Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

De preparatie van dendritische cellen uit beenmerg biedt een uitstekende bron van antigeenpresenterende cellen die gebruikt kunnen worden voor in vitro of in vivo experimenten bij intravitale beeldvorming van het immuunsysteem. De introductie van antigeenpresenterende cellen maakt het mogelijk om antigeenspecifieke cel-celinteracties te bestuderen in de context van de levende lymfeknoop. Hier demonstreren wij de steriele isolatie van beenmerg en kweektechnieken voor de productie van mature dendritische cellen.

Verder volgen we de ontwikkeling van dendritische cellen van dag één tot dag 11. Deze ontwikkeling wordt weergegeven met stilstaande beelden en in incubatovideo's gemaakt met de Incucyte-site van Scent Technologies. Tot slot tonen we uit beenmerg afgeleide dendritische cellen die cove-antigeen presenteren aan OT-2 T-cellen in de drainerende lymfeknoop.

Hoi, ik ben Melanie Matthew uit het laboratorium van Micah Halen aan de nabijgelegen University of California. Heeft u zich wel eens afgevraagd wat er binnenin gebeurt tijdens de prober terwijl uw cellen groeien? Vandaag?

Als onderdeel van ons protocol laten we u zien hoe u enkele instrumenten ter plaatse gebruikt. De inky-site stelt u in staat om de groei van celculturen in uw incubator te volgen. In dit protocol laten we u zien hoe u beenmerg-afgeleide granulocyten uit een muis isoleert en voorbereidt.

Het eerste wat ik u zal laten zien, is hoe u dijbeenderen verwijdert en het beenmerg isoleert. Pin eerst het dier vast. Maak het dier vervolgens nat met 70% ethanol. Maak uw eerste incisie langs de middellijn van het dier.

Snijd vervolgens aan de binnenzijde van het poot, zoals ik hier laat zien. Om het spierweefsel boven het dijbeen bloot te leggen, moet u in staat zijn de spier opzij te schuiven en het grote dijbeen vast te pakken met uw dissectiepen. Terwijl u het bot met de dissectiepen vasthoudt, beweegt u naar beneden langs het bot en maakt u de eerste snede net onder het gewricht.

Beweeg de schaar vervolgens langs de lengte van het dijbeen en knip zo dicht mogelijk bij het lichaam. Dit kan leiden tot een kleine hoeveelheid bloed, vooral als u de arteria femoralis doorsnijdt. Bij het verwijderen van het dijbeen is het uiterst belangrijk dat het bot intact blijft.

Zoals u hier kunt zien, zijn de uiteinden van het bot niet doorgesneden of beschadigd. Zodra het femur is verwijderd, knipt u eventueel extra weefsel weg en plaatst u het femur in een klein schaaltje met ons PMI-medium. Let er bij het verwijderen van extra weefsel op dat het femurbot niet uitdroogt.

Op dit punt moeten de dijbeenen worden overgebracht naar een schaal met 70% ethanol en vijf tot 10 minuten op ijs worden geplaatst. Voor de doeleinden van deze video gaan we verder op de labtafel. Echter, in deze fase van het experiment moet alles worden overgebracht naar een weefselkweekkast.

Zodra de botten in ethanol zijn geweekt, kunnen ze worden overgebracht naar een grotere schaal met steriel medium voor het verwijderen van het beenmerg. Nu kunnen we het beenmerg verwijderen en resuspenderen. Vul een insulinespuit met steriel medium en zet deze opzij voor later gebruik.

Pak het bot vast met uw steriele pincet. Houd het boven een klein plaatje voor afvalstukken en snijd de epifyse of de uiteinden van het bot aan beide zijden af. Plaats uw insulinespuit in één zijde van het bot en spoel het merg uit het bot in 15 ml medium.

Spoel het bot nog één of twee keer uit tot al het merg is weggespoeld. Zodra het merg uit het bot is gespoeld, zal het bijna volledig wit zijn. Plaats het schone bot in de afvalbak en herhaal het proces voor het andere dijbeen.

