Name: Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer hoe u effector-geheugen T-cellen in het rattenoor visualiseert met behulp van twee-fotonenmicroscopie na inductie van adoptieve DTH. Deze methode maakt in situ analyse van immuunresponsen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Inductie van Adoptieve DTH Zie Jove artikel: <a href="/index/Details.stp?ID=325">Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten</a> Christine Beeton, George K. Chandy Afdeling Fysiologie en Biofysica, University of California, Irvine J. Gevisualiseerde Experimenten, Issue 8 Hier hebben we gewijzigd dit protocol door gebruik te maken antigeen (ovalbumine) geconjugeerd aan Texas-Rood in een 1:1 verhouding met niet-gelabelde antigeen te zorgen voor visualisatie van fagocytaire antigeen-presenterende cellen. Oor Tissue Oogst <ol><li> Euthanaseren de rat op de gewenste tijd-punt door de procedures beschreven in het goedgekeurde dier protocol. Hier gebruiken we een overdosis van het verdovingsmiddel, isofluraan. Dit gebeurt in een gesloten container bevindt zich in een goed geventileerde kap. Zorg ervoor dat het dier dood is door een onthoofding van door het openen van de borstholte en snijden het hart. </li><li> Met grote schaar te verwijderen het oor met een enkele cut, zo dicht mogelijk bij het lichaam van het dier mogelijk te maken (figuur 1). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Figure_1.jpg" /> Figuur 1. Verwijdering van de rat oor </li><li> Plaats het oor in een 15 ml conische buis met ~ 10 ml ijskoud 1x PBS of RPMI-1640. Houd de weefselmonsters op ijs totdat u klaar bent om het weefsel te bereiden voor de beeldvorming. </li><li> Het imago van de weefsel zo snel mogelijk, we vinden wel dat 1 tot 2 uur op het ijs geen merkbaar effect op de celbeweeglijkheid heeft in het weefsel ten opzichte van weefsel geoogst en direct afgebeeld. </li></ol> Tissue Voorbereiding voor Imaging I. Verwijdering van epidermale en dermale laag * Opmerking: De diepe dermale laag moeten worden gehouden intact. Als dit juist gebeurt grote bloedvaten blijven intact en het kraakbeen van het oor niet worden blootgesteld. Dit is een moeilijke techniek, vooral als er geen ontsteking (controle condities) en het is nuttig het gebruik van een microscoop ontleden. <ol><li> Plaats zowel het weefsel en de media uit de conische buis in een 10 cm weefselkweek schotel. </li><li> Met handschoenen aan te houden van de rat oor zachtjes op het puntje van het oor (distale) met de dorsale zijde van het oor naar boven gericht (figuur 2). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Figure_2.jpg" /> Figuur 2. Trim vacht uit het oor </li><li> Met uw duim op de top van het oor, gestage het weefsel tijdens het gebruik van de punt van de gesloten Dumont # 5 schaar om de dermis te scheiden van de diepe dermis. Als alternatief, wanneer de rand van het oor heeft een overstek van huid / diepe dermis, kan dit worden begrepen met een pincet en voorzichtig getrokken om dit te scheiden van het weefsel onder (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Figure_3.jpg" /> Figuur 3. Het verwijderen van de bovenste dermis </li><li> Zodra een klein deel van de huid is gescheiden van het onderliggende weefsel, herhaalt u de scheiding stappen als alternatief met een schaar te snijden tussen de dermale lagen en een tang om voorzichtig te verwijderen en trek het losgekomen huid. </li><li> Expose een 5 x 5 mm of groter gebied van het oor weefsel dat ten minste 3 mm van de eerste plaats van antigeen injectie (figuur 4). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Figure_4.jpg" /> Figuur 4. Weefsel bloot voor beeldvorming </li></ol> II. Het beveiligen van Tissue aan de Imaging Stage <ol><li> Knip een plastic hoesje slip tot een formaat iets groter is dan bereid weefsel. </li><li> Verdeel een dunne laag van 3M Vetbond ™ weefsel-safe lijm over de hele dia. </li><li> Pak de hoek van de voorbereide weefsel (waar je waarschijnlijk niet om de afbeelding), te verwijderen uit de media, en dep de onderkant van het weefsel op de lens van papier of Kym veeg om overtollige media te verwijderen. </li><li> Raak de rand van het weefsel om de lijm overdekte glijbaan (de Vetbond hardt direct op nat weefsel). Voorzichtig vlak stuk het weefsel, met de andere kant als laatste aan de Slide Touch (figuur 5) <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Figure_5.jpg" /> Figuur 5. Mount weefsel hoes </li><li> Cure de Vetbond ™ door het omkeren van het weefselmonster / dia en dompelen in een reservoir van media zodanig dat het weefsel en schuif zijn gezicht naar beneden en ongeveer op een hoek van 45 graden. Houdt het weefsel op zijn kop in een hoek helpt om overtollige lijm te voorkomen dat genezen op de blootgestelde weefsel oppervlak. Lijm op het oppervlak van het weefsel zal blokkeren van de laser (Figuur 6). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Figure_6.jpg" /> Figuur 6. Cure vetbond weefsel glue door dompelen in de media Opmerking: Stappen 2-5 mei een beetje oefening nemen de knie te krijgen. Probeer het oefenen met weggegooid of extra weefsel stukken voordat voor de eerste keer. </li><li> Dep een kleine hoeveelheid siliconenvet op de bodem van de dia. </li><li> Plaats de dia in de perfusie kamer. Zorg ervoor dat de perfusie media stroomt, 37 ° C en zuurstof voor het toevoegen van weefsel. Druk licht op de randen van de glijbaan het maken van een afdichting met het silicium vet tussen de onderkant van de perfusie kamer en de plastic cover slip. </li></ol> III. Two-Photon Imaging <ol><li> Met behulp van bright-field doorgelaten licht, richten zich op de bovenkant van het weefsel. Schakel alle lichten. </li><li> Schakel de laser, PMT&#39;s zoals vereist door de multi-foton microscoop systeem. </li><li> Tweede harmonische generatie (SHG) in zeer besteld vezelachtige eiwitten (collageen en myosine) geeft een signaal op de helft van de golflengte van de laser excitatie. We maken gebruik van excitatie bij 900 nm, wat leidt tot SHG bij 450 nm kan worden gevisualiseerd met behulp van de &quot;blauwe&quot; kanaal van de microscoop. SHG generatie is een niet-lineair (twee-foton) proces, en dus zorgt voor een optische &quot;snijden&quot;-effect vergelijkbaar met dat van twee-foton excitatie van de fluorescentie. De maximale efficiëntie van de SHG treedt op wanneer de fibrillen loodrecht op de laser, terwijl de fibrillen die parallel lopen zullen niet worden gevisualiseerd. 1 </li><li> Zoek een goede beeldvorming gebied met veel cellen, stelt u uw acquisitie omgeving zodanig dat de meerderheid van de cellen in het centrum en start beeldvorming. Opmerking: In DTH reacties, T-cellen en andere cellen infiltreert zijn vaak te vinden om samen te worden geconcentreerd terwijl tegelijkertijd andere gebieden zijn verstoken van infiltrerende cellen 2. Daarom kan het enige tijd aan het zoeken het weefsel om de beste omgeving om de afbeelding te vinden. </li><li> Controleer op levensvatbaarheid van de cellen door het beoordelen van cel-snelheid en de polariteit tijdens de beeldvorming. Gebruik de laagste laser kracht die acceptabele beeldkwaliteit biedt om ervoor te zorgen minimale foto-schade. </li><li> Swap in een nieuw weefsel preparaat als dat nodig is. </li></ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

