Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel
October 1st, 2008
De cellulaire heterogeniteit van het hersenweefsel vormt een belangrijke beperking voor de studie van de epigenetische markeringen in chromatine, omdat de meeste assays gebrek aan enkele cel resolutie. Neuronen meestal vermengd met glia en andere niet-neuronale cellen. Wij bieden een protocol te halen en neuronale kernen verzamelen van menselijke hersenen.
Om de chromatine DNA-interacties te bestuderen die de neuronale specifieke genexpressie in de menselijke hersenen regeren, moet eerst een zuivere populatie neuronale kernen worden verkregen om dit te doen. Postmortem menselijk hersenweefsel wordt gehomogeniseerd en de totale kernen worden geïsoleerd met behulp van dichtheidsgradientcentrifugatie. Vervolgens worden kernen gelabeld met neuron-specifieke antilichamen die via flowmetrische sortering worden geïsoleerd en tenslotte geconcentreerd met ultracentrifugatie.
Hallo, ik ben Anish Matan van het laboratorium van Dr. Sharon Mc Barian hier in de afdeling psychiatrie van de University of Massachusetts Medical School. Vandaag zal ik u een procedure laten zien voor de isolatie van neuronale kernen uit postmortem menselijk hersenweefsel. Dus laten we beginnen.
Voor elke te sorteren kernenmonster begint u met duizend milligram bevroren postmortem hersenweefsel. Met deze hoeveelheid kunt u ongeveer 5 miljoen neuronale kernen verkrijgen na fluorescentie-geactiveerde sortering. Om de kernenextractie te beginnen, plaatst u 250 milligram hersenweefsel in een down downer met vijf milliliter lysebuffer en plaatst u het op ijs.
Zodra het weefsel is ontdooid, laat u het een minuut op ijs staan. Na het downen, brengt u het gehomogeniseerde weefsel over naar een 15 milliliter heldere ultracentrifugebuis en zet u de buis vervolgens op ijs. Herhaal deze homogenisatie voor het resterende weefsel.
Pipetteer vervolgens voorzichtig negen milliliter sucrose-oplossing naar de bodem van de ultracentrifugebuizen om een concentratiegradiënt in te stellen, zodat de gehomogeniseerde weefseloplossing zich boven de sucrose-oplossing bevindt. Weeg nu de ultracentrifugebuizen om ervoor te zorgen dat ze tijdens de ultracentrifugatie gebalanceerd zijn. Maak eventuele aanpassingen aan het gewicht door lysebuffer toe te voegen aan de bovenste laag. Nadat de buizen zijn gewogen, plaatst u ze in de ultracentrifuge met behulp van de SW 28 rotor ultracentrifuge monsters bij 107163,6 RCF gedurende 2,5 uur bij vier graden.
Zodra de centrifugatie is voltooid, aspireert u de snat evenals de laag van het afval die op de concentratiegradiënt is gevonden. Zorg ervoor dat u de pellet aan de bodem van de buis niet verstoort, die de kernen bevat. Voeg vervolgens 500 microliters van één XPBS toe aan elke pellet en laat het 20 minuten op ijs staan.
Na 20 minuten, resuspendeer de pellets door op en neer te pipetten. De incubatie op ijs zorgt ervoor dat de pellets een beetje oplossen, wat het gemakkelijker maakt om de kernen te resuspenderen, waardoor de hoeveelheid stress die de kernen ervaren wordt verminderd. Breng vervolgens de resuspendeerde en kernen over naar twee mil centrifugebuizen.
Combineer de nucleïnezuuroplossing van twee van de ultra centagebuizen in elke micro centrifugeerbuis en plaats de monsters opnieuw op ijs. Nu de nucleïnezuurextractie voltooid is, ga ik verder met de immunokleuringstap om neuronale kernen te isoleren door middel van fact, het monster dat kernen bevat zal worden geïncubeerd met een immunokleuringsmengsel bestaande uit primaire en secundaire antilichamen, evenals blokkerende links om de immunokleuringsmengsel te maken bij 1,2 microliters neuron-specifiek antilichaam nieuw N naar 300 microliters van één XPBS. Voeg vervolgens honderd microliters blokkeringsmix toe, die 0,5% BS, A en 10% normaal code serum in één XPBS bevat.
Voeg tenslotte een microliter van het secundaire antilichaam genaamd LOR 4 88 toe. Bereid ook een immunokleuring voor een negatief controlemonster voor voor dit immunokleuringsmengsel. Sluit het primaire antilichaam nieuw end uit en vervang het door 1,2 microliters van één XPBS.
Vortex nu immunokleuringsmengsels en incubeer ze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker terwijl de kleuringsmengsels incuberen. Bereid de controlekernenmonsters voor voor het negatief controlemonster Eloqua 20 microliters van de resuspendeerde kernen in een twee mil buis met 980 microliters van één XPBS. Bereid ook een ongekleurd controlemonster, dat alleen de kernenoplossing en PBS bevat.
Nu Eloqua 20 microliters van de kernen in een andere buis en breng het volume terug op één mil met één XPBS. Plaats vervolgens alle monsters terug op ijs. Nu zijn de immunokleuringsