Opstellen van in-vitromodellen van dorsale wortelgangliacultuur: complementaire benaderingen voor het onderzoeken van overspraak tussen kanker en zenuw

Ons onderzoek richt zich op overspraak tussen kanker en zenuw, waarbij gebruik wordt gemaakt van 3D dorsale wortelganglia- of DRG-explantaten en 2D-gedissocieerde culturen om neurogeleide tumormigratie te kwantificeren en om moleculaire strategieën te testen om hun interactie te beperken. Met dit protocol hebben we complementaire 3D- en 2D-DRG-culturen opgezet, de groei van neurieten geoptimaliseerd en een toename van de invasie van kankercellen langs de neurietextensies aangetoond. We hebben het gebrek aan reproduceerbare modellen aangepakt die zowel ingewikkelde interacties op celniveau als intacte zenuwarchitectuur vastleggen door complementaire 2D- en 3D-DRG-culturen te creëren van een enkele muis.

Ons protocol levert gepaarde 3D-explantaten en 2D-neuronculturen op van een enkele muis, waardoor de hoekige textuur behouden blijft, beeldvorming met een hoge inhoud mogelijk is, het gebruik van dieren wordt verminderd en we in staat zijn om gegevens op weefselniveau en eencellige gegevens te verkrijgen in één experiment. Ons model opende vragen over welke DRG-gecreëerde factoren invasie veroorzaken, hoe neuronactiviteit, leeftijd en genotype deze vormgeven, en of het richten op neurotrofe factorreceptoren de verspreiding van neurietgeleide kanker zou kunnen verminderen. Leg om te beginnen een geëuthanaseerde muis op zijn buik.

Scheer de vacht en concentreer u op het gebied boven de wervelkolom om het dorsale oppervlak bloot te leggen. Spuit 70%ethanol over de rug van het dier. Veeg met keukenpapier van staart tot schedel af om losse vacht te verwijderen en besmetting tijdens dissectie te voorkomen.

Maak met een gesteriliseerde schaar een rechte incisie langs de dorsale middellijn van de staart tot de schedel. Trek met een stompe tang de huid aan beide zijden van de incisie terug om de wervelkolom bloot te leggen. Gebruik nu een nieuwe schaar en tang om besmetting te voorkomen en maak een horizontale incisie aan het uiteinde van de wervelkolom.

Maak vervolgens twee parallelle longitudinale incisies aan weerszijden van de wervelkolom om deze los te maken. Gebruik een tang om de wervelkolom voorzichtig op te tillen en het omliggende bindweefsel te verwijderen. Om de wervelkolom volledig los te laten, maakt u een incisie aan de bovenkant van de wervelkolom bij de schedel.

Breng de wervelkolom over naar een voorgekoelde plaat van 10 centimeter met HBSS met penicilline-streptomycine die op ijs wordt bewaard. Gebruik vervolgens een veerschaar om eventueel achtergebleven bindweefsel van de wervelkolom te verwijderen en de wervels bloot te leggen. Breng de bijgesneden wervelkolom over op een microscooptafel.

Splits de kolom voorzichtig langs het sagittale vlak met behulp van een veerschaar. Verwijder met een tang met een fijne punt het ruggenmerg uit de kolom om de dorsale wortelganglia langs de wortels van de ruggenmergzenuwen te onthullen. Knip de ruggenmergzenuwen door met een veerschaar.

Verwijder vervolgens al het omringende bindweefsel van de dorsale wortelganglia. Gebruik een tang met een fijne punt om de dorsale wortelganglia voorzichtig uit de dorsale wortels te halen. Voor een hele kweek plaatst u de DRG's in een plaat van drie centimeter met HBSS met penicilline-streptomycine op ijs.

Gebruik voorgekoelde pipetpunten om twee microliter gekoelde Matrigel te doseren in elk putje van een glaasje met glazen bodem met acht putjes die in een plaat van 10 centimeter op ijs zijn geplaatst. Om voortijdige polymerisatie te voorkomen, pipetteert u slechts één druppel per keer. Gebruik vervolgens een tang met fijne punt om een ganglion van de dorsale wortel op een droge plaat te plaatsen.

Draai voorzichtig om overtollig HBSS te verwijderen. Breng vervolgens het schone ganglion van de dorsale wortel over in de Matrigel-druppel. Nadat alle ganglions in de druppels zijn overgebracht, incubeer je de dia met glazen bodem in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten om de Matrigel te laten polymeriseren.

Voeg vervolgens voorzichtig 200 microliter warme aangevulde kweekmedia toe aan elk putje. Incubeer de dia bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Gebruik helderveldmicroscopie om de dorsale wortelganglia dagelijks te controleren op neuronale uitgroei en levensvatbaarheid.

Centrifugeer een conische buis van 15 milliliter met gepoolde dorsale wortelganglia bij 200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel na het uitpipetteren van de HBSS de ganglia af met voorverwarmde gesupplementeerde media en klop er zachtjes op. Centrifugeer de buis vervolgens vijf minuten op 200G om de DRG's te pelleteren.

Vervang de media door een milliliter papaïneoplossing. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator, waarbij u elke vijf minuten zachtjes roert. Voeg vervolgens 10 milliliter toegevoegde media toe om de papaïne te neutraliseren en meng voorzichtig.

Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 400G om de dorsale wortelganglia te pelleteren. Nadat u het supernatant hebt uitgepipetterd, voegt u een milliliter collagenase type IV toe aan de Dispase II-oplossing en incubeert u opnieuw. Voeg 4,5 milliliter gesupplementeerde media toe om de enzymoplossing te neutraliseren, meng voorzichtig en centrifugeer.

Voeg na het pipetteren van het supernatant vijf milliliter gesupplementeerde media toe. Voeg vervolgens Dnase I toe om een eindconcentratie van 0,2 milligram per milliliter te bereiken. De ganglia van de dorsale wortel zou er nu uit moeten zien als een losse klomp, wat wijst op volledige spijsvertering.

Gebruik voor mechanische dissociatie een filterpipetpunt van 1.000 microliter om de ganglia-oplossing te trituleren door vier tot vijf keer op en neer te pipetteren. Schakel over op een pipetpunt van 200 microliter en herhaal de trituratie door vier tot vijf keer te pipetteren. Filtreer de resulterende troebele suspensie door een celzeef van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter.

Spoel de zeef vervolgens geleidelijk af met 10 milliliter media om een volledige overdracht van cellen te garanderen. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie gedurende vijf minuten bij 1.000 G om de cellen te pelleteren. Verwijder de media uit de pellet en suspendeer de celpellet opnieuw in 500 microliter gesupplementeerde media.

Verwijder eventuele resterende PBS uit de putjes van de glaasje met acht putjes. Verdeel de gedissocieerde dorsale ganglia-suspensie over de met collageen beklede putjes en broed uit. Gebruik helderveldmicroscopie om de van de dorsale wortelganglia afgeleide cellen dagelijks te controleren, de levensvatbaarheid van de cellen en de neuronale uitgroei te beoordelen Voor het co-kweken van de hele muizenganglia met kankercellen zuigt u eerst de media op van de hele DRG-culturen op de glaasje met acht putjes.

Voeg met behulp van een pipet voorzichtig 200 microliter van de kankercelsuspensie toe aan het putje met de Matrigel-druppel en de dorsale wortelganglia. Incubeer het co-cultuurglaasje in een bevochtigde broedmachine bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Ververs de media dagelijks door één keer te wassen met 200 microliter verwarmde aangevulde media en voeg 300 microliter verse media toe.

Voor de co-cultuur van gedissocieerde ganglia en de kankercellen, aspireert u de media op van de gedissocieerde DRG-culturen op de glaasje met acht putjes met glazen bodem. Verdeel vervolgens voorzichtig 200 microliter van de kankercelsuspensie in elk putje vóór de incubatie. De vestiging van DRG was minder efficiënt bij afwezigheid van supplementen en de extensie van neurieten was duidelijk verminderd.

Hele DRG's van oudere dieren produceerden minder overvloedige en beter te onderscheiden neurietextensie en minimale gliacellen, waardoor visualisatie van interacties tussen zenuwkankercellen werd vergemakkelijkt. De dissociatie van DRG-neuronen met behulp van twee enzymatische stappen resulteerde in een hoger herstel van neuronen. Binnen 24 uur na kweek werden niet-neuronale cellen, zoals schwan-cellen, macrofagen en fibroblasten, duidelijk, terwijl neurieten die ontspruiten uit DRG-afgeleide cellen werden waargenomen en na 72 uur verder toenamen.

Kankercellen gezaaid in met Matrigel beklede transwell-inserts drongen binnen in de richting van HEC293-cellen, maar niet in de richting van DRG-neuronen na 24 uur incubatie. Whole-mount DRG-culturen ondergedompeld in een Matrigel-druppel zorgden ervoor dat neuriet zich naar buiten uitbreidde door de matrix naar de periferie. Met een zorgvuldige positionering van de DRG centraal in de druppel, zorgt voor een maximale uitbreiding van de neuriet zonder de randen te overwoekeren.

Kankercellen vestigden zich na 12 uur co-cultuur rond de grens van de Matrigel-druppel die de DRG bevatte. Na 72 uur co-cultuur waren kankercellen de Matrigel binnengedrongen en naar het ganglion bewogen, waarbij directe interactie tussen de extensies van de dorsale ganglioncellen en kankercellen werd waargenomen. Co-cultuur van gedissocieerde DRG-afgeleide cellen met kankercellen maakte een gedetailleerde visualisatie van individuele celinteracties mogelijk.