Fabricage van een uitbreidbare hersenmatrix die aanpasbaar is over ontwikkelingsstadia

Fabricage van een uitbreidbare hersenmatrix die aanpasbaar is over ontwikkelingsstadia, door Chapman en collega's aan de University of Kentucky in Lexington, Kentucky. De ontwikkeling van het biggetjesbrein lijkt op verschillende vlakken sterk op die van een menselijk brein. In vergelijking met ratten en muizen is de verhouding tussen biggetjeshersenen en hersengewicht vanaf geboorte tot volwassenheid veel dichter bij die van mensen en zijn de functionele gebieden van biggetjes- en menselijke gyri- en cefalische hersenen zeer vergelijkbaar.

Om deze redenen neemt het gebruik van varkens en andere grote zoogdieren in neurowetenschappelijk onderzoek toe. Commerciële hersenmatrices voor grotere zoogdieren zijn echter duur, en de keuze is vaak beperkt tot één enkele grootte of vlak van doorsnijding. Daardoor bieden commerciële matrices mogelijk geen goede match voor verschillende stammen, zowel mannelijke als vrouwelijke soorten, en voor verschillende leeftijden.

Dit is vooral problematisch voor ontwikkelingsneurowetenschappelijke studies, waarin hersengroottes sterk veranderen bij postnatale groei. Zo groeien de hersenen van biggetjes snel in de eerste drie maanden en nemen meer dan drie keer zoveel in volume toe. De commerciële biggelet-hersenmatrix is ontworpen om hersenen van biggetjes tot twee weken oud te kunnen plaatsen.

Hier presenteren we een op acrylplaten gebaseerde aanpasbare matrixbouwmethode als een kosteneffectieve en eenvoudig te implementeren oplossing voor dit probleem. Voor dit experiment werden vier naïeve, vier dagen oude varkens verkregen. Eén werd gebruikt voor hersenverzameling op vijfjarige leeftijd, twee op 32-jarige leeftijd en één op 38-jarige leeftijd.

Na het verwijderen van de hersenen uit de schedel werd de hersenen twee dagen lang onderdompeld in 10% gebuffreerde formaline en vijf dagen in een 30% sucroseoplossing geplaatst voor cryoconservering. Vervolgens zullen we presenteren hoe je een afgietsel van de hersenen kunt maken met agarosegel. De eerste stap bij het maken van de matrix is het maken van een mal van de hersenen.

We zullen het proces illustreren voor het maken van een mal van een postnatale dag vijf biggeelhersen, die gebruikt zal worden om een sagittale matrix te bouwen. Plaats een strook zwaar plastic op de bodem van de glazen container, waarbij beide uiteinden uit de randen van de container uitsteken. Deze strook maakt het verwijderen van het agaroseblok makkelijker.

Doe de container ongeveer half onder in een emmer nat ijs. Verwarm in een glazen beker 150 milliliter PBS tot 90 graden Celsius en voeg zes gram agarose toe, terwijl je constant roert. Giet langzaam de 4%agarose-oplossing om een laag van een halve tot een centimeter dikte op de bodem van de container te creëren en laat deze stollen.

Bedek de hersenen volledig met een dunne laag minerale olie om te voorkomen dat de agarose aan het hersenoppervlak bindt of in de sulci blijft hangen. De olie maakt het verwijderen van de hersenen uit de agarosegel ook veel beter beheersbaar. Zodra het is gecoat, plaats je de hersenen op de dunne laag agarose in de gewenste oriëntatie voor een coronale of sagittale afmal, zo recht en rechtop mogelijk.

Laat de agaroseoplossing afkoelen tot 50 graden Celsius terwijl je constant roert om een gietbare viscositeit te behouden. Giet daarna de agaroseoplossing over de hersenen totdat deze volledig is ingebed. Laat de agarose bij kamertemperatuur stollen.

