Modellering van mitochondriale ziekten met behulp van hersenorganoïden: een focus op mitochondriale encefalomyopathie, lactaatacidose en beroerte-achtige episodes

De scope van ons onderzoek is het begrijpen van mitochondriale ziektemeter en het vinden van medicijnen om dit te behandelen. De uitdaging is om het vermogen voor high-throughput assays te behouden, ook al bevat de techniek organoïdevorming. Om te beginnen verwijder je het medium van geïnduceerde pluripotente stamcelkweekplaten wanneer deze ongeveer 70 tot 80% confluent zijn.

Was de cellen met PBS. Voeg 350 microliter enzymoplossing toe aan de cellen en incubeer. Voeg 800 microliter steel fit medium toe om de reactie te stoppen.

Na het overbrengen van de celsuspensie naar een verse buis, centrifugeer deze op 190G gedurende vijf minuten bij 22 graden Celsius. Vervolgens suspendeer je de pellet opnieuw in één milliliter differentiatiemedium. Na het tellen van de cellen zaai je 3000 cellen in 100 microliter in elke put van een U-vormige 96-wells lage hechtingsplaat.

Incubeer zes dagen bij 37 graden Celsius, met 5% kooldioxide. Na de incubatie gebruik je een brede pipet om de organoïden van de 96-wellplaat over te brengen naar een schaal van 10 centimeter. Pipetteer 50 microliter aangevuld DMEM/F12-medium in elke put van een nieuwe 96-wellplaat.

Verzamel de organoïden in buisjes van twee milliliter. Verwijder het medium voorzichtig zonder de organoïden te aspireren en voeg 1,5 milliliter aangevuld DMEM/F12-medium toe. Voeg na het pipetteren van de laatste wasbeurt 500 microliter vers medium toe.

Vervolgens leg je de organoïden in een schaaltje van 10 centimeter. Voeg vijf milliliter medium toe om het plukt van elke organoïde te vergemakkelijken. Breng alle organoïden over in elke put van een 96-put plaat met een micropipet ingesteld op 50 microliter, en incubeer drie dagen.

Op dag negen verzamel je de organoïden in twee milliliter buizen en spoel je drie keer met DMEM/F12. Vervolgens worden de organoïden opnieuw opgehangen in een differentiatiemedium. Breng ongeveer 10 organoïden per put over in een zes-put plaat en pas het uiteindelijke volume medium in elke put aan op twee milliliter.

Kweek het bord statisch zes dagen lang bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Op de 15e dag verzamel je de organoïden in buisjes van 15 milliliter. Nadat de buisjes hebben gezakt, voeg je na het uitpompen van het supernatant een nieuw differentiëringsmedium toe met B27 en vitamine A.

Breng ongeveer 10 organoïden per put over in een zes-put plaat. Kwek de organoïde statisch gedurende 15 dagen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Bedek de kweekplaten met de verdunde poly-L-Ornithine-oplossing.

Breng de platen een nacht uit bij 37 graden Celsius. De volgende dag was je de putten drie keer vijf minuten lang elk met PBS. Voeg nu verdunde laminineoplossing toe aan de putten.

Incubeer de platen drie uur bij 37 graden Celsius, of 's nachts. Centrifugeer de organoïde suspensie op 200G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en voeg één milliliter enzymoplossing toe.

Meng goed en incubeer vijf minuten bij 37 graden Celsius voordat je het centrifugeert. Na het verwijderen van het supernatant en het toevoegen van één milliliter dispersieoplossing, legt u de isolatieoplossing zorgvuldig onder de suspensie. Centrifugeer de suspensie vervolgens op 200G gedurende vijf minuten.

Pipetteer nu één milliliter neuronaal medium in de buis. Meng de oplossing en voer de vering door een 70 micrometer zeef in een buis van 50 milliliter. Na het tellen van de cellen zaait men de celsuspensie met een dichtheid van 100.000 cellen per vierkante centimeter op platen met poly-L-Ornithine en laminine.

Vervang het medium elke vier tot zeven dagen tot dag 60. Om de organoïden vast te zetten voor immunofluorescentie, oogst je eerst de organoïden in microbuisjes. Spoel de organoïden af met PBS en fixeer ze vervolgens in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.

Na de fixatie was je de gefixeerde organoïden drie keer met PBS. Bewaar de organoïden op vier graden Celsius totdat ze gebruikt worden. 30 dagen na het zaaien voor 2D-neuronale kweek, verwijder het kweekmedium van de platen.

Was daarna de cellen met PBS. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Pipet de paraformaldehyde eruit en spoel de cellen daarna drie keer met PBS.

Bewaar de vaste cellen op vier graden Celsius totdat ze gebruikt zijn. Om de organoïden voor RTQPCR te verzamelen, worden de organoïden overgebracht in microbuisjes. Pipetteer PBS in de buizen om de organoïden te wassen.

Voeg nu 350 microliter lysisbuffer toe aan de organoïden en vries ze vervolgens in vloeibare stikstof. Bewaar de buizen op min 80 graden Celsius totdat ze gebruikt zijn. Hersenorganoïden met FOXG1-positieve neuronen werden succesvol geïnduceerd uit de gezonde controlelijn IPSC-lijn 414C2 op dag 30, en 2D-gekweekte neurale netwerken werden verkregen op dag 60.

Heteroplasmatische niveaus van de M.3243A tot G-variant werden bevestigd door QPCR. Lijn twee tot acht had een lage heteroplasmatie, en lijnen twee tot en met zes een hoge heteroplasmatie. Hersenorganoïden afkomstig van de lijn twee tot acht met lage heteroplasmatie vertoonden groottes en morfologieën die vergelijkbaar waren met die van gezonde controles.

Organoïden gegenereerd uit de lijn twee tot zes met hoge heteroplasmatie vertoonden een verminderde grootte van 0,3 vierkante millimeter en een onregelmatige morfologie met een circulariteitswaarde van 0,82. De meeste neuronen die werden geïnduceerd van de 414C2-lijn en de twee tot acht lijnen waren FOXG1-positief op dag 30 en 60. FOXG1-positieve neuronen werden zelden gedetecteerd in organoïden of 2D-gekweekte neuronen afkomstig van de twee- tot zes-lijn.

Onze resultaten suggereren dat door patiënten afgeleide IPSC-gebaseerde organoïdemodellen een nuttig platform vormen voor het bestuderen van spiegels, mechanismen en voor drugsscreening. Onze conventionele methoden met een korte kweektijd en kosteneffectiviteit bieden praktische hulpmiddelen om de pathofysiologie van MILIS te onderzoeken. We willen potentiële geneesmiddelen voor MELIS zoeken door in de toekomst verbindingen te gebruiken die door patiënten georganiseerd worden toegediend.