Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH
August 14th, 2008
Hier laten we zien een methode voor het induceren en het opnemen van de voortgang van een vertraagde type-overgevoeligheid (DTH) reactie in de rat oor. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van de voorbereiding van de rat oor weefsel voor twee-foton beeldvorming van de effector / geheugen T-cel-respons.
Hi, ik ben Melanie Matthew. Ik ben een afgestudeerde student in het Micah Hollins lab aan de University of California Irvine in de afdeling Fysiologie en Biofysica. En vandaag, samen met Dr. Christine Beaton, laten we je zien hoe we het reagerende effect of de geheugen T-cel populatie in de oor van de rat beelden.
Dr. Christine Beaton zal eerst een vertraagde type overgevoeligheid DTH in de oor van de rat induceren. En dan gaan we verder met in situ beeldvorming van de oor van de rat door middel van twee fotomicroscopie. Twee dagen geleden heb ik GFP-gelabelde van albumine-specifieke T-cellen geïnjecteerd in hyper naar een Lewis.
En vandaag ga ik dezelfde rat uitdagen in de oor. Dus in de rechteroor ga ik albumine injecteren. En in het linkeroor ga ik gewoon wat PBS injecteren.
De dosis albumine die ik injecteer is 20 microgram in 20 microliter. En de albumine die ik gebruik is een mengsel van één op één van Texas Red-gelabelde van albumine en niet-gelabelde van albumine. Dus dit is de rechterkant waarop ik je ga laten zien hoe ik ga injecteren.
Dus ik heb mijn linkerhand, ik ben rechtshandig. Dus mijn linkerhand heb ik de handschoen uitgedaan om een vinger onder de oor te kunnen leggen en de andere erboven om de huid te strekken, zodat ik precies kan zien waar ik met de naald zit en tussen de twee huidlagen in de lucht kan gaan, die erg dun is. Dus daarvoor gebruik ik 27 gauge naalden om iets extreem duns te hebben om daar naar binnen te gaan.
Dus als ik het omdraai, zie je zeker waar de Texas red is gegaan en waar de PBS is gegaan. Dus we zijn nu 42 uur na de uitdaging hier en ik ga een veerlading micrometer gebruiken om de dikte van de oor te meten. Dus ik ga beide oren meten, het rechteroor dat met het albumine is uitgedaagd en het linkeroor dat niet is uitgedaagd en het verschil in dikte zal ons een idee geven van de intensiteit van de ontsteking.
Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 of 58 of 57 of 57. En het andere oor 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Hallo. Dus Christine Beaton heeft ons net de rat gegeven die ze heeft verwijderd na het meten van de DTH-reactie.
We hebben ze hierheen getransporteerd op ijs. Dit is de linkeroor van de rat. En we zijn nu in het laboratorium van Ian Parker bezig met twee foton microscopie.
Dus ik ga deze oren voorbereiden voor in situ twee foton beeldvorming. Dus ik ga een van de rattenoren hier bij de basis van het oor voorbereiden. Het weefsel is veel dikker en we hebben wat haar dat eruit steekt dat een beetje rommelig zal zijn als ik er gewoon in begin te snijden.
Dus het eerste wat ik ga doen is wat van dat haar eraf snijden. Ik houd het oor voorzichtig vast. Mijn vinger maakt het veel gemakkelijker om het weefsel te controleren als je het tussen je duim en wijsvinger houdt.
Ik geef het de voorkeur boven het gebruik van een pincet omdat pincet, ik kan gewoon niet zo gemakkelijk voelen wat het weefsel doet en we maken ons altijd zorgen over het beschadigen van het weefsel. Dus we willen in staat zijn om te voelen wat we ermee doen. Dus ik gebruik gewoon mijn vingers.
Dit is de dermale laag die zich hier losmaakt in het oor van de rat. Dus terwijl ik wat haar wegsneed, kon ik voorzichtig wat van die dermis wegsnijden, die gewoon een beetje afpelt. Er zijn wat heel kleine dissectiescharen om dit te doen, gewoon wat mooie gebogen scharen.
Je wilt het weefsel niet prikken en je kunt je een weg banen van de basis van het oor naar de bovenkant, gewoon voorzichtig een deel van de dermale laag wegsnijden. Dus we hebben niet een heel groot venster nodig voor beeldvorming. Dit gebied hier zal genoeg zijn om wat mooie beelden te krijgen van de cellen die het weefsel infiltreren.
Dus je kunt zien dat we nog steeds enkele intacte bloedvaten hebben hier aan de basis van het oor en vrijwel tot aan de punt van het oor. Dit hele gebied zal erg goed zijn voor het beeldvormen van DTH. Dus ik ga dat stukje weefsel dat ik heb blootgelegd uit snijden om een klein stukje weefsel te maken dat we kunnen lijmen op ons beeldvormingsplatform.
Dus maak hier een snede, draai het om. Ik kan hier snijden. We hebben een mooi klein stukje weefsel dat we kunnen voorbereiden op onze twee foton scope voor beeldvorming.
Dit zijn onbreekbare plastic dekglasjes die we op de grootte van ons weefsel snijden. En dan monteren we het weefsel hierop met behulp van de bet bond. En dan bevestigen we deze onbreekbare plastic dekglasjes met siliconenvet op ons in situ beeldvormingsplatform.
Ik ga dit kleine stukje luchtweefsel nemen, het heeft een beetje curve, dus ik moet het plat maken terwijl ik het vastlijm. Niet ideaal, maar het zal werken. Dus je neemt gewoon een van deze dekglasjes en je snijdt het, schat de grootte van je oor een beetje in en snijd het een beetje groter dan je denkt dat het gaat worden.
Om ons weefsel op het dekglas te monteren. We gebruiken een weefselveilige superlijm genaamd bet long. We krijgen het van 3M en we doen er een paar druppels van op ons dekglas.
Ik wil niet te veel hebben. En je wilt er ook voor zorgen dat het gelijkmatig verspreid is. Dus ik ga een klein stukje lenspapier nemen en de hoek ervan gebruiken om de lijm over het dekglas te wikkelen.
Ga een beetje omhoog bij de extra lijm en zodra deze lijm water raakt, zal het uitharden. Dus je wilt heel voorzichtig zijn met je weefselmonster. Dus ik ga het weefselhoekje hier pakken dat we waarschijnlijk niet gaan beelden omdat het op het gebogen deel zit.
Ik ga het een beetje drogen. De onderkant ervan, gewoon op het lenspapier zodat het helemaal droog is. En
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel demonstreert een methode voor het induceren en registreren van vertraagde type overgevoeligheid (DTH) reacties in de rattenoor, gevolgd door de voorbereiding van rattenoorweefsel voor twee-foton beeldvorming van T-cel reacties.
Belangrijke studie componenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Neurowetenschap
- Biofysica
Achtergrond
- Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een belangrijke immuunrespons.
- Het begrijpen van T-cel dynamica is cruciaal voor immunoloogisch onderzoek.
- Twee-foton microscopie maakt in situ beeldvorming van cellulaire reacties mogelijk.
- Rattenmodellen worden veel gebruikt om immuunreacties te bestuderen.
Doel van de studie
- Om DTH reacties in rattenoren te induceren en te registreren.
- Om effector en geheugen T-cel populaties te visualiseren.
- Om het begrip van T-cel gedrag in vivo te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Inductie van DTH in rattenoorweefsel.
- Injectie van GFP-gelabelde T-cellen.
- Twee-foton microscopie voor beeldvorming.
- In situ analyse van T-cel reacties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van DTH in het rattenoor model.
- Visualisatie van T-cel populaties met behulp van twee-foton microscopie.
- Inzichten in de dynamica van immuunreacties in vivo.
- Gedemonstreerde methode kan worden toegepast op verdere immunologische studies.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak om DTH reacties te bestuderen.
- Twee-foton beeldvorming is effectief voor het observeren van T-cel gedrag.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van immuunreacties.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of effector memory T cell dynamics in a tissue-specific immune response, supporting mechanistic de-risking in immunology target validation. By combining adoptive DTH induction with two-photon imaging, it provides quantitative, spatially resolved data on T cell motility and antigen-presenting cell interactions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular behavior to functional immune outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing CCR7- effector/memory T cell recruitment and activation in vivo.
- Operational Value: Enables functional validation of immunomodulatory targets through direct observation of T cell-APC interactions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating T cell motility patterns with inflammatory intensity in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tissue explants for consistent, reproducible imaging of immune cell dynamics.
- Operational Value: Establishes a platform for quantitative readouts such as cell tracking, interaction frequency, and infiltration depth.
- Scalability: Uses minimally processed ear tissue compatible with high-resolution imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains immunological relevance by preserving native tissue architecture and cell-cell interactions during imaging.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal tracking of immune responses in the same model.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity in lead identification by providing direct evidence of target engagement in tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of immunomodulatory candidates based on real-time immune cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing T cell responses to antigen challenge in a controlled DTH model.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with standardized thickness and mounting for reproducible two-photon imaging.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cell velocity, track length, and spatial distribution relative to collagen and APCs.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical by using the same rat model for both induction and imaging.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple immunology targets and antigen-specific T cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through direct visualization of effector memory T cell function in tissue.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging conditions to improve reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking T cell dynamics to inflammatory outcomes in a predictive model.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by validating target effects on immune cell behavior prior to costly in vivo studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in adoptive T cell transfer, DTH induction, and two-photon microscopy.
- Dependent on access to two-photon microscopes with second harmonic generation capability for collagen visualization.
- Necessitates standardized tissue handling protocols to ensure consistent mounting and viability during imaging.
- Involves adaptation considerations when applying the ear preparation method to other tissue types or disease models.
- Limited by the need for antigen-specific T cell lines and appropriate controls to distinguish specific from nonspecific inflammation.