Snijd de agaroselaag boven de hersenen door een chirurgische sonde te volgen door de hersencontour te volgen. Zodra de snede rond de hersenen klaar is, gebruik je een dunne spatel om voorzichtig de bovenste laag van de agarose los te halen. Let erop dat je tijdens deze stappen het brein niet snijdt of beschadigt.

Haal voorzichtig het hele brein uit de mal. Het zou relatief gemakkelijk moeten loskomen vanwege de minerale olie die eerder op het oppervlak is aangebracht. Zorg ervoor dat je eventuele kleine stukjes agarosegel verwijdert die in de afdruk zijn beland.

Verwarm 98 milliliter PBS in een beker tot 9 graden Celsius en voeg vier gram agarose en twee milliliter Indiase inkt toe. Roer goed. Giet deze zwarte agaroseoplossing in de afdruk die de hersenen maken, waarbij je erop let dat de afdruk niet overloopt.

Laat de zwarte gel uitharden. Houd beide uiteinden van de plastic strip vast en til het hele agaroseblok uit de container. We zullen nu illustreren hoe je sjabloonplaten voor je matrix kunt maken.

Om de hersenmal te snijden, leg je één stuk schaalpapier tussen twee transparante acrylplaten van 76 millimeter en leg je die dicht bij de rand van de tafel. Gebruik vervolgens klemmen om vier hoekblokken vast te zetten en twee acrylplaten om twee muren te bouwen die de agaroseblokken strak in de gewenste oriëntatie houden. De voorranden van de twee metalen hoekblokken en de twee verticale acrylplaten moeten langs één kant van het schaalpapier worden uitgelijnd.

Plaats het agarosegelblok zodat de te knippen rand uitlijnt langs het schaalpapier en met de randen van de verticale acrylplaten en hoekvierkanten, en plaats een gewicht aan de andere kant van het agaroseblok om het op zijn plaats te houden. Snijd overtollig materiaal van het blok totdat de Indiase inktafdruk bijna wordt afgeknipt. Beweeg het agaroseblok met de gewenste stappen naar voren, bijvoorbeeld twee millimeter of vijf millimeter met behulp van de markeringen op het onderliggende schaalpapier.

Pak het mes stevig vast met beide handen en leid het langs de voorranden van zowel acrylplaten als hoekblokken om het blok te snijden. Plaats elke plak op een tweede vel schaalpapier en druk stevig om een afdruk op het papier over te brengen. Maak met een pen de hele plak omlijnd.

Verwijder het sneetje en omlijn de hersencontour die wordt geïdentificeerd door de India-inkt. Let op de oriëntatie van de eerste plak op het schaalpapier, bijvoorbeeld achteraan en vooraan bij sagittale secties, en houd deze consistent wanneer er gedurende het proces extra gelplakjes aan het papier worden toegevoegd. Nummeren elk en volgend overtrekken.

Snijd de acrylplaten op 10 bij 8 1/2 centimeter. Stapel ze vervolgens en bevestig ze aan het niveau van een boormachine met hoekblokken en klemmen. Boor drie gaten door de stapel met de coördinaten die in het manuscript zijn aangegeven.

Verwijder de beschermende folie van de acrylplaten. Plaats vervolgens een acrylplaat boven een sjabloon op het schaalpapier en lijn de bovenkant van de acrylplaatlijnen uit op de bovenranden van het sjabloon. Trek de omtrek van de hersenen met een permanente stift op de acrylplaat.

Label elke plaat zodat deze overeenkomt met het nummer van het sjabloon of de hersentracing. Met de lintzaag zaag je elke plaat langs de gekopieerde sjabloonlijnen. Als alternatief kan een roterend gereedschap met een houtsnijpunt worden gebruikt om ongewenste plekken te verwijderen.

Polijst de snijkant met een roterend gereedschap met een polijstende schuurtip om de randen glad te maken, omdat scherpe randen het brein tijdens het snijden kunnen beschadigen. Controleer opnieuw de nauwkeurigheid van het snijden door de acrylplaat over de template te plaatsen. Trim en polijst indien nodig.

Vervolgens illustreren we de assemblage van de platen. Assembleer de matrix vooraf door de platen in sequentiële volgorde te stapelen en controleer de uitlijning van de platen. De matrixassemblage begint met het plaatsen van drie lange roestvrijstalen bouten door de eerste acrylplaat en vervolgens een ring op elke schroef plaatsen.

Plaats de tweede plaat en voeg ringen toe aan elke schroef. Als alternatief kunnen de ringen met secondelijm rond de verankeringsgaten worden gelijmd, zodat de ringen niet individueel bij elke montage hoeven toe te voegen. Herhaal dit proces totdat alle platen achter elkaar aan de bouten zijn bevestigd.

Draai alles aan met een moer op elke bout. Voer een laatste polijsting uit van de randen die naar de hersenen wijzen om een soepelere overgang van plaat naar plaat te maken. Gebruik verschillende gekleurde stiften om de bovenrand van de acrylplaten met afwisselende kleuren te kleuren, zodat het snijden veel makkelijker wordt.

Hier wisselden we zwarte, rode en ongemarkeerde platen af. Tot slot demonstreren we het proces om de hersenen te snijden in het coronale of sagittale vlak. Om de hersenen te snijden, plaats je deze in de matrix in dezelfde oriëntatie als tijdens het vormproces en zo recht mogelijk.

Je hebt een bred, plat mes nodig om het brein te snijden. Het brede blad beperkt de kans op draaien of buigen tijdens het snijden. Wij raden een hoogprofiel cryostatblad aan.

Voor de veiligheid wikkel je ongeveer twee centimeter lang één uiteinde van het lemmet met laboratoriumtape om ruimte te creëren om het omwikkelde uiteinde veilig vast te houden tijdens het snijden van de hersenen. Een waarschuwing hier. Omdat elk deel van de hersenen na formalinefixatie verschillende texturen heeft, moet er voorzichtig worden geacht om gelijkmatige druk op het mes uit te oefenen.

Bovendien is het biggetjesbrein groot, dus het is beter om een snijdende beweging te gebruiken om de hersenen te snijden dan een directe, naar beneden duwende snijden. Het mes moet met constante kracht van de ene naar de andere kant worden getrokken, waarbij het ver genoeg naar beneden gaat om door het hele brein te snijden. Doe alle plakken in een met PBS gevulde zesputplaat of roestvrijstalen bak.

Leg de plakjes voorzichtig in de bak, houd de volgorde en oriëntatie van de plakjes aan, en bewaar of ga verder waar nodig. Om de geometrie aan te passen of de holte uit te breiden voor een betere pasvorm voor de hersenen, kunnen geselecteerde acrylplaten worden verwijderd of toegevoegd om de matrix aan te passen aan verschillende hersenmaten. Hier illustreren we de uitbreiding van een sagittale matrix die is gebouwd voor een P5-biggetjesbrein door verschillende platen, hier blauw en groen gekleurd, toe te voegen aan het middengedeelte van de matrix.

De matrix is nu geschikt voor sagittale doorsnijding van een P38-biggetje. Het vermogen om de matrix uit te breiden of te verkleinen verhoogt de flexibiliteit van de matrix aanzienlijk en kan zowel materialen als inspanning besparen. Net als bij het coronale snijden snijd je voorzichtig de hersenen in het sagittale vlak met opeenvolgende platen om het blad te leiden.

Het kleurcodeersysteem helpt de juiste sequentiële plaatsing van het blad te identificeren, wat lastig is wanneer de plakken dun zijn. Haal de hersenen uit de matrix en haal de plakjes voorzichtig uit elkaar. Tot slot hebben we een eenvoudige, kosteneffectieve en flexibele methode ontwikkeld om hersenmatrices te creëren voor neonatale biggen.

Dit concept kan worden toegepast op oudere varkens en op andere grote dierenmodellen.