In vitro Functionele analyse van regulerende T-cellen: Focus op proliferatie en differentiatie

Ons laboratorium bestudeerde differentiatie, metabolisme en interactie van T-celsubsets. Treg affect T-cel crosstalk, handhaaft de immuunhomeostase, waardoor Treg-onderzoek cruciaal is voor de behandeling van auto-immuun- en ontstekingsziekten. Traditionele in vitro Treg-suppressie-assays negeerden Treg-gemedieerde effecten en differentiatie van effector-T-cellen.

Dit aangepaste protocol evalueert zowel proliferatie als polarisatie tegelijkertijd. Om te beginnen bereid je naïeve T-cellen, regulatieve T- of Treg-verrijkte cellen en antigeen-presenterende celverrijkte niet-CD4-positieve cellen voor. Centrifugeer de naïeve CD4-positieve T-celsuspensie op 350G gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg om de celpellet te verkrijgen.

Verdun de celproliferatiekleurstof eFluor 450 in PBS om een concentratie van 20 micromolair bij kamertemperatuur te verkrijgen. Voeg 0,5 milliliter PBS per één keer 10 toe aan het vermogen van zeven cellen aan de buis. Houd de buis ongeveer 45 graden gekanteld en laat de cellen voorzichtig opnieuw ophangen door 50 keer op en neer te pipetten.

Voeg vervolgens snel een gelijk volume van de celproliferatie-kleurstofoplossing toe aan de celsuspensie om een uiteindelijke concentratie van 10 micromolair te verkrijgen. Houd de buis onder een hoek van 45 graden en pipette de cellen om ze grondig te mengen met de celproliferatiekleurstof. Wikkel de centrifugebuis onmiddellijk in aluminiumfolie om lichtblootstelling te voorkomen.

Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur terwijl je ze voorzichtig elke vijf minuten vortext om celaggregatie te voorkomen. Voeg vervolgens 10 milliliter voorgekoeld celkweekmedium toe aan de centrifugebuis en laat de cellen voorzichtig vortexen om de kleuring te beëindigen. Centrifugeer vervolgens de cellen en gooi het supernatant weg.

Om de cellen te wassen, voeg je vijf milliliter voorgekoeld celkweekmedium toe aan de celpellet. Herhaal de centrifugatie en suspendeer de pellet opnieuw in vijf milliliter kweekmedium. Na celtelling centrifugeren de cellen en opnieuw suspenderen in een passend volume kweekmedium om een celconcentratie van twee keer tien te bereiken met een kracht van zes cellen per milliliter.

Houd de buis op ijs. Bereken het aantal monsters dat nodig is voor de celkweek. Bereid een geschikte hoeveelheid celkweekmedium voor met 2,5 microgram per milliliter anti-muis CD3-antilichaam of de geschikte inductiecytokines.

Neem voorbereide naïeve T-cellen en Treg-verrijkte cellen en laat ze vortexen. Voeg 100 microliter CD45.2-positieve, CD4-positieve naïeve T-cellen en 100 microliter CD4.1-positieve APC-verrijkte niet-CD4-positieve cellen toe aan de 48-wellplaat. Breng 100 microliter CD45.1-positieve, CD4-positieve en CD25-positieve Treg-verrijkte cellen over in de experimentele putten en 100 microliter celkweekmedium naar de controleputten.

Vervolgens pipetteer je 100 microliter kweekmedium met anti-muis CD3-antilichaam en 100 microliter kweekmedium met de geschikte inductiecytokines in elke put. Voeg PBS toe aan de overgebleven lege putten om de luchtvochtigheid van de plaat te behouden en de randeffecten te verminderen. Incubeer de 48-put plaat in een 5% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen.

Pipette voorzichtig de gekweekte cellen om ze opnieuw te laten ophangen en breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de cellen en verwijder het supernatant. Voeg 500 microliter celkweekmedium met phorbol 12-myristaat 13-acetaat, ionomycine en GolgiPlug eiwittransportremmer toe aan elke buis.

Draai voorzichtig vortex om de cellen opnieuw te laten suspenderen en incubeer ze drie uur lang in een 5% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Voeg na centrifugering 50 microliter PBS toe met één test van zombiegele kleurstof en 1:100 verdund anti-muis CD16 of 32 antilichamen aan de pellet. Vortex de monsters en incubeer ze 15 minuten in het donker op kamertemperatuur om dode cellen te labelen en FC-receptoren te blokkeren.

Centrifugeer de cellen voordat je het supernatant weggooit. Voeg 50 microliter oppervlakte-antilichaamcocktail toe aan het monster, laat het vortexen en incubeer 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens één milliliter fluorescentie-geactiveerde celsortering of FACS-buffer toe aan elke centrifugebuis.

Na centrifugatie en verwijdering van supernatanten voeg je 300 microliter fixatie- en permeabilisatieoplossing toe aan elke centrifugebuis en laat je de monsters vortexen. Incubeer de monsters op vier graden Celsius in het donker gedurende 20 minuten. Transfert op milliliter permeabilisatie en wasbuffer naar elke centrifugebuis, gevolgd door centrifugatie en verwijdering van supernatanten.

Na het herhalen van de wash voeg je 50 microliter cytokine-antistofcocktail toe aan elk monster en laat je de monsters vortexen. Incubeer de monsters 40 minuten in het donker bij vier graden Celsius. Was elk monster met één milliliter permeabilisatie en wash buffer.

Centrifugeer de cellen en verwijder het supernatant. Sussief de celpellet opnieuw in 300 microliter FACS-buffer. Meet de proliferatie en differentiatie van responder T-cellen met behulp van flowcytometrie.

Gate de lymfocytenpopulatie onder het totale aantal cellen om celresten en onzuiverheden uit te sluiten. Selecteer de eencellige populatie onder de lymfocyten op basis van verstrooiingssignalen. Vervolgens identificeer je de levende celpopulatie onder de enkele cellen, gevolgd door de CD4-positieve T-celpopulatie onder de levende cellen.

Vervolgens gatet u de CD45.1 positieve regulatieve T-cel verrijkte populatie en de CD45.2 positieve effector T-celpopulatie onder de CD4 positieve T-cellen. Selecteer vervolgens de CD45.2 positieve CD4 positieve interferon gamma positieve T helper 1 cellen, CD45.2 positieve CD4 positieve interleukine-17A positieve T helper 17 cellen en niet-geprolifereerde CD45.2 positieve CD4 positieve T cellen onder de CD45.2 positieve T-cellen. Voer flowcytometriegegevens uit voor alle monsters.

Analyseer tenslotte de flowcytometriedata met FlowJo-software met dezelfde gatingstrategie als bij het verzamelen van flowcytometriegegevens. De frequentie van niet-geproliferateerde responder T-cellen werd significant verhoogd onder zowel T helper 1 als T helper 17 inductiecondities na co-kweek met regulerende T-cel verrijkte cellen. De differentiatie van CD45.2 positieve, CD4 positieve interferon gamma, positieve T helper 1 cellen werd significant onderdrukt na co-kweek met regulerende T-cel verrijkte cellen.

De frequentie van CD45.2-positieve, CD4-positieve interleukine-17A positieve T-helper 17-cellen nam toe wanneer responder-T-cellen werden gekweekt met met regulerende T-celverrijkte cellen. In vitro functionele analyse van Treg-cellen maakt het mogelijk om biodirectionele effecten tussen Treg- en effector-T-cellen op proliferatie en polarisatie te onderzoeken. De grootste uitdaging bij het uitvoeren van dit protocol is hoe de levensvatbaarheid van de cel behouden blijft, terwijl de zuiverheid van Treg-cellen en naïeve T-cellen wordt gewaarborgd.

Na dit proces kunnen ELISA en andere biomedische assays de productie van cytokines en metabole effectoren beoordelen, terwijl FACS-gesorteerde cellen downstream RNA-seq en proteomics-analyse mogelijk maken.