imaging effector geheugen t-cellen in het oor na inductie van adoptieve dth

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een immuunreactie waarbij de belangrijkste spelers zijn CCR7 - effector / geheugen T-lymfocyten. Hier tonen we een methode voor het induceren en het opnemen van de voortgang van een DTH-reactie in de rat oor. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van de voorbereiding van de rat oor weefsel voor twee-foton beeldvorming van de CCR7 - effector / memory T-cel-respons. Een adoptie DTH wordt geïnduceerd door de intraperitoneale injectie van GFP-gelabelde Ova-specifieke CCR7 - effector / memory T-cellijn (Beeton, C J. Gevisualiseerde Experimenten, Issue 8). Cellen worden dan toegestaan ​​om in de rat equilibreren gedurende 48 uur vóór de uitdaging door het injecteren van een oor met een zoutoplossing (controle oor) en de andere met een 1:1 mix van eicellen en Ova geconjugeerd met Texas-Rood (Ova-TR) naar visualisatie toe van de ingezeten antigeen-presenterende cellen. We beschrijven een methode van het weefsel voorbereiding nuttig zijn voor beeldvorming van de beweeglijkheid van de cellen in de diepe dermale laag tijdens een immuunrespons, in combinatie met visualisatie van collageen vezels door tweede harmonische generatie. Oor weefsel wordt gesneden in 5 x 5 mm vierkantjes (iets groter is beter) en gemonteerd op kunststof dekglaasjes met behulp van Vetbond ™, die vervolgens worden beveiligd met siliconenvet in een imaging kamer en superfused door zuurstof-borrelen weefselkweek medium bij 37 ° C .

Hier laten we zien een methode voor het induceren en het opnemen van de voortgang van een vertraagde type-overgevoeligheid (DTH) reactie in de rat oor. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van de voorbereiding van de rat oor weefsel voor twee-foton beeldvorming van de effector / geheugen T-cel-respons.

Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH

Vertraagde overgevoeligheidsreactie (DTH) is een immuunreactie waarbij de belangrijkste actoren CCR7-effector-/geheugen T-lymfocyten zijn. Hier demonstreren wij een ...

Hallo, ik ben Melanie Matthew. Ik ben een promovendus in het laboratorium van Micah Hollins aan de University of California Irvine, in de afdeling Fysiologie en Biofysica. Vandaag gaan we, samen met dr. Christine Beaton, laten zien hoe we de responsieve effector- of memory T-celpopulatie in het rattenoor in beeld brengen.Dr. Christine Beaton zal eerst een vertraagde overgevoeligheidsreactie (DTH) induceren in het rattoor. Daarna gaan we over naar in situ beeldvorming van het rattoor via tweefotonmicroscopie. Twee dagen geleden heb ik GFP-gelabelde albuminespecifieke T-cellen geïnjecteerd in een hyperimmuun Lewis-rat.En vandaag ga ik dezelfde rat in het oor uitdagen. In het rechteroor ga ik albumine injecteren en in het linkeroor ga ik gewoon wat PBS injecteren.De dosis albumine die ik injecteer is 20 micrograms in 20 microliter. En de albumine die ik gebruik is een mengsel van één op één van Texas Red-gelabelde albumine en ongelabelde albumine. Dit is de rechterzijde waarop ik zal laten zien hoe ik ga injecteren.Ik ben rechtshandig, dus met mijn linkerhand heb ik de handschoen uitgedaan om één vinger onder het oor en de andere erboven te kunnen plaatsen om de huid te spannen. Zo ka

imaging-effector-memory-t-cells-ear-after-induction-adoptive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector geheugen T-lymfocyten. Hier laten we zien hoe actief DTH induceren in Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.

Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een ontstekingsreactie gemedieerd door CCR7-effector-geheugen T (TEM) lymfocyten. Hier laten we zien hoe de antigeen-specifieke TEM-cellen te activeren, te induceren adoptie-DTH bij Lewis ratten en toezicht op de ontstekingsreactie.

Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

We beschrijven een waardevolle diagnostische test die zouden kunnen worden gebruikt om de terugtrekking van immunosuppressie na transplantatie beslist zo verhoogd risico op afstoting. De test maakt gebruik van de principes van Delayed Type Overgevoeligheid en biedt nauwkeurige beoordeling van zowel donor-specifieke effector en regulerende immuunreacties gemonteerd door de ontvangers.

Trans-vivo Vertraagd Type Overgevoeligheid Assay voor Antigen Specifieke Verordening

The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Dit rapport beschrijft een methode om chronische experimentele auto-immuun droge ogen in Lewis-ratten te induceren door middel van immunisatie met een emulsie van ratlakakalextract, ovalbumine en complete Freund's adjuvans, gevolgd door de injectie van lacrimale klier extract en ovalbumine in de forniceal subconjunctiva en lacrimale klieren Zes weken later.

Een Chronisch Autoimmuun Droog Oog Rat Model Met Toename In Effector Geheugen T Cellen In Oogappel Weefsel

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Contactovergevoeligheid (CHS) is een muizenexperimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD). CHS is gebaseerd op sensibilisatie met reactieve hapten door de geschoren huid van de borst en buik te schilderen, met een daaropvolgende oorhuiduitdaging met een verdunde hapten, waardoor een zwellingsreactie ontstaat die op verschillende manieren wordt beoordeeld.

Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis

De studie toont de rol van de huid aan bij het moduleren van immuunresponsen bij muizen door middel van epicutane (EC) immunisatie. EC-immunisatie met een eiwitantigeen kan immuunresponsen bij contactovergevoeligheid onderdrukken of door de huid geïnduceerde onderdrukking omkeren in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. EC-immunisatie is veelbelovend als een effectieve, naaldvrije benadering van immunotherapie.

Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie

Leer hoe u effector-geheugen T-cellen in het rattenoor visualiseert met behulp van twee-fotonenmicroscopie na inductie van adoptieve DTH. Deze methode maakt in situ analyse van immuunresponsen mogelijk.

Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH

Meer video's verkennen