Zodra dit is voltooid, worden eventuele mergfragmenten die niet door het wasproces zijn afgebroken voorzichtig kapotgemaakt om een enkelcellige suspensie te creëren. Dit vereist vijf tot 10 minuten pipetteren. Breng de enkelcellige suspensie over in een conische koker van 50 ml en was de plaat ten minste drie keer met 10 ml medium.

Centrifuge de cellen telkens kort, verwijder het medium en resuspendeer de cellen door uw vingers stevig en krachtig tegen de bodem van de buis te bewegen. Om de rode bloedcellen of RBC's te verwijderen, voeren we een waterlyse uit. Een andere methode voor het verwijderen van rode bloedcellen is een ammoniumchloridelyse.

Beide methoden zijn beschreven in eerdere JoVE-videoartikelen. Isolatie van CD4-positieve T-cellen uit lymfeklieren van muizen met gebruik van de Miltenyi Biotec purificatie (JoVE editie 9) en de bereiding van T-celgroeifactor uit ratencyten (JoVE editie 10).

Na het verwijderen van uw RBC's bent u nu klaar om uzelf te kweken. Voordat ik u meeneem door de dendritische celkweek, wil ik u graag познакомиen met de incus-site. De incus-site maakt het mogelijk om de groei van de voorspelde celkweek in de incubator te volgen, zodat we kunnen observeren hoe ze zich gedragen of misdragen.

Zodra een kweek is opgezet, plaatst u deze in een dienblad van de juiste afmeting en schuift u de Incucyte-site dicht. Vervolgens stelt u op uw computer eenvoudig het tijdsinterval in, kiest u de putjes waarvan u beelden wilt maken en laat u de Incucyte-site de gegevens voor u verzamelen. De video's in dit protocol laten u de in vitro veranderingen in de morfologie van dendritische cellen zien.

Deze video's zijn rechtstreeks geëxporteerd vanuit het Incucyte-siteprogramma. Terwijl de dendritische cellen zich ontwikkelen van dag 1 tot dag 11, is een werkelijke morfologische verandering zichtbaar doordat ze groter worden en het fenotype van dendritische cellen aannemen. Na lysis en verwijdering van erytrocyten worden de cellen gewassen in primair medium voor dendritische cellen en geplaatst in een dichtheid van 5 miljoen per ml.

Deze cellen moeten aanvankelijk worden gekweekt in primair dendritisch celcultuurmedium, en later kweken we ze in secundair DC-medium, dat is aangevuld met 40 ng/ml IL-4 en 100 ng/ml TNF-α. Deze cytokines ondersteunen de ontwikkeling van volwassen dendritische cellen die lijken op monocyten-afgeleide dendritische cellen. Ik zal u nu laten zien hoe de culturen eruitzien tijdens de ontwikkeling en hoe u deze in de loop van de tijd onderhoudt.

Zodra u de cellen heeft uitgeplaat, kunt u de dendritische cellen 72 uur lang kweken voordat u de eerste mediumverversing uitvoert. Hier ziet u hoe een typische cultuur eruitziet direct nadat u de cellen op dag één heeft uitgeplaat. En hier is een beeld van de cellen.

Op dag drie is te zien dat de cellen zijn begonnen aan te hechten aan de plaat, maar dat ze nog niet het klassieke dendritische cel-fenotype hebben aangenomen. Verwijder op dag vier het medium en voeg 10 ml vers primair DC-medium toe na aspiratie van het medium. Op dag vier zullen we de lymfocyten en alle andere niet-adherente cellen verwijderen.

Nu kunt u de cellen voor nog eens drie dagen terugplaatsen in de incubator, zeven dagen na de initiële uitplating. Zo ziet een typische cultuur eruit. U kunt nu zien dat het tijd is om de cellen te splitsen en opnieuw uit te platen.

