High-plex beeldvorming met behulp van spectrale confocale microscopie om niet-specifieke weefselfluorescentie te minimaliseren

We optimaliseren een IBEX-workflow die heparineblokkering en spectrale detectie combineert om de achtergrond in eosinofielrijke menselijke weefsels te onderdrukken. Autofluorescentie en eosinofiel-granulabinding verhullen het ware signaal. We richten ons op beide om schone high plex-maps mogelijk te maken.

Om te beginnen teken je een cirkel op de glazen glijbaan rond het gemonteerde weefsel met een pappen om een hydrofobe barrière te creëren. Voeg ongeveer 100 microliter PBS toe aan elk weefsel om het te rehydrateren, en laat de glaasglaasje ongeveer twee minuten op kamertemperatuur incuberen om de optimale snijtemperatuurverbinding af te spoelen. Aspiraat de PBS rondom het weefsel met een zuigglas Pasteur-pipet.

Voeg vervolgens 100 microliter blokkingsfilter toe aan elk weefsel en incubeer een uur op kamertemperatuur in een vochtige kamer. Aspireer nu de blokkeringsbuffer met een pipet. Voeg 100 microliter kleuring toe die aan elk weefsel wordt gemengd en breng de glaasglaasje 's nachts in een afgedekte vochtigheidskamer in een koelkast op vier graden Celsius uit.

Bereid evenzo een doorsnee voor die is gekleurd met slechts één fluorofoor en een negatieve controle zonder kleuring om het fluorofoorspectrum en weefselautofluorescentie te definiëren. Na het aspireren van het kleurmengsel was je het tissue drie keer met PBS en aspireerde je na elke wasbeurt de vloeistof. Bevestig het monster op de microscoop voor beeldvorming.

Focus op het monster met brightfield of differentiële interferentiecontrastmodus. Schakel vervolgens over naar fluorescentiemodus en configureer de spectrale acquisitieparameters volgens de experimentele eisen. Wijs de juiste lasers toe aan de fluoroforen die in het experiment worden gebruikt.

Kies een bundelsplitser die overeenkomt met de gekozen laserlijnen. Stel alle detectoren in staat om het volledige emissiespectrum vast te leggen en pas de beeldresolutie aan op een van de vooraf gedefinieerde resoluties. Of kies de maximale resolutie.

Pas de gaatjesgrootte aan op één area-eenheid voor optimale optische doorsnede. Optimaliseer de laserinstellingen vóór acquisitie. Met een sectie die met alle markers is gekleurd, start continue scanmodus bij lage lasersterkte.

Pas de masterversterking van elke detector en de laserintensiteiten aan totdat alle markers identificeerbaar zijn met een goede signaal-achtergrondverhouding. Fijn afstemmen van laserintensiteiten en iteratief afwisselen tussen enkelkleurige en meervoudige kleursecties totdat alle fluorofoorsignalen zichtbaar zijn zonder oververzadiging. Schakel de tegelfunctie in in de acquisitiesoftware in en definieer het tegelverwervingsgebied rond het weefsel om volledige beelddekking te garanderen.

Optimaliseer de focus voor het tegelverwervingsgebied in het midden van het weefsel. Identificeer een uniek structureel kenmerk zoals een onderscheidende set cellen in een herkenbare opstelling om als referentie voor uitlijning in latere beeldvormingsrondes te dienen. Schakel nu de Z-stack-functie in en ga naar het Z-stack-tabblad.

Onder het midden-tabblad stel je het aantal sneden in op minstens zes met een interval van minstens één micrometer tussen de sneden. Klik op de middenknop om het huidige focuspunt dat in de vorige stap is bepaald als de middelste snee van de stapel in te stellen. Klik op de knop 'experiment starten' om beeldverwerving te starten.

Zodra de verwerving is voltooid, klik je met de rechtermuisknop op de afbeeldingsminiature, selecteer je Opgeslagen als. Kies een bestandslocatie en geef de afbeelding een naam. Maak een back-up van de afbeeldingsgegevens naar een veilige opslag. Ontmeng de afbeelding met dezelfde geoptimaliseerde instellingen die tijdens de verwerving van tegelregio's worden toegepast.

Leg een snap vast van elke enkelgekleurde controle om het ware signaalspectrum te verkrijgen en van de ongekleurde controle om achtergrond of autofluorescentie vast te leggen. Gebruik deze beelden uitsluitend voor spectrale ontmenging. Bevestig dat het geselecteerde gebied een echt signaal vertegenwoordigt door te controleren of de intensiteit en morfologie afwezig zijn of gelijkwaardig zijn aan achtergrondniveaus in de ongekleurde controlegroep en dat de lokalisatie van de markers overeenkomt met het verwachte cellulaire patroon zoals membraan, nucleaire, cytoplasmatische of afgescheiden distributie.

