Spectroscopische superresolutiebeeldvorming van DNA-moleculen met intrinsiek contrast

Ons onderzoek presenteert het eerste protocol voor het meten van intrinsieke fluorescentiespectra van DNA-moleculen, waardoor hun natuurlijke optische eigenschappen en sequentiebevestigingskenmerken onderzocht kunnen worden. Dit protocol maakt gebruik van endogene fluorescentie voor DNA-spectroscopische beeldvorming, waarbij labeling-geïnduceerde verstoring, koppelingsfouten en inconsistente gelabelde dichtheid in bestaande methoden worden vermeden. Om te beginnen lost je het DNA-monster op in nucleasevrij gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 millimolair.

Bereid vijf microliter-aliquots van de DNA-voorraadoplossing voor om herhaalde vries-dooicycli te minimaliseren. Bewaar de extra buizen met de voorraadoplossing bij 4 graden Celsius. Maak een glazen preparaat voorzichtig schoon met een laboratoriumdoekje.

Pipetteer vijf microliter van de 100 millimolaire DNA-oplossing op de vers gereinigde glazen glaasglaasje en laat het monster één tot drie uur drogen om een DNA-gel te vormen. In een dampkap bereid je ofwel de bèta-mercaptoethanolbuffer of de DABCO-beeldbuffer voor om stochastische fotoswitching van DNA-moleculen te ondersteunen. Pipette vijf microliter van de beeldvormingsbuffer op de DNA-gel en plaats een deksel bovenop het monster.

Als er belletjes in het bedekte monster aanwezig zijn, gebruik dan een pincet om ze te verwijderen. Verkrijg een gefabriceerde nanogatarray met gaten van 100 nanometer diameter, vier micrometers uit elkaar, gerangschikt in acht rijen en vijf kolommen. Zet het sSMLM-systeem aan en plaats filters voor smalle bandbreedte direct voor de camera.

Plaats het kalibratiemonster onder een microscoop en zet de microscooplamp aan om het monster te verlichten. Stel de belichtingstijd in op 200 milliseconden voor alle filters, maar verander deze op 2.000 milliseconden voor het 750 nanometer filter. Ga naar acquire en fast time lapse om het aantal frames per filter op 10 in te stellen.

Na kalibratie laad je het DNA-gelmonster op het microscooppodium met de dekselkant naar het objectief en open je de camerasoftware voor gegevensverzameling. Identificeer de juiste Z-positie met het automatische scherpsteltrackingsysteem en pas de scherpstelling aan totdat duidelijk stochastisch knipperen zichtbaar is. Zorg ervoor dat het objectief de afdekkingsrand niet raakt om bufferlekkage in de dompelolie en interferentie met tracking te voorkomen.

Haal ongeveer 10.000 tot 30.000 frames met het gewenste belichtingsvermogen en een belichtingstijd van 30 milliseconden. Na gegevensverzameling mag de software de gegevens standaard in nd2-formaat opslaan. Gooi de glazen glaasplaat weg in een goedgekeurde afvalbak die is bestemd voor gebroken glas of scherpe voorwerpen.

Gooi alle resterende buffers in de aangewezen container voor vochtig afval volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen. Open Fiji en gebruik de bioformats-plugin om de verkregen ruwe beeldstack van het DNA-monster te laden. Selecteer afbeelding gevolgd door stacks, Z projecteert, en kies minimale intensiteit als projectietype om de minimale projectie van de raw image stack te genereren.

Selecteer de beeldcalculator en trek de minimale projectie af van de raw-beeldstack. Bewaar de achtergrond afgetrokken dataset als een TIF-bestand voor spectrale analyse. Voer vervolgens lokalisatieidentificatie uit op de nulde orde ruwe beeldstack met behulp van de ThunderSTORM-plugin versie 1.3.

Stel de drempel in op 1,2 keer de standaarddeviatiegolf. F1, waarbij straal op drie wordt geplaatst, en sigma op 1,5 om het nulde orde beeld te reconstrueren en de coördinaten van het emissiegebeurtenis te onttrekken. Voor de bijgesneden raw-image stack van de nulde orde, selecteer plugin gevolgd door ThunderSTORM en voer analyse uit.

