Name: Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC s Matrigel op Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Leer het passeren en onderhouden van menselijke embryonale stamcellen op Matrigel zonder voedercellen. Deze methode bevestigt pluripotentie via immunofluorescentiemicroscopie voor betrouwbaar stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.

Splitsen van hESC &#39;s van Matrigel naar Matrigel Meestal een confluente 6-well plaat van hESC &#39;s op de Matrigel kunnen worden gesplitst 1u03-01u05 naar een andere Matrigel plaat, met de putten worden samenvloeiing weer 4-5 dagen na het splitsen. <ol><li> CM en Matrigel platen zijn bereid zoals hierboven beschreven voor de splitsing. </li><li> Op de dag van splitsing, wast elk goed voor het splitsen met 1 x PBS, pH 7,4, voeg 1 ml 1mg/ml Dispase (verdunnen 5mg/ml voorraad oplossing met DMEM/F12 media) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten. </li><li> Was elke well drie keer met 1 x PBS, pH 7,4, 1 ml van ES media toevoegen zonder bFGF, gebruik dan een cel schraper om kolonies te schrapen uit de bodem van de put, het verzamelen van de geschorste hESC &#39;s in een 50 ml falcon buis, en de pellet door centrifugeren bij 200g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Om opnieuw het bord van de hESC &#39;s op Matrigel borden, Was eerst de Matrigel borden met DMEM/F12 en voeg 2,5 ml van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF per putje. Resuspendeer de hESC pellet in een geschikt volume van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF, pipet de celsuspensie op en neer drie keer. (OPMERKING: Wanneer hESC &#39;s voor het splitsen komen uit Matrigel platen, de klonten zijn zeer gemakkelijk te breken, daarom drie rondes van het pipetteren is genoeg en meer pipetteren kan over-verstoren van de kolonies en maken enkele cellen.) Aliquot 0,5 ml van hESC klonten schorsing per goed van de 6-well Matrigel plaat 3 ml te bereiken per evenals een eindvolume. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator. </li></ol> Detectie van pluripotentie markers door immunofluorescentie microscopie Immunofluorescentie microscopie wordt gebruikt om de expressie van hESC pluripotentie markers Oct-4 en SSEA-4 tijdens het kweken te onderzoeken. <ol><li> Aspireren media van een goed en was met 1 x PBS, pH 7,4. Voeg 2 ml van 3,7% formaldehyde naar de bron om vast gedurende 10 minuten. </li><li> Spoelen met 1xPBS, pH 7,4, voeg 2 ml methanol aan de put en plaats bij -20 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Spoelen met 1xPBS, pH 7,4, en blok met 1 ml van 0,2% bovine serume albumine (BSA) gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1 ml van oktober-4 of anti-h/mSSEA-4 antilichaam (1:200 verdunning in 0,2% BSA), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C gedurende de nacht. (NB: voor SSEA-4 kleuring, ga direct naar stap 6) </li><li> Spoel drie keer met 1xPBS, pH 7,4, voeg FITC-geconjugeerd konijn IgG (1:500 verdunning in 0,2% BSA), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Spoel drie keer met 1xPBS, pH 7,4, en zet een daling van montage-oplossing (kunnen bevatten DAPI als nucleaire visualisatie is gewenst) in het midden van de put. Zet dekglaasje op de top van de cellen, afdichting met nagellak, en te evalueren door immunofluorescentie microscopie. </li></ol> Menselijke embryonale stamcellen ontvangsten ES media (embryonale stamcellen media): DMEM/F12 - 400ml Knockout Serum Vervanger - 100ml Niet-essentiële aminozuren - 5ml 200MM Glutamax / BME Oplossing - 5ml Penicilline / streptomycine - 5ml Meng goed en laatste hESC Cultuur Media in 500ml flesjes bewaren bij 4 ° C. Goed voor een maximum van twee weken. MEF Cultuur Media: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Niet-essentiële aminozuren - 10ml Glutamine - 10ml Penicllin / Streptomycine - 10ml Meng goed en bewaar laatste MEF Cultuur Media bij 4 ° C. 200MM Glutamax / BME Oplossing: Glutamax - 100ml β-mercapto-ethanol (Stock oplossing bij 14.3M) - 140 μ1 Meng twee oplossingen goed en vervolgens 10 ml aliquot porties. Houd porties bij -20 ° C. bFGF Solution (uiteindelijke concentratie van voorraad: 10 microgram / ml): bFGF (FGF2) - 50 ug 0,1% BSA in 1xPBS, pH 7,4 - 5 ml Los 50 microgram bFGF in 5 ml 0,1% BSA aan een 10 ug / ml bouillon te maken. Aliquot in 500 pi porties. Bewaren bij -80 ° C. Collagenase IV Solution (1mg/ml): Collagenase IV - 50mg DMEM/F12 Media - 50ml Voeg de collagenase IV poeder om een ​​50 ml falcon buis. In de kap, mix in 50 ml van de steriele DMEM/F12 media. Vortex de oplossing voor &lt;1 min. om te controleren of het poeder is opgelost. In de kap, passeren door een 0,22 urn filter in een nieuwe steriele 50 ml falcon buis. Deze oplossing is goed voor een maximaal 2 weken bewaard bij 4 ° C. Dispase Solution (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 Media - 8ml Aliquot commerciële 5mg/ml Dispase oplossing en bewaar bij -20 ° C. Verdunnen dispase om 1mg/ml met behulp van DMEM/F12. Deze oplossing kan worden gehouden voor 1 week bij 4 ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Deze reeks van drie video&#39;s laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen (video 1), hoe passage ze feeder cel-vrije platen (video 2) Matrigel, en hoe te onderhouden hESC &#39;s door de passage in Matrigel feeder cel-vrije omstandigheden (video 3). Tal van eerdere studies toonden aan dat instandhouding van levensvatbare, ongedifferentieerde hESC &#39;s vereist cultuur op geïnactiveerde MEF feeder-cellen. Echter, voor veel experimenten, is een zuivere populatie va...

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagens</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagens</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagens</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline / Streptomycine </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagens</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 antilichaam</td><td>Reagens</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;rythrine-geconjugeerde muis IgG3</td><td>Reagens</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd antirabbit IgG</td><td>Reagens</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

van mef tot matrigel 3: passage uit hesc &#39;s matrigel op matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC&#39; s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond.

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC&#39; s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 3 van 3.

Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC &#39;s Matrigel op Matrigel

Deze video demonstreert hoe de groei van humane embryonale stamcellen (hESCs) in feeder-celvrije condities kan worden onderhouden en hoe deze continu gepassaged kunnen worden ...

Om menselijke embryonale stamcellen die op Matrigel zijn gekweekt, te splitsen naar een nieuwe Matrigel-plaat. We beginnen met een samenvloeiende zeswells-plaat met embryonale stamcellen op Matrigel, die in een verhouding van 1:3 tot 1:5 naar een andere Matrigel-plaat gesplitst kunnen worden. Hierdoor kunnen de wells vier tot vijf dagen na het splitsen opnieuw samenvloeien.Was elke well die gesplitst zal worden met 1 XPBS pH 7.4. Voeg vervolgens één milliliter van 1 mg/mL digepaste substantie toe aan elke well en incubeer gedurende drie minuten bij 37 °C. Was elke well drie keer met 1 XPBS pH 7.4.Voeg vervolgens één milliliter embryonaal stamcelmedium zonder BF GF toe en gebruik een celschraper om de kolonies van de bodem van de well te schrapen. Verzamel de resuspendeerde embryonale stamcellen in een 15 milliliter Falcon-buis en pellet deze door centrifugatie bij 200 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Om de menselijke embryonale stamcellen op matrigel-platen uit te plaatsen, was eerst de matrigel-platen met D-M-E-M-F 12 en voeg 2,5 milliliter meth condition Media toe, aangevuld met 10 nanogram per mil.BFGF per well nadat de cellen zijn gecentrifugeerd; resuspendeer het pellet van menselijke auriculaire stamcellen in een passend volume medium. Medium aangevuld met 10 ng/ml BFGF. Pipetteer de celsuspensie drie keer op en neer.Houd er rekening mee dat de stamcelklonten uit matrigel gemakkelijk uit elkaar vallen. Het drie keer pipetteren zou daarom voldoende moeten zijn om de klonten te verbreken, zonder de kolonies te klein te maken. Verdeel ten slotte aliquots van 0,5 milliliters menselijke amry-stamcelсусpensie per well om een totaal van drie mils per well te bereiken.Zorg bij het eindvolume dat de celklontjes gelijkmatig verspreid zijn en plaats de plaat vervolgens in een incubator van 37 °C. Afhankelijk van de specifieke amry-stamcellijn zullen de amry-stamcellen vier tot vijf dagen na het splitsen opnieuw confluent worden. Wanneer de koloniën elkaar beginnen te raken, is het belangrijk om vast te stellen of uw menselijke amry-stamcellen hun pluripotentie of stamcelkarakter in kweek behouden.Om de pluripotentie van de cellen tijdens het kweken van embryonale stamcellen te controleren, maken we gebruik van immunofluorescentiemicroscopie om de expressie van de pluripotentiemarkers OCT four en SSEA four in een van de wells te onderzoeken. Onze zes-wellplaat wordt gefixeerd en gekleurd voor OCT four en SSEA four. Als we vaststellen dat de cellen fluorescent gelabeld zijn voor beide markers, weten we dat onze menselijke embryonale stamcellen hun pluripotentie hebben behouden en gebruikt kunnen worden voor onze experimenten.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u potente menselijke embryonale stamcellen kunt kweken en onderhouden, met behulp van embryonale fibroblasten als feeder-cellen en onder veldvrije condities op Matrigel. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine.

Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. Deel 1 van 3.

Van MEF op I Matrigel: passage hESC &#39;s in de aanwezigheid van MEFs

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 2 van 3.

Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC &#39;s van MEFs op Matrigel

Geregisseerd differentiatie van hESC 's in de specifieke cellen heeft gegenereerd veel belangstelling voor regeneratieve geneeskunde. Wij bieden een beknopte, stap-voor-stap protocol voor het bepalen van...

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Om de beperkingen te vermijden die gepaard gaan met het enzymatisch of mechanisch passeren van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) gekweekt op feedercellen, hebben we een snelle, effectieve, kostenefficiënte methode met een hoge opbrengst ontwikkeld voor het oogsten van hESC- of hiPSC-kolonies die worden onderhouden op een voedingscellaag van menselijke voorhuidfibroblasten met behulp van EDTA-gemedieerde kkleefkracht.

Snelle, kostenefficiënte, enzymvrije passaging van menselijke pluripotente stamcellen op voedingscellen door ethyleendiaminetetra-azijnzuur-gemedieerde dis-adhesie

Leer het passeren en onderhouden van menselijke embryonale stamcellen op Matrigel zonder voedercellen. Deze methode bevestigt pluripotentie via immunofluorescentiemicroscopie voor betrouwbaar stamcelonderzoek.

Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC 's Matrigel op Matrigel

Meer video's verkennen