Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Hallo, ik ben Amish Matan van het laboratorium van Dr. Sha Mc Barian van de afdeling psychiatrie van de UMass Medical School. Vandaag laat ik u een procedure zien voor chromatine-immunoprecipitatie in postmortaal menselijk hersenweefsel. Hoewel de volgende procedure niet erg ingewikkeld is.

Het meest opwindende is dat expressiestudies in het menselijk brein tot voor kort beperkt waren tot eenvoudige kwantificatie van mRNA en proteïnen. Deze specifieke techniek zal ons een beter inzicht geven in de mechanistische basis van genexpressie in zowel het normale als het zieke menselijke brein. Laten we beginnen met het immunoprecipiteren van chromatine.

We zijn gestart met eerder gedisseceerd bevroren postmortem menselijk hersenweefsel. Het is belangrijk om een veiligheidsbril te gebruiken en te werken in een aangewezen gebied voor het verwerken van menselijk weefsel. Bij het verwerken van deze monsters wordt het hersenweefsel ondergedompeld in vijf keer het hersenvolume aan down sink buffer.

Zodra al het weefsel homogeen lijkt te zijn geworden in de oplossing, kan het naar een buisje van twee ml worden overgebracht. Voeg na homogenisatie van het weefsel vijf eenheden per ml micrococaal nuclease toe aan het monster en meng de oplossing door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen. Plaats het monster vervolgens op ijs.

Het is belangrijk om deze stap snel uit te voeren, aangezien micrococale nuclease ook bij vier graden Celsius actief kan zijn. Zodra alle monsters zijn behandeld met micrococale nuclease, plaatsen we ze direct in het waterbad van 37 graden Celsius en incuberen we de monsters gedurende zeven minuten.

Na de incubatie van zeven minuten voegen we 0,5 molair EDTA toe tot een concentratie van 10 millimol om de activiteit van micrococcal nuclease te stoppen. We zijn nu klaar om over te gaan naar de isolatiestap. Nadat we onze monsters, die ons nucleosomale DNA bevatten, hebben behandeld met micrococcal nuclease, begint de isolatie.

Nava neemt een Falcon-buis van 15 ml waarin we 4,5 ml 0,2 millimolair EDTA, 2,5 µL 0,2 molair benzonase en 4,5 µL 0,1 molair PMSF toevoegen. We dragen ons monster over. Vervolgens incuberen we het monster gedurende één uur op ijs, waarbij we het elke 10 minuten vortexen.

Aan het einde van de incubatie van een uur voegen we 2,5 µL van drie molar DTT toe. Het monster wordt nogmaals gevortexd en vervolgens gecentrifugeerd in een swing-bucket-rotor bij 3.175 RCF gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Na centrifugatie wordt het supernatant verdeeld, waarbij 500 µL wordt gebruikt als onze inputcontrole, die enkel genomisch DNA bevat, en de rest wordt verdeeld over twee buisjes met elk 1.600 µL monster, wat our chromatin immunoprecipitatie-monsters zullen zijn.

De inputcontrole wordt gedurende de nacht bij -80 °C bewaard tot verder gebruik. Vervolgens voegen we 160 µL 10 XFSB toe, wat overeenkomt met een tiende van het volume van ons monster. Hiermee voegen we vier µg van het antilichaam toe.

Vortex nu de monsters en roteer ze vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Na de incubatie gedurende de nacht wassen we de proteïne-giros die gebruikt zullen worden om ons nucleosomale DNA te isoleren. Aangezien deze agro-beads zeer gevoelig zijn, is het noodzakelijk om de koppen van de pipetpunten af te knippen bij het werken ermee.

Dit is om ervoor te zorgen dat de beads meer ruimte hebben tijdens het pipetteren. Voeg nu 1,6 mL XFS-beads toe aan 245 µL proteïne-jaguars in een 2 mL microcentrifugebuisje. Dit moet voldoende zijn voor vier buisjes monster.

Verdeel vervolgens de kraalensuspensie over twee buisjes van twee ml en vul elk buisje aan tot 1,6 ml met één XFSB. Roteer de buisjes 30 seconden lang op kamertemperatuur op een rotator en centrifugeer ze daarna 30 seconden bij 0,1 RCF. Verwijder na centrifugatie de ATE met een vacuüm.

Voeg 1,6 µL van 1X XFSB toe. Roteer de monsters opnieuw gedurende 30 seconden op een rotator en centrifugeer ze vervolgens opnieuw bij 0,1 RCF FS gedurende 30 seconden. Na centrifugatie verwijderen we opnieuw het supernatant en combineren we beide buisjes met 1,5 µL van 1X XFSB.

Voeg daarnaast 15 µL sperma-DNA toe. Laat het mengsel nu 30 minuten roteren bij kamertemperatuur en centrifugeer het vervolgens 30 seconden bij 0,1 RCF. Verwijder de supernatant en voeg 200 µL 1x FSB toe.

Voeg nu 90 µL agro speeds toe aan elk chromatineprecipitatie-monster en roteer deze vervolgens gedurende één uur bij vier graden. Voor een negatieve controle voegt u 1 mL 1X FSB toe aan de resterende acro speeds en roteert u deze samen met het chromatine-immunoprecipitatie-monster gedurende één uur bij vier graden Celsius. Tijdens de incubatie van één uur kunnen we de gelegenheid benutten om verse resolutiebuffer te maken.

Dit zal later in het experiment worden gebruikt na de incubatie van een uur. Centrifugeer de monsters en de negatieve controle op 0,1 CFS gedurende 30 seconden en verwijder het supernatant. Vervolgens wassen we de beads met vier verschillende typen wasoplossingen: een wasbuffer met een laag zoutgehalte, een wasbuffer met een hoog zoutgehalte, een lithiumchloride-oplossing en tot slot TE-buffer bij pH 8.

Voor elke buffer, behalve de lithiumchloride-oplossing, roteren we de monsters gedurende drie minuten bij kamertemperatuur en centrifugeren we ze vervolgens 30 seconden bij 0.1 R Cs. Voor de lithiumchloride-wassing roteren we de monsters slechts één minuut bij kamertemperatuur. Verwijder na elke wasbeurt het supernatant met behulp van een vacuüm.

Nu zijn we klaar om onze monsters te elueren. Om te beginnen met de elutiestap, voegen we 250 µL vers bereide elutiebuffer toe aan elk monster. Roteer de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer ze vervolgens op 0,4 RCF gedurende één minuut.

Bewaar nu het supernatant in een oranje buisje van 2 ml. Voeg vervolgens 250 µL evolutiebuffer toe aan elk monster. Vortex deze vervolgens opnieuw handmatig gedurende enkele seconden.

Vortex vervolgens de monsters gedurende 15 minuten; centrifugeer de buisjes na deze stap van 15 minuten vortexen. Stel de centrifuge in op 16 RCF voor vier minuten en bewaar het supernatant in hetzelfde buisje van 2 mL. Om het eiwit in onze monsters te verteren, voegt u eerst 10 µL 0,5 M DTA, 25 µL 0,8 M Tris-HCl bij een pH van 6,5 en 2,5 µL 10 mg/mL proteinase K toe aan elk chromatin immunoprecipitation-monster.

Voeg bij elke inputcontrole 15 µL lysisbuffer en 2,5 µL Proteinase K (10 mg/mL) toe. Incubeer zowel de input- als de chromatine-immunoprecipitatie-monsters gedurende ten minste drie uur bij 52 °C. Nu de incubatie van drie uur is voltooid, kunnen we overgaan tot de fenol-chloroformextractie.

Na de incubatie van drie uur voegen we 500 µL fenylchloroform toe aan elk monster. Dit gebeurt in de zuurkast, aangezien fenylchloroform een organische stof is die zowel schadelijk is bij contact met de huid als bij inademing. Vervolgens vortexen we alle monsters enkele seconden en centrifugeren we deze gedurende vijf minuten bij 13 RCF.

Er zouden twee fasen aanwezig moeten zijn in de buisjes. Omdat we geïnteresseerd zijn in de inhoud van de bovenste fase, halen we de bovenste fase eruit en brengen deze over in een microcentrifugebuisje van twee ml. Vervolgens wordt aan elk monster een mengsel van 2 µL glycogeen en 50 µL 3 M natriumacetaat toegevoegd, samen met 1,375 ml 100% ethanol.

Alle monsters worden krachtig gevortext en een nacht bij -80 °C bewaard. Na de incubatie gedurende de nacht worden de monsters op ijs geplaatst om te ontdooien. Ze worden vervolgens gecentrifugeerd bij 15 RCF gedurende 10 minuten bij 4 °C.

Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatant zonder het pellet onderin de buis te verstoren. Voeg vervolgens 1 mL koude, 75% ethanol toe aan elk monster en keer deze allen vier tot zes keer om. De buizen worden daarna opnieuw gecentrifugeerd bij 18 RCF gedurende vijf minuten bij 4 °C.

Het supernatant wordt opnieuw verwijderd en de pellets worden aan de lucht gedroogd. Zodra de pellets droog zijn, worden ze opgelost in 50 µL vier millimolaire sporen HCl met een pH van acht, en op minus 80 °C bewaard tot verder gebruik. Hiermee heb ik u laten zien hoe u chromatinimmunoprecipitaties uitvoert op bevroren postmortem menselijk hersenweefsel.

En onthoud dat het bij het uitvoeren van deze procedure belangrijk is om alle nodige voorzorgsmaatregelen te nemen bij het werken met menselijk hersenweefsel; chromatinimmunoprecipitatie-assays kunnen worden gebruikt om een extra laag van inzicht te verkrijgen in de genexpressie binnen zowel het normale als het zieke menselijke brein. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.