Gebruik Fiji en de open source software RainbowSTORM met een MATLAB-versie die nieuwer is dan 2020b om de kalibratiegegevens te verwerken en de relatie tussen horizontale en verticale verschuivingen en golflengten te verkrijgen. Voer lokalisatieidentificatie uit op de kalibratiebeelden van de vijf golflengten met behulp van de ThunderSTORM-plugin. Stel de drempel in op vijf keer de standaarddeviatie, golf.

F1, waarbij straal op drie wordt gepast, en sigma op 1,5 om nanogatlokalisaties op de nulde orde en overeenkomstige spectrale lokalisaties op de eerste orde te reconstrueren. Verkrijg een gemiddelde afbeelding van elke kalibratiedata en pas de drempel aan binnen een bereik van vijf tot tien keer de standaardafwijkingsgolf. F1 tot 80 lokalisaties worden verkregen voor elk kalibratiebeeld.

Voer de RainbowSTORM uit en klik op browsen onder spectrale kalibratie om de CSV-bestanden voor elke kalibratiegolflengte te laden. Klik vervolgens op calibratiebestand opslaan om het kalibratiebestand op te slaan. Gebruik het aangepaste Python-script versie 3.11.7 om de volledige spectrumdata te extraheren.

Stel vervolgens de juiste bestandspaden in in het Python-script voor de achtergrond afgetrokken afbeeldingstack in TIF-formaat ten opzichte van de vorige achtergrondaftrekstap. Stel het bestandspad in voor het localisatie-CSV-bestand dat wordt geproduceerd vanuit de lokalisatieanalysestap en het kalibratiebestand in MAT-formaat dat uit de kalibratiestap wordt gegenereerd. Stel vervolgens de horizontale verschuiving in op 925 tot 984 pixels voor de 532 nanometer data die met een 3D DWP wordt verkregen, overeenkomend met een spectraal venster van 525 tot 750 nanometer, om dekking te garanderen buiten het filterbereik van 590 tot 650 nanometer.

Stel de verticale verschuiving aan naar 23 pixels voor zowel de 488 nanometer als 532 nanometer data die met de 3D DWP zijn verkregen, gebaseerd op de spectrale kalibratiecurve verkregen met RainbowSTORM. Tot slot lineariseer je het niet-lineaire spectrum met behulp van een derde-orde polynomiële fitting voor latere vergelijking en classificatieanalyse. De spectrale kalibratie werd uitgevoerd, waardoor de overeenkomstige horizontale en verticale pixelverschuivingen tussen de nulde orde en de eerste-orde beelden konden worden gemeten.

Dit maakte het mogelijk een kalibratiecurve te mappen tussen de pixelpositie en de golflengte. De niet-lineaire en de geconverteerde lineaire emissiespectra onder 532 nanometer excitatie werden verkregen voor GC-alter, wat verwijst naar een type dubbelstrengs DNA-molecuul. De groene kromme gaf het gemiddelde spectrum weer

De niet-lineaire en geconverteerde lineaire emissiespectra van A10C10, een type enkelstrengs DNA-molecuul, werden verkregen onder 488 nanometer excitatie, waarbij de blauwe kromme het gemiddelde spectrum vertegenwoordigt. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om intrinsieke fluorescentiespectra van gesynthetiseerde enkel- en dubbelstrengs DNA-moleculen te meten met spectroscopische superresolutiebeeldvorming. Het nauwkeurig lokaliseren van de juiste Z-positie is cruciaal, omdat DNA-gelmonsters structurele informatie missen en zorgvuldige focus vereisen om de stochastische blinkingen te observeren.

Toekomstig werk kan zich uitbreiden tot het meten van intrinsieke fluorescentie van het RNA en eiwit, waarbij computationele modellen worden geïntegreerd voor sequentievoorspelling en labelvrije chromatinebeeldvorming.