Vooruitgang in de metabole profilering van driedimensionale hersentumorsferoïden voor screening op geneesmiddelen

Het onderzoek heeft tot doel de vorming van 3D-celwortels te optimaliseren voor het bestuderen van het energiemetabolisme met behulp van Seahorse-technologie, met de nadruk op metabolische activiteit van celgedrag en geneesmiddelresponsen in ons klinisch relevante model. Deze bevindingen zullen de modellen voor het gieten van geneesmiddelen verbeteren door een nauwkeurigere weergave van hersentumoren te bieden, de therapie-evaluatie en metabole analyse te verbeteren voor betere behandelingsstrategieën. De resultaten maakten de weg vrij voor het onderzoeken hoe het energiemetabolisme verandert in 3D-sferoïde modellen, hoe geneesmiddelen effecten op metabole routes verlaten en de mechanismen waarmee metabole veranderingen bijdragen aan de ontwikkeling van tumorresistentie tegen therapie.

Na het opnieuw suspenderen van de verzamelde U87-cellen in DMEM, verwarm je het ongebruikte medium voor op 37 graden Celsius. Houd de celsuspensies gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Verdun op basis van het initiële celaantal de celsuspensie met DMEM met 10% FBS tot een eindvolume van 20 milliliter, zodat u ongeveer 200.000 cellen krijgt.

Meng de uiteindelijke celsuspensie grondig door herhaalde inversie. Voeg langzaam 200 microliter van de suspensie toe langs de rand van elk putje in een transparante ronde bodem ultra-lage bevestiging 96-wells plaat, en sluit de plaat vervolgens goed af met parafilm om lekkage tijdens het centrifugeren te voorkomen. Plaats de verzegelde plaat in de centrifuge en draai gedurende twee minuten op 200 G om de cellen op de bodem van elk putje te pelleteren.

Haal de plaat uit de centrifuge. Verwijder voorzichtig de parafilm en plaats de plaat in een broedmachine van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Om een coatingoplossing te bereiden, lost u vijf milligram Poly-D-Lysine op in 50 milliliter steriel water en mengt u de oplossing grondig tot deze volledig is opgelost.

Voeg 30 microliter van de coatingoplossing toe aan elk putje van de metabole testplaat. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan door de plaat voorzichtig te schudden of de overtollige oplossing op te zuigen. Incubeer de plaat met het deksel erop gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, zuig vervolgens de coatingoplossing op en was de putjes twee keer met 200 microliter steriel water.

Laat de plaat minimaal 30 minuten aan de lucht drogen en verwarm de plaat vervolgens 30 minuten op 37 graden Celsius zonder kooldioxide om de coating te stabiliseren. Voeg daarna 175 microliter voorverwarmd medium toe aan elk putje. Bewaar de plaat op 37 graden Celsius in een kooldioxidevrije incubator, totdat hij klaar is voor celsferoïdeoverdracht.

Breng de sferoïde platen na vijf dagen kweek over naar een beeldvormingssysteem met een hoge inhoud. Om de beeldvormingsparameters te configureren, stelt u de temperatuur in op 37 graden Celsius en het kooldioxidegehalte op 5%Pas het plaattype, de kanalen en het focusbereik aan op de systeeminstellingen. Verkrijg vervolgens sferoïde beelden met behulp van een confocale microscoop met 10-voudige objectieven en de beeldvormingssoftware, identificeer vervolgens putten met intacte sferoïden en noteer hun posities voor overdracht.

Wijs de intacte sferoïden toe aan twee groepen, een controlegroep met zes gerepliceerde putjes en een behandelingsgroep met zes gerepliceerde putjes voor behandeling met fenofibraat. Bereid de fenofibraatwerkoplossing in vers voorverwarmd medium in de optimale concentratie. Verwijder de sferoïde-bevattende plaat met lage bevestiging voorzichtig van het beeldvormingssysteem en plaats deze op een steriel oppervlak in een bioveiligheidskast.

Plaats de met Poly-D-Lysine gecoate testplaat ernaast voor overdracht en snijd vervolgens de punt van een pipet van 20 microliter af om de celsferoïden voorzichtig op te zuigen zonder schade aan te richten. Zuig met de bijgesneden pipetpunt voorzichtig elke intacte sferoïde op vanaf de bodem van de put. Breng elke sferoïde over naar het overeenkomstige putje van de gecoate plaat en laat het 20 seconden bezinken.

Breng de 3D-sferoïde testplaten over naar een beeldvormingssysteem met hoge inhoud. Als u de morfologische gegevens wilt analyseren, past u de module voor textuurgebieden toe op het grof scheiden van 3D-sferoïden van de achtergrond door de afbeeldingsinhoud in drie clusters te verdelen op basis van textuurkenmerken. Pas de module voor het zoeken van afbeeldingsgebied toe om de scheiding van voorgeïsoleerde 3D-sferoïden te verfijnen met behulp van op volume gebaseerde groottekenmerken, zodat onzuiverheden worden verwijderd en intacte sferoïden behouden blijven.

Meet de morfologische parameters van de 3D-sferoïden met behulp van de module morfologie-eigenschappen. Pas de module voor het selecteren van populaties toe om alleen echte 3D-celsferoïden te filteren en te behouden, en exporteer vervolgens de resultaten van de morfologische gegevens. Spheroïden werden zichtbaar gevormd op de vijfde dag van de kweek, waarbij een uniforme sferische morfologie werd behouden over alle waargenomen monsters.

Een gedesintegreerde sferoïde met zichtbaar verstoorde structurele integriteit werd ook waargenomen op dag vijf. Analyse na overdracht toonde aan dat zowel controle- als met fenofibraat behandelde 3D-sferoïden in de meeste gevallen intact bleven, maar dat sommige met fenofibraat behandelde sferoïden uiteenvielen. Het zuurstofverbruik was significant verminderd in met fenofibraat behandelde sferoïden op alle tijdstippen in vergelijking met de controlegroep.