Name: Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie (ChIP) in postmortaal menselijk hersenweefsel voor epigenetisch onderzoek. Deze methode brengt histonmethylering in kaart en verdiept het inzicht in genexpressie bij normale en zieke hersenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

Procedure: 1 ste dag 1. Homogeniseren 50-500 mg van bevroren post-mortem grijze massa weefsel met Douncing Buffer. ! LET OP - Human weefsel moet met zorg worden behandeld onder strikte veiligheidsvoorwaarden. Het moet mogelijk worden behandeld BSL-2 of hoger veiligheidsnormen. <ol><li> Neem eerder ontleed, post-mortem brain van -80 ° C, ze dounce in 5X hersenvolume van Douncing Buffer, en plaats in 2,0 mL microcentrifugebuis. Matched monster en controle paren zijn gelijktijdig verwerkt. </li></ol> 2. Micrococcal Nuclease (MN) Spijsvertering <ol><li> Voeg 5U/mL van Micrococcal nuclease aan het monster en mix in de oplossing door en neer te pipetteren voordat u op ijs. * Cruciale stap - Het is belangrijk om deze stap te snel te doen, omdat MN heeft de mogelijkheid om op te treden bij zelfs 4 ° C. </li><li> Incubeer monsters gedurende 7 minuten bij 37 ° C. </li><li> Na de 7 minuten incubatie, voeg 0,5 M EDTA tot een concentratie van 10mm tot de MNase activiteit te stoppen. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> Leg monsters in een 15 ml Falcon buis. Voeg 10X het monster volume van 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 monstervolume van 0,2 M benzamidine en 1 / 1000 monstervolume van 0,1 M phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). De laatste twee verbindingen worden gebruikt als proteaseremmers. * Cruciale stap - Het is belangrijk om de monsters te houden op ijs gedurende al deze stappen. </li><li> Incubeer steekproef voor een uur, terwijl de vortexen het elke 10 minuten. </li><li> Aan het eind van het uur lange incubatietijd, voeg 1 / 2000 monstervolume van 3M DTT, nog een andere proteaseremmer. </li><li> Vortex monster nogmaals en centrifugeer bij 3175 RCF gedurende 10 minuten bij 4 ° C. * Optionele stap - Precleansing met Proteïne G Agarose. <ol><li> Neem supernatant en zet in de nieuwe 15 ml Falcon buis. </li><li> Voeg 500 ul van Proteïne G Agarose. </li><li> Draaien bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 4000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Verdeel supernatant zodat 500 pL worden gebruikt als input-controle (met alleen genomisch DNA), en de rest wordt verdeeld in twee buizen met 1600 pi van het monster per stuk - die bestemd zijn voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) monsters. </li><li> De Input controle is geplaatst bij -80 ° CO / N tot gebruik. </li><li> Om de chip monsters - toe te voegen 01:10 volume van de 10XFSB en 4μg van antilichaam, dan vortex de monsters en draai ze op 4 ° C gedurende de nacht. ! LET OP - Bedrag en verdunning van antilichamen kan verlangen optimalisatie. </li></ol> 2e dag ! LET OP! - 2 e dag Begin met het wassen van de Protein G Agarose die zal worden gebruikt om nucleosomale DNA te isoleren. Aangezien de agarose parels zijn erg gevoelig, is het noodzakelijk af te snijden van de hoofden van de tips, wanneer pipetteren elke oplossing die agarose kralen. 1. Indringende Proteïne G Agarose Beads naar DNA <ol><li> Voeg 1,6 mL 1XFSB tot 245 pi eiwit G-agarose (genoeg voor 4 buizen) in een 2 ml microcentrifugebuis (lus). </li><li> Scheid de oplossing in twee 2 ml tubes en vul elk tot 1,6 ml met 1X FSB. </li><li> Roteren met RT voor 30 seconden en centrifugeer bij 0,1 RCF gedurende 30 sec. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met behulp van een vacuüm. </li><li> Voeg 1,6 ml 1X FSB weer. Draai de monsters gedurende 30 seconden en centrifugeer op 0,1 RCF gedurende 30 sec. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof weer, en combineer beide buizen met 1,5 ml 1XFSB. </li><li> Voeg 15 uL gesoniceerd zalmsperma DNA (10mg/mL). ! LET OP - Deze stap moet in principe, te verminderen niet-specifieke binding van de immunoprecipitaat aan de kralen. Echter, dit ook kan leiden tot valse positieven voor een aantal van de (menselijke) DNA-sequenties. </li><li> Draaien bij RT gedurende 30 min, centrifugeer bij 0,1 RCF gedurende 30 sec. </li><li> Verwijder het supernatant. Voeg 200 ul van 1XFSB. </li><li> Voeg 90 ul van agarose parels in elke ChIP monster. Draaien bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 1 ml van 1XFSB in de resterende agarose parels om te dienen als een negatieve controle en op 4 draaien ° C gedurende 1 uur. </li><li> Na de uren lange incubatie, centrifuge de monsters en negatieve controle op 0,1 RCF gedurende 30 sec. Giet het supernatans af. </li></ol> 2. Wassen van de Beads ! LET OP! - Wassen buffers moeten worden bewaard bij 4 ° C tot gebruik, en moeten alleen worden gebruikt als zijn minder dan een maand oud. <ol><li> Voeg 1 ml van elk wassen oplossing voor de kralen en draaien voor 3 min bij RT. </li><li> Centrifugeer bij 0,1 RCF gedurende 30 sec. </li><li> Gooi supernatant met behulp van vacuüm. </li></ol> * Elke wasoplossing - Lage zout wasbuffer - Hoge zout wasbuffer </p&gt; - Lithium-oplossing - alleen draaien op RT gedurende 1 minuut! - TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Elutie * Kritische stap - het maken van verse elutiebuffer voor elk experiment op de dag het is om te worden gebruikt. <ol><li> Voeg 250 ul van vers bereide elutiebuffer aan elk monster. </li><li> Roteren gedurende 15 min bij RT, centrifugeer met 0,4 RCF gedurende 1 minuut. </li><li> Sla de bovenstaande vloeistof in een 2,0 ml microcentrifugebuis (Loop). </li><li> Voeg 250 ul van elutiebuffer aan elk monster en de vortex met de hand voor een paar seconden. Dan, vortex monsters gedurende 15 minuten op een mulitvortexer. </li><li> Centrifugeer bij 16 RCF rpm gedurende 4 minuten en op te slaan supernatant in dezelfde 2,0 ml tube (Loop). </li></ol> 4. Digest Protein <ol><li> Voeg 10 ul 0.5M EDTA, 25 pi 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml proteïnase K (1 / 200 sample) toe aan elk ChIP monster. </li><li> Aan elke ingang controle, toe te voegen lysis buffer voor proteinase K spijsvertering (1 / 10 van het monster buffer) en 10mg/ml Proteinase K (1 / 200 van het monster buffer). </li><li> Incubeer Input en Chip monsters in 52 ° C gedurende ten minste drie uur. </li></ol> 5. Fenol / chloroform extractie ! LET OP - Experiment waarbij fenol / chloroform moeten worden uitgevoerd onder de motorkap. Gebruik nitril handschoenen bij het hanteren van fenol / chloroform. <ol><li> Na de 3 uur incubatie, voegen we de 500 ul fenol-chloroform aan elk monster. </li><li> Vortex alle monsters gedurende enkele seconden, centrifugeer bij 13 RCF rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Op dit punt, zullen twee fasen aanwezig zijn en wij zijn geïnteresseerd in de inhoud van de bovenste fase. Haal de bovenste fase en zet het in een 2 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg een mengsel van 2μL van glycogeen en 50μL van 3M natriumacetaat toe aan elk monster, samen met 1.375 ml 100% ethanol. </li><li> Vortex alle monsters krachtig. Plaats ze in de -80 ° C gedurende de nacht. </li></ol> 3e dag <ol><li> Verwijder de monsters vorm -80 ° C en plaats ze op ijs voor ze te ontdooien. </li><li> Centrifugeer bij 15 RCF gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voorzichtig supernatans verwijderen zonder de pellet te verstoren op de bodem van de buis. </li><li> Voeg 1 ml koude 75% ethanol aan elk monster, keer dan ze 4-6 keer. </li><li> Centrifugeer bij 18 RCF gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant nog eens en laat de pellets aan de lucht drogen. </li><li> Los gedroogde pellets in 50 ul van 4mm Tris-HCl, pH8 en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

Het protocol hier beschreven is vooral handig voor onderzoekers geïnteresseerd zijn in histon-en / of DNA-methylatie handtekeningen van menselijke hersenen, omdat deze chromatine markeringen mogen, indien minder gevoelig is voor postmortale artefacten in vergelijking met andere types van wijzigingen, inclusief (histonen) acetylering en fosforylatie 1, 2. Het postmortem hersenen vatbaar is voor de studie van de mono-nucleosomale preparaten; het DNA blijft grotendeels aan de kern van histonen, althans in exemplaren met een represen...

Oplossingen: <ul><li> nChIP Douncing Buffer: 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2 de pH instellen op 7,5 </li><li> 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl pH instellen op 7,5 </li><li> Lage zout wasbuffer: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl </li><li> Hoog zoutgehalte wassen Buffer: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl </li><li> Lithiumchloride Buffer: 1% Igepal-CA 630, 1% deoxycholinezuur, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl </li><li> TE-buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA </li><li> Elutiebuffer: 0,1 M NaHCO 3, 1% SDS </li><li> Proteinase K digestie buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl breng de pH op 8,0 </li><li> 3 M natriumacetaat: 24,61 g watervrij natriumacetaat (MW = 82,03) in 100 ml gedestilleerd water geautoclaveerd. Breng de pH op 5,2 met behulp van geconcentreerd azijnzuur. </li></ul>

een chromatine assay voor menselijk hersenweefsel

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronische neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie, bipolaire aandoeningen en autisme men denkt dat het gevolg zijn van een combinatie van genetische en omgevingsfactoren die zouden kunnen resulteren in epigenetische veranderingen in genexpressie en andere moleculaire pathologie. Traditioneel waren echter expressie studies in postmortem hersenen beperkt tot de kwantificering van mRNA of eiwit. De beperkingen aangetroffen in postmortem hersenonderzoek zoals variabiliteit in de tijd autolyse en weefsel integriteiten zijn waarschijnlijk ook alle studies die van hogere orde chromatine structuren impact. Echter, de nucleosomale organisatie van genomisch DNA met inbegrip van DNA: kern histon-binding - lijkt grotendeels bewaard in representatieve monsters als bedoeld door verschillende hersenen banken. Daarom is het mogelijk de studie van de methylatie patroon en andere covalente modificaties van de kern histon-eiwitten op bepaalde genomische loci in postmortem hersenen. Hier presenteren we een vereenvoudigde inheemse chromatine immunoprecipitatie (NChIP) protocol voor bevroren (nooit-vast) menselijke hersenen exemplaren. Te beginnen met micrococcal nuclease vertering van hersenhomogenaten, NChIP gevolgd door qPCR kan worden afgerond binnen de drie dagen. De methodologie hier gepresenteerde moet nuttig zijn om epigenetische mechanismen van genexpressie te helderen in normale en zieke menselijke brein.

Tot voor kort werden expressie studies over menselijke hersenen beperkt tot de kwantificering van RNA of eiwit. Met de chromatine immunoprecipitatie technieken beschreven in dit document, zal het mogelijk zijn om histon-methylatie en andere epigenetische regulatoren van genexpressie in postmortem hersenen kaart.

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Chronische neuropsychiatrische aandoeningen zoals schizofrenie, bipolaire stoornis en autisme worden vermoedelijk veroorzaakt door een combinatie van genetische en omgevings...

Hallo, ik ben Amish Matan van het laboratorium van Dr. Sha Mc Barian van de afdeling psychiatrie van de UMass Medical School. Vandaag laat ik u een procedure zien voor chromatine-immunoprecipitatie in postmortaal menselijk hersenweefsel. Hoewel de volgende procedure niet erg ingewikkeld is.Het meest opwindende is dat expressiestudies in het menselijk brein tot voor kort beperkt waren tot eenvoudige kwantificatie van mRNA en proteïnen. Deze specifieke techniek zal ons een beter inzicht geven in de mechanistische basis van genexpressie in zowel het normale als het zieke menselijke brein. Laten we beginnen met het immunoprecipiteren van chromatine.We zijn gestart met eerder gedisseceerd bevroren postmortem menselijk hersenweefsel. Het is belangrijk om een veiligheidsbril te gebruiken en te werken in een aangewezen gebied voor het verwerken van menselijk weefsel. Bij het verwerken van deze monsters wordt het hersenweefsel ondergedompeld in vijf keer het hersenvolume aan down sink buffer.Zodra al het weefsel homogeen lijkt te zijn geworden in de oplossing, kan het naar een buisje van twee ml worden overgebracht. Voeg na homogenisatie van het weefsel vijf eenheden per ml micrococaal nucl

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking voor de studie van de epigenetische markeringen in chromatine, omdat de meeste assays gebrek aan enkele cel resolutie. Neuronen meestal vermengd met glia en andere niet-neuronale cellen. Wij bieden een protocol te halen en neuronale kernen verzamelen van menselijke hersenen.

Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Dit protocol beschrijft hoe chromatine immunoprecipitatie (ChIP) wordt gebruikt om de dynamische wijzigingen studie naar de chromatine sjabloon die transcriptie veroorzaakt door een signaal transductie route te reguleren.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) om Assay Dynamic histon-eiwitten in Actieve genexpressie in menselijke cellen

De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een ​​niet-splitsbare site.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

Source: Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.  (2018).This video demonstrates the isolation of protein-DNA complexes from neurosphere cells derived from a mouse brain tumor using native chromatin immunoprecipitation. It details the steps for chromatin preparation, immunoprecipitation, washing, and protein digestion to release DNA for downstream analysis.

Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

Hier beschrijven we een gevoelige immunochemische methode voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten op basis van het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking.

Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Epigenetische mechanismen worden regelmatig gewijzigd in glioma. Chromatine immunoprecipitation kan worden gebruikt om de gevolgen van genetische wijzigingen in glioma die voortvloeien uit wijzigingen in histone modificaties tot regeling van de chromatine structuur en gene transcriptie. Dit protocol beschrijft een native chromatine immunoprecipitation op lymfkliertest hersenen tumor neurospheres.

Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Leer chromatine immunoprecipitatie (ChIP) in postmortaal menselijk hersenweefsel voor epigenetisch onderzoek. Deze methode brengt histonmethylering in kaart en verdiept het inzicht in genexpressie bij normale en zieke hersenen.

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Meer video's verkennen