Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

De bereiding van dendritische cellen uit beenmerg biedt een uitstekende bron van antigeen-presenterende cellen die kunnen worden gebruikt voor in vitro of in vivo experimenten in twee-knops beeldvorming van het immuunsysteem. De introductie van antigeen-presenterende cellen maakt de studie mogelijk van antigeen-specifieke cel-cel-interacties in de context van de levende lymfeknoop. Hier demonstreren we de steriele isolatie van beenmerg en kweektechnieken voor de productie van volwassen dendritische cellen.

Bovendien volgen we de ontwikkeling van dendritische cellen van dag één tot dag 11. Deze ontwikkeling wordt weergegeven met statische beelden en in broedkastvideo's gemaakt met geurtechnologieën incus-site. Ten slotte laten we zien dat dendritische cellen afkomstig van beenmerg het cove-antigeen presenteren aan OT twee T-cellen in de spiegelende lymfeknoop.

Hallo, ik ben Melanie Matthew in het laboratorium van Micah Halen aan de Universiteit van Californië in de buurt. Heb je je ooit afgevraagd wat er binnen gebeurt tijdens prober terwijl je cellen groeien? Vandaag?

Als onderdeel van ons protocol laten we je zien hoe je S sommige instrumenten in site kunt gebruiken. De inky site stelt je in staat om celkweekgroei in je broedkast bij te houden. In dit protocol laten we je zien hoe je beenmerg-afgeleide en groep-cellen van muizen kunt isoleren en voorbereiden.

Dus het eerste wat ik je ga laten zien hoe te doen is femurbeenderen verwijderen en het beenmerg isoleren. Speld eerst het dier vast. Vervolgens bevochtig het dier met 70% ethanol. Maak je eerste insnijding langs de middenlijn van het dier.

Snijd vervolgens in de binnenkant van het been zoals ik je hier laat zien. Om het spierweefsel boven het femur bloot te leggen, moet je in staat zijn om de spier opzij te trekken en het grote femurbot met je dissectiepincetten vast te pakken. Terwijl je het bot vasthoudt met je dissectiepincetten, beweeg je naar beneden over het bot en maak je je eerste snede net onder de gewrichtsband.

Werk vervolgens met je schaar langs de lengte van het femur en maak het zo dicht mogelijk bij het lichaam. Dit kan resulteren in een beetje bloed, vooral als je de femurslagader doorknipt. Wanneer je het femur verwijdert, is het uiterst belangrijk dat het bot intact blijft.

Zoals je hier kunt zien, zijn de uiteinden van het bot niet doorgesneden of verstoord. Nadat het femur is verwijderd, knipt u eventueel overmatig weefsel af en plaatst u het femur in een kleine schaal met onze PMI-media. Zorg er bij het verwijderen van extra weefsel voor dat het femurbot niet uitdroogt.

Op dit punt moeten de femurbeenderen worden overgebracht in een schaal met 70% ethanol en gedurende vijf tot tien minuten op ijs worden geplaatst. Voor het doel van deze video zullen we verder gaan op de laboratoriumtafel. Bij deze fase van het experiment moet echter alles worden overgebracht naar een weefselkweekkap.

Zodra de botten in ethanol zijn gedrenkt, kun je ze verplaatsen naar een grotere schaal met steriel media voor de verwijdering van beenmerg. Nu zijn we klaar om het beenmerg te verwijderen en op te schorsen. Vul een insulinesyringe met steriel media en plaats deze opzij voor later gebruik.

Pak het bot met je steriele pincetten. Houd het boven een kleine plaat voor weggegooide stukken en snijd de epifyse of de uiteinden van het bot aan elke kant af. Plaats uw insulinesyringe in één kant van het bot en spoel het beenmerg uit het bot in 15 milligram media.

Spoel het bot een of twee keer meer uit totdat al het beenmerg is weggespoeld. Zodra het beenmerg uit het bot is gespoeld, zal het bijna volledig wit zijn. Plaats het schone bot in de afvalbak en herhaal het proces voor het andere femur.

Zodra dit is voltooid, verstoren u voorzichtig eventuele beenmergstukken die niet zijn gebroken door het wasproces om een enkele celsuspensie te creëren. Dit duurt vijf tot tien minuten pipetteren. Plaats een enkele celsuspensie in een 50-milli conische buis, spoel de plaat minimaal drie keer met 10 milligram media.

Elke keer draai je de cellen naar beneden, verwijder je het media en schorste je de cellen op door je vingers stevig en krachtig tegen de bodem van de buis te borstelen. Om de rode bloedcellen of RBC's te verwijderen, voeren we een waterlyse uit. Een andere methode voor het verwijderen van rode bloedcellen is een ammoniumchloridelyse.

Beide methoden zijn beschreven in eerdere JoVE-video-artikelen. Isolatie van CD vier positieve T-cellen uit muislymfeklieren met behulp van de Milan max-zuivering JoVE-uitgave negen en de bereiding van T-celgroeifactor uit ratcyten JoVE-uitgave 10.

Na verwijdering van uw RBC's bent u nu klaar om uzelf te kweken. Dus voordat ik u door dendri-celcultuur neem, wil ik u kennis laten maken met de incus-site. De incus-site zal het mogelijk maken om de groei van de celcultuur binnen de broedkast te trekken, zodat we onszelf kunnen bekijken hoe ze zich gedragen of misdragen.

Zodra een kweek is opgezet, plaatst u deze in de juiste maatbak en schuift u de incus-site dicht. Op uw computer stelt u eenvoudig het tijdsinterval in en kiest u vervolgens de putjes die u wilt afbeelden en laat de inky-site gegevens voor u verzamelen. De films zullen u in dit protocol demonstreren veranderingen in dendritische celmorfologie in vitro.

Deze video's zijn rechtstreeks geëxporteerd uit het Incus-site-programma. Terwijl de dendritische cellen zich ontwikkelen van dag één tot dag 11, kunt u een echte morfologische verandering zien terwijl ze groter worden en de dendritische celfenotype aannemen. Na het lyseren en verwijderen van RBC's worden de cellen gewassen in primaire dendritische celmedia en geplaatst op 5 miljoen per mil.

Deze cellen moeten aanvankelijk worden gekweekt in primaire dendritische celkweekmedia, en later kweken we ze in secundair DC-media, dat is aangevuld met 40 nano