Open de snap-afbeelding in de software. Klik op het unmixing-tabblad en selecteer een van de regioselectietools onder het tabblad unmixed tools, teken een regio van interesse of ROI rond het positieve signaal om het spectrum van dat gebied te genereren. Vergelijk elk gegenereerd spectrum met het theoretische emissiespectrum van de bijbehorende fluorofoor.

Zorg ervoor dat het gebied het ware signaal nauwkeurig weergeeft. Noem elk spectrum volgens de identiteit van de fluorofore en sla het op in de spectrale database. Vervolgens laad je de tegelafbeelding en open je de ontmengentool.

Gebruik de plusknop om de referentiespectra van elke fluorofore aan de ontmengingslijst toe te voegen. Klik op de lineaire ontmengingsknop om de spectrale signalen te scheiden en het ongemengde beeld op te slaan. Bereid het bleekmiddel voor in een dampkap.

Met een microspatel weeg je 10 milligram lithiumborhydride direct in een droge beker. Voeg voorzichtig 10 milliliter ultrazuiver water toe aan de beker en meng tot de verbinding volledig is opgelost. Voeg ongeveer 100 microliter van de vers bereide bleekoplossing toe aan elke weefselsectie met een glazen Pasteur-pipet en incubeer de glaasjes op kamertemperatuur gedurende 15 minuten in de dampkap.

Als bleekstralend violet uitvalt, breng dan voorzichtig de glaasglaasje over naar een epifluorescentiemicroscoop en selecteer het doppy-filter. Focus het monster en verlicht het op volle kracht. Gebruik nu een 5X objectief om een groter lichtveld te bereiken en verlaag de trap volledig om contact tussen de slide en het objectief of de behuizing te voorkomen.

Tot slot giet je de lithiumborhydrideoplossing uit elke put met een glazen Pasteur-pipet en geef je deze terug in de oorspronkelijke beker met bleekoplossing. Was de glaasjes drie keer met verdunningsbuffer en laat ze ongeveer drie minuten incuberen tijdens elke was. Voeg het antilichaammengsel toe en kleur het monster zoals eerder getoond.

Bij onbehandelde neuspoliepweefselkleuring met CD3 vertoonden CD4 en CD20 intense niet-specifieke granulaire fluorescentie in eosinofielrijke gebieden. Terwijl het echte membraangelokaliseerde signaal bij lagere intensiteit aanwezig was. Voorbehandeling met 5% magere melk slaagde er niet in om de niet-specifieke fluorescentie volledig te blokkeren en verminderde ook de signaalintensiteit van fluoroforen zoals AF 532.

Dab pre-behandeling verminderde de niet-specifieke fluorescentie van CD20, CD3 en CD4, maar verminderde ook de werkelijke signaalintensiteit over meerdere kanalen, waaronder DAPI en AF 532. Voorbehandeling met heparine blokkeerde effectief de niet-specifieke binding, terwijl de signaalintensiteit voor CD3, CD4, CD20 en DAPI behouden bleef. Heparine blokkeerde niet-specifiek signaal op een concentratieafhankelijke manier, met volledige onderdrukking bereikt bij 10 eenheden en geen nadelige effecten bij hogere concentraties.

Een driesporige beeldvormingsopstelling verkortte de opnametijd, maar introduceerde crosstalk, inclusief doorbraak van AF 594 naar het PE-kanaal, en verbeterde autofluorescentie van het weefsel door meerdere laserexcitaties. Spectrale beeldvorming elimineerde vrijwel alle achtergrond- en crosstalk, terwijl de opnametijd werd verminderd en de signaal-achtergrondverhouding werd verbeterd. Spectrale IBEX-beeldvorming van een menselijke neuspoliep toonde epitheelstructuren gemarkeerd door EpCAM.

immuuncellen zoals CD3-positieve en CD20-positieve lymfocyten, en vaten die CD31 en CD34 tot expressie brengen. Heparinebehandeling elimineerde granulebinding zonder het signaal te verminderen, waardoor sterke achtergrondsuppressie gedurende IBEX-cycli behouden bleef. Spectrale ontmenging minimaliseert doorvloeiing, en autofluorescentie verhoogt het signaal naar de achtergrond, wat multi-panel acquisitie aanzienlijk versnelt ten opzichte van multi-track confocaal.

Dit maakt robuuste ruimtelijke proteomica en uitdagende weefsels mogelijk, wat nauwkeurige celtoestandsmapping en analyse op buurtniveau ondersteunt.