Karakterisering van door adipocyten afgeleide extracellulaire vesikelsecretie met behulp van een CD63-GFP Reporter Mouse Model in vivo en in vitro

We bestuderen extracellulaire blaasjes (EV's) afkomstig van adipocyten, om hun rol in vetweefsel te definiëren, met name hoe ze de crosstalk tussen volwassen adipocyten en hun voorlopercellen reguleren. Er zijn momenteel geen in vivo systemen om adipocyten EV-secreties te bestuderen, en de bestaande zuiveringsprotocollen zijn nog niet volledig geoptimaliseerd. Om te beginnen gebruik je een steriele techniek om inguinaal vetweefsel uit geëuthanaseerde muizen te verwijderen.

Plaats één gram weefsel in een buisje van twee milliliter met 0,5 milliliter verteringsbuffer. Met een steriele schaar snijd je het weefsel in stukjes die niet groter zijn dan één millimeter. Suspendeer het gemalen weefsel in 10 milliliter verteringsbuffer met 0,5 milligram per milliliter Liberase en 50 eenheden per milliliter DNase I. Incubeer het monster bij 37 graden Celsius op een orbitale shaker.

Tijdens de broedtijd keer je de buis meerdere keren voorzichtig om. Wanneer de oplossing troebel lijkt en er geen zichtbare weefselfragmenten meer overblijven, is de vertering voltooid. Om stromale vasculaire fractie of SVF te isoleren, verdun je de verteerde suspensie met twee volumes verteringsbuffer.

Draai de buis voorzichtig drie tot vier keer om om goed te mengen. Laat de suspensie door een steriel filter van 100 micrometer lopen om onverteerd weefsel te verwijderen, en centrifugeer vervolgens het filtraat op 300g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Label de pellet als SVF.

Incubeer de stromale vasculaire fractie in een vers bereide rode bloedcel lysebuffer op ijs gedurende vijf minuten, beschermd tegen licht. Voeg twee volumes wash buffer toe en centrifugeer op 400 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Sussen de stromale vasculaire fractie opnieuw in 80 microliter buffer per gram weefsel en breng de inhoud over in een nieuwe buis.

Voeg 20 microliter niet-adipocyten progenitor-depletitor-cocktail per gram weefsel toe. Breng het monster 15 minuten uit bij twee tot acht graden Celsius in het donker. Laat het monster door een LS-kolom lopen en verzamel de stroom die de afstammingsnegatieve celfractie bevat.

Centrifugeer de doorstroming op 300g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om de adipocyten-voorlopercellen te verkrijgen. Incubeer 250 microliter geïsoleerde muizen-adipocyten-voorlopercellen muizen op collageen-gecoate acht-wellen kamerglaasjes gedurende zes uur. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten om cellulaire en extracellulaire blaasjesstructuren te behouden voor beeldvorming.

Was vervolgens de dia's drie keer met PBS en monteer ze dan met antifade medium. Vervolgens, na het tellen van de adipocyten-voorlopercellen, suspenderen ze en de levensvatbaarheidskleurstof verdunden. Broed 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht.

Was de cellen één keer met wasdemper en centrifuge. Suspendeer de cellen in een briljante kleuringsbuffer zodat de uiteindelijke concentratie 1 miljoen cellen per 100 microliter is. Blokkeer niet-specifieke binding door Fc-receptorblokkerend reagens toe te voegen in een verhouding van één tot 100 en incubeer.

Laat het SCA-1-antilichaam 10 minuten vrij draaien bij 6000g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Voeg het SCA-1 antilichaam toe aan de APC-buis met een verdunning van één tot 100, en plaats de buis vervolgens op ijs, beschermd tegen licht. Was de cellen twee keer met één milliliter wash buffer, centrifugeer dan op 300g gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.

Suspendeer de cellen in een washbuffer voor flowcytometrie-sortering en verzamel vervolgens de gegevens van SCA-1 positieve en GFP positieve cellen op een spectrale flowcytometer uitgerust met een violette en blauwe laser. Om te beginnen met het onderscheiden, bedek gerechten met 0,2% gelatine, gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Zaad vers geïsoleerde APC's in aangevuld DMEM/F12-medium en broed tot confluentie.

Vervang het medium van dag één tot dag acht door MesenCult adipogene differentiatiemedium. Op dag negen was je de adipocyten twee keer met PBS en vervang je het medium door een volwassen adipocytenkweekmedium met DMEM 1% BSA en 0,2% Primocin. Om door adipocyten uitgescheiden extracellulaire blaasjes te isoleren, voer eerst 15 milliliter kweekmedium door een filter van 40 micrometer, gevolgd door een filter van 30 micrometer.

Centrifugeer het filtraat op 500g gedurende vijf minuten en centrifugeer het supernatant op 2000g gedurende 10 minuten om eventuele resterende cellen en vuil te verwijderen. Na het laten doorlopen van het resulterende supernatant door een 0,8-micrometer filter en het filtraat overbrengen naar een 15-milliliter ultrafiltratie-eenheid, centrifugeer je op 4000g gedurende 15 minuten om het medium te concentreren. Laad het geconcentreerde monster op een grootte-uitsluitingschromatografiekolom die is aangesloten op een automatische fractieverzamelaar en verzamel fracties F1 via F8.To voer Western blot analyse uit en concentreer elke fractie van 400 microliter tot 25 microliter.

Pipette 50 microliter radioimmunoprecipitatie-assaybuffer aangevuld met protease- en fosfataseremmers aan het concentraat. Voeg 75 microliter van twee 2x SDS-laadbuffers toe om het monster te denatureren en eiwitten op te lossen op een 4% tot 12% Tris-glycine gel. Voor nanodeeltjesvolging, verdun extracellulaire blaasjesmonsters met 0,1 micrometer gefilterd steriel PBS en meng voorzichtig.

Laad het verdunde monster in het NTA-instrument dat is uitgerust met een hooggevoelige wetenschappelijke complementaire metaaloxide-halfgeleidercamera en een 532-nanometer groene laser. Stel detectie in voor deeltjes tussen 10 nanometer en 1.000 nanometer, en binnen een concentratie van 10 tot een kracht van zes tot tien tot een kracht van negen deeltjes per milliliter. Adipos-voorlopercellen van stop-flock-flock/CD63GFP muizen toonden geen detecteerbare groene fluorescerende eiwitpuncta onder confocale microscopie.

Terwijl cellen van AdipCD63-muizen talrijke duidelijke groene fluorescerende eiwitpuncta door het cytoplasma vertoonden. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat 1,2% van de positieve cellen van schedel 1 in de meldermuizen groen fluorescerend eiwit tot expressie bracht, vergeleken met 12,6% bij AdipCD63-GFP-muizen. Westelijke blotting van grootte-uitsluitingschromatografie toonde aan dat extracellulaire blaasmarkers CD63 en HSP70 verrijkt waren in fracties F1 en F2. Terwijl markers van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën ontbraken, wat de blaaspuurheid bevestigde.

Nanopartikel-trackinganalyse toonde aan dat extracellulaire blaasjes van adipocyten varieerden in grootte van 50 nanometer tot 500 nanometer, en transmissie-elektronenmicroscopie bevestigde dat de vesikels intacte dubbele membraanstructuren vertoonden. Western blot bevestigde knockout van STX4 in adipocyten. Confocale microscopie toonde aan dat CD63-GFP positieve blaasjes verspreid waren door het cytosol in wildtype adipocyten, maar zich ophoopten nabij het plasmamembraan in STX4 knockout-adipocyten.

De concentratie van gesecreteerde adipocyten-afgeleide extracellulaire blaasjes was significant verminderd in STX4 knockout-adipocyten vergeleken met het wildtype. Western blot met gelijke eiwithoeveelheden intracellulaire vesikels vertoonde een verminderde expressie van CD63 en CD81 in STX4 knockout-adipocyten vergeleken met het wildtype. Het protocol biedt een robuust en reproduceerbaar systeem om de secretie van adipocyten EV in vivo en in vitro te bestuderen, evenals een geoptimaliseerde adipocyt EV-zuiveringsmethode.

Het protocol beschrijft en valideert voor het eerst het gebruik van seriële laagsnelheidscentrifugaties gecombineerd met grootte-uitsluitingschromatografie om EV's te zuiveren die afkomstig zijn van volwassen adipocyten. Onze bevindingen stellen ons in staat nieuwe vragen te stellen over hoe adipocyten extracellulaire blaasjes gebruiken om te communiceren met andere celtypen onder fysiologische en pathologische omstandigheden.