderen, zodat er een scherpe lijn overblijft, en spoel de frites een nacht of ten minste drie uur af in een bekerglas met stromend gedeïoniseerd water.

Sonificeer de chips gedurende 10 minuten in de polydimethylsiloxaan, of PDMS-stempels, met lijngroeffuncties gedurende 30 minuten in schone 70% ethanol. Breng de chips en stempels over op een schone plek onder een kap en laat ze ongeveer één tot twee uur drogen onder een luchtstroom. Sonificeer vervolgens de vers bereide gelatine gedurende 15 minuten en doe deze vervolgens terug in het waterbad van 65 graden Celsius tot hij klaar is voor gebruik.

Plaats de microbiële transglutaminase, of MTG-buis, in een exsiccator met de dop iets los en zet langzaam het vacuüm aan om de bubbels te verwijderen. Na het ontgassen zet je de MTG-buis terug in het waterbad van 37 graden Celsius. Bedek vervolgens een rastervel met schone parafilm en leg de chips op het rooster.

Houd de PDMS-stempel in de buurt voor gebruik. Voeg vijf milliliter MTG toe aan vijf milliliter gelatineoplossing en pipetteer voorzichtig om luchtbellen te voorkomen. Verdeel nu snel ongeveer 0,5 milliliter van het gelatinemengsel op elke chip en zorg ervoor dat het mengsel het chipgebied bedekt.

Plaats de PDMS-stempel met lijnpatroon erop en breng een gewicht van 200 gram aan om ervoor te zorgen dat de gelatine evenwijdig aan de lengteas van het weefsel wordt gevormd. Zodra alle chips zijn gegoten, bedekt u ze met een glazen pot om verstoring van het milieu te voorkomen en laat u ze 's nachts verknopen. Breng de chip en PDMS-stempel tussen elkaar over naar een nieuwe P150-schaal gevuld met PBS om de gelatine 30 minuten tot een uur te hydrateren om de scheiding van de PDMS-stempel van de chip te vergemakkelijken.

Nadat u overtollige ontvormde gelatine rond de chip hebt verwijderd, brengt u de schone chip over naar een nieuwe P150-schaal gevuld met PBS. Bewaar de PDMS-stempels in 70%ethanol. Om de chips te steriliseren, laat u ze 10 minuten onder de kap in ethanol weken.

Breng de chips over naar PBS, laat ze 10 minuten weken, gevolgd door een drievoudige PBS-wasbeurt. Meng voor de coatingoplossingen 20 microgram per milliliter fibronectine met een verdunning van één tot 100 Geltrex in kweekmedia zonder supplement. Bestrijk de chips met deze oplossing gedurende twee uur in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Ontdooien en zaaien door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten in RPMI-medium dat 10 micromolaire Y-27632 bevat. Vervang het medium na 24 uur door RPMI zonder Y-27632. Gebruik drie dagen na het zaaien van de cellen een pincet om de witte tape voorzichtig van de chips te verwijderen.

Bereid het optische mappingapparaat voor, bestaande uit een gemodificeerde microscoop met tandemlens uitgerust met een hogesnelheidscamera en een kwiklamp van 200 milliwatt als excitatielichtbron. Plaats een dichroïsche spiegel voor de daarvoor bestemde calciumbeeldcamera. Voor optische stimulatie past u optische puntstimulatie toe aan het ene uiteinde van het weefsel met behulp van een LED-lichtbron om Ziapin2, de fototransducer, te stimuleren.

Tempo de weefsels met een frequentie van 0,5, of één hertz, via een tijdelijk gereguleerde optische vezel die op een millimeter afstand van het weefsel is geplaatst. Incubeer het monster met twee micromolaire X-Rhod-1 die gedurende 30 minuten aan het kweekmedium zijn toegevoegd bij 37 graden Celsius. Na het wassen van de frites met vers kweekmedium, overbrengen naar fenolroodvrij RPMI 1640 medium, aangevuld met B-27 minus insuline en HEPES.

Plaats de tissuechips in een schaal met temperatuurregeling die is ingesteld op fysiologische temperatuur en start de opnames met een framesnelheid van 2.5 frames per seconde. De voortplanting van calciumgolven werd met succes gevisualiseerd, met een duidelijke ruimtelijke en temporele resolutie tijdens fotostimulatie op frequenties van 0,5 of één hertz, met geleidingssnelheden berekend als ongeveer 4,5 centimeter per seconde, consistent met fysiologische waarden. Calcium transiënte parameters, waaronder amplitude, stijgtijd, maximaal verval, helling en vervaltijd, waren kwantitatief vergelijkbaar tussen lichtstimulatie en elektrische stimulatie, wat vergelijkbare functionele responsen bevestigde.