Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH

Hallo, ik ben Melanie Matthew. Ik ben een promovendus in het laboratorium van Micah Hollins aan de University of California Irvine, in de afdeling Fysiologie en Biofysica. Vandaag gaan we, samen met dr. Christine Beaton, laten zien hoe we de responsieve effector- of memory T-celpopulatie in het rattenoor in beeld brengen.

Dr. Christine Beaton zal eerst een vertraagde overgevoeligheidsreactie (DTH) induceren in het rattoor. Daarna gaan we over naar in situ beeldvorming van het rattoor via tweefotonmicroscopie. Twee dagen geleden heb ik GFP-gelabelde albuminespecifieke T-cellen geïnjecteerd in een hyperimmuun Lewis-rat.

En vandaag ga ik dezelfde rat in het oor uitdagen. In het rechteroor ga ik albumine injecteren en in het linkeroor ga ik gewoon wat PBS injecteren.

De dosis albumine die ik injecteer is 20 micrograms in 20 microliter. En de albumine die ik gebruik is een mengsel van één op één van Texas Red-gelabelde albumine en ongelabelde albumine. Dit is de rechterzijde waarop ik zal laten zien hoe ik ga injecteren.

Ik ben rechtshandig, dus met mijn linkerhand heb ik de handschoen uitgedaan om één vinger onder het oor en de andere erboven te kunnen plaatsen om de huid te spannen. Zo kan ik precies zien waar ik ben met de naald en tussen de twee huidlagen door gaan in de lucht, wat zeer dun is. Hiervoor gebruik ik naalden met een gauge van 27, zodat ik iets extreem duns heb om daar in te brengen.

Als ik het nu omdraai, zie je duidelijk waar de Texas red is gegaan en waar de PBS is gegaan. We zijn nu 42 uur na de challenge en ik ga een micrometer met veer gebruiken om de oordikte te meten. Ik ga beide oren meten: het rechteroor dat is uitgedaagd met albumine en het linkeroor dat niet is uitgedaagd; het verschil in oordikte geeft ons een indicatie van de intensiteit van de ontsteking.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 of 58 of 57 of 57. En het andere oor 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Hallo. Christine Beaton heeft ons net de rat gegeven die ze heeft verwijderd na het meten van de DTH-respons.

We hebben ze hier op ijs getransporteerd. Dit is het linker-oor van de rat. En we zijn nu hier in het laboratorium van Ian Parker voor tweefotonmicroscopie.

Ik ga deze oren nu voorbereiden voor in situ tweefoton-imaging. Hiervoor bereid ik één van de rattenoren voor aan de basis van het oor. Het weefsel is hier een stuk dikker en er steekt wat haar uit, wat onhandig wordt als ik er direct in begin te snijden.

Het eerste wat ik ga doen, is een deel van dat haar afknippen. Ik houd het oor voorzichtig vast. Door het weefsel tussen de duim en de wijsvinger vast te houden, is het veel gemakkelijker om het daadwerkelijk te controleren.

Ik geef hier de voorkeur aan boven het gebruik van pincetten, omdat ik met pincetten simpelweg minder goed kan voelen wat het weefsel doet en we er altijd bezorgd over zijn dat we het weefsel beschadigen. We willen dus kunnen voelen wat we ermee doen. Daarom gebruik ik graag mijn vingers.

Dit is de dermale laag die hier in het rattenoor loslaat. Terwijl ik wat haar wegtrimde, kon ik voorzichtig een deel van de dermis wegsnijden die gewoon afpelt. Hiervoor worden zeer kleine dissectiescharen gebruikt, gewoon mooie gebogen scharen.

U wilt het weefsel niet doorprikken; u kunt vanaf de basis van het oor naar boven werken door voorzichtig een deel van de dermale laag weg te snijden. We hebben geen heel groot venster nodig voor de beeldvorming. Dit gebied hier zal voldoende zijn om mooie beelden te krijgen van de cellen die het weefsel infiltreren.

Zo kunt u zien dat er nog enkele intacte bloedvaten aanwezig zijn aan de basis van het oor en vrijwel tot aan de punt van het oor. Dit hele gebied is zeer geschikt voor het in beeld brengen van DTH. Daarom ga ik nu het stuk weefsel dat ik heb blootgelegd uitsnijden, om een klein stukje weefsel te verkrijgen dat we op onze imaging-stage kunnen vastlijmen.

Maak simpelweg hier een insnede en draai het om. Ik kan hier snijden. We hebben nu een mooi klein stukje weefsel dat we kunnen voorbereiden op onze tweefotonenscoop voor beeldvorming.

Dit zijn onbreekbare plastic dekglasjes die we op de maat van ons weefsel snijden. Vervolgens monteren we het weefsel op deze glasjes met behulp van bet bond. Daarna bevestigen we deze onbreekbare plastic dekglasjes met siliconenvet aan onze in situ beeldvormingstafel.

Ik neem dit kleine stukje oeweefsel; het heeft een lichte kromming, dus ik zal het vlak moeten drukken terwijl ik het vastlijm. Dat is niet ideaal, maar het zal werken. Neem vervolgens een van deze dekglasplaatjes en knip deze; schat de grootte van het oor in en knip een stukje dat iets groter is dan je denkt dat nodig is.

Om ons weefsel op het dekglas te monteren, gebruiken we een weefselveilige superlijm genaamd bet long. Deze verkrijgen we van 3M en we brengen een paar druppels daarvan aan op ons dekglas.

Ik wil er niet te veel hebben. Daarnaast moet u er zeker van zijn dat het gelijkmatig is verdeeld. Daarom neem ik een klein stukje lenspapier en gebruik ik de hoek hiervan om de lijm over het dekglas te verspreiden.

Ik zal een klein beetje extra lijm aanbrengen en zodra deze lijm in contact komt met water, zal hij uitharden. Wees daarom zeer voorzichtig met uw weefselmonster. Ik pak hier de hoek van het weefsel vast die we waarschijnlijk niet zullen afbeelden, omdat deze zich op het gebogen gedeelte bevindt.

Ik ga het een klein beetje droogdeppen. De onderkant ervan, gewoon op het lenspapier zodat het helemaal droog is. En ik ga de hoek hiervan, dit rattoeweefsel van het oor, tegen het dekglas aanplaatsen.

En het moet onmiddellijk uitharden op de plek waar ik het heb aangeraakt. De rest ga ik nog een beetje gladstrijken door voorzichtig op de randen te drukken. Zo kunnen we hopelijk een mooi beeldkader verkrijgen.

Ik ga nu de lijm uitharden door deze in het medium te dompelen. Om te voorkomen dat er lijm op het weefsel komt, draaien we het om en dompelen we het langzaam, eerst vanuit één hoek, in ons reservoir met medium; het zou dan goed vastgeplakt moeten zitten, zodat we het kunnen afbeelden in onze weefselbeeldkamer. We gaan nu het stukje weefsel dat we hebben voorbereid voor in situ beeldvorming, het stukje beeweefsel, op de objecttafel monteren.

Hier is ons stukje weefsel met siliconevet aan de onderzijde, en we plaatsen dit voorzichtig in de stroom medium. Het siliconevet zorgt ervoor dat het weefsel aan de onderkant van de objecttafel blijft kleven. We starten de stroom medium op met onze temperatuurprobe direct ernaast.

We gaan nu scherpstellen. Ik schakel de focuslamp in, ons heldere licht. Ik neem het 20x objectief en laat dit in de kamer zakken.

Zorg ervoor dat het het weefsel niet raakt. Kijk door het oculair en stel scherp op ons oorweefsel. En daar is het.

Hier ziet u autofluorescerende groene haarfollikels in de dermale laag van het ratenoor. Deze haarfollikels worden omringd door een dichte laag collageen. Dit is een laag die we verwijderen voor de T-fotonen-imaging van de T-effectorgeheugencellen.

De autofluorescerende haarfollikels zullen het beeld maskeren, evenals het heldere collageen van de bovenste dermale laag. Oké, hier kunt u zien dat we APC's hebben die Texas red-geconjugeerde volin hebben opgenomen, en zij bevinden zich langs deze blauwe collageenvezels. De collageenvezels zijn blauw door tweede-harmonische generatie die we krijgen bij fotonimaging langs de collageenvezels.

We hebben zeer beweeglijke T-cellen. Deze kruipen op en neer over de collageenvezels en interageren met de APC's. In deze video zag u hoe Dr. Christine Beaton een adoptieve DTH induceerde bij de Lewis-rat.

Vervolgens hebben we onze oorpreparaat voor beeldvorming getoond, de responsieve T-effector-geheugencellen, het rattenoor en onze tweefotontechnieken om dit te realiseren.