Op dag zeven worden de dendritische cellen van de plaat verwijderd door het medium af te zuigen, vervolgens 300 millimolair steriel EDTA toe te voegen en dit vijf minuten te incuberen. Daarna wordt de plaat herhaaldelijk gespoeld door deze onder een hoek van 45 graden te houden en de EDTA-oplossing tegen de achterkant van de plaat te pipetteren. Dit wordt gedurende enkele minuten gedaan om ervoor te zorgen dat alle adhesieve dendritische cellen worden verwijderd.

Cellen worden verzameld in een conische buis van 50 ml en twee keer gewassen met secundair DC-medium. De cellen worden vervolgens geresuspendeerd en uitgeplaat met 5 miljoen cellen per plaat. Vers uitgeplaatte dendritische cellen van dag zeven zinken snel naar de bodem van de plaat, hechten zich aan en beginnen zich uit te spreiden.

Zoals u kunt zien in de video van de Zichy-site, is deze opname gemaakt in de incubator over een periode van twee dagen om u de ontwikkeling van dendritische cellen te tonen, vanaf het initiële heruitplaten op dag zeven tot begin dag negen. Morfologisch kunnen dendritische cellen worden geactiveerd via een antigeenpuls door hier 2 µg LPS toe te voegen, samen met 100 µg ova voor gebruik met T-cellen die gezuiverd zijn uit OT-2 muizen, welke ova-specifieke CD4-positieve T-cellen hebben. Als u een ander antigeen gebruikt, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat u een optimale antigeenconcentratie gebruikt om uw DC's te pulseren; hier worden ova en LPS toegevoegd aan primair medium, zodanig dat de uiteindelijke concentratie LPS 2 µg/ml in 20 ml zal zijn en ova 100 µg/ml in 20 ml.

Hier is een foto van hoe een typische kweek van dendritische cellen op dag 10 eruitziet. In deze foto is te zien dat de morfologie zeer kenmerkend is voor een antigeenpresenterende cel. U dient altijd het percentage CD 11 C-positieve dendritische cellen via FACS te controleren.

Dit is om ervoor te zorgen dat u een relatief zuivere cultuur van dendritische cellen heeft voor gebruik in uw experimenten. Hier gebruiken we de IncuCyte-site van SEN Instruments om de activatie te monitoren van dendritische cellen die op dag 10 met LPS zijn behandeld en met antigenen zijn gepulst. Deze video beslaat een periode van 24 uur direct na de toevoeging van LPS en het peptide; hierin worden de dendritische cellen actiever en treden er enkele duidelijke morfologische veranderingen op.

Zodra uw dendritische cellen zijn geactiveerd tijdens de antigeenpuls, kunt u ze opnieuw verzamelen door incubatie met 300 millimolair EDTA en het wassen van de plaat. Centrifugeer nu uw cellen, was ze tweemaal met 50 ml RPMI-medium om eventueel overgebleven antigeen te verwijderen en label ze met de geschikte celtracker-kleurstof. In dit experiment zal ik de cellen in de inguïnale lymfeknoop afbeelden.

We zullen twee tot 5 miljoen dendritische cellen dermaal injecteren in de flankregio van de hier getoonde muis. We laten vervolgens 24 uur verstrijken zodat de dendritische cellen naar de trainingslymfeknoop kunnen migreren. In deze video zijn de dendritische cellen gelabeld met CMF two hc, een blauwe celtracker-kleurstof.

U kunt de dendritische cellen zien die interactie hebben met gelabelde T-cellen die antigeenspecifiek zijn voor voline. Deze T-cellen zijn gelabeld met ccf SE. U kunt ook C-M-T-M-R of een van de andere cell tracker-kleurstoffen gebruiken als moleculaire probes. Dit is het vroege activatiestadium van T-cellen die interactie hebben met dc's.

Omdat ze antigeenspecifiek zijn, is te zien dat de T-cellen hechten aan de uitlopers van de blauw gelabelde dc's. Hiermee is ons protocol voltooid waarin de preparatie en het gebruik van dendritische cellen uit mouse-beenmerg in een two-photon imaging-experiment werden gedemonstreerd. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw eigen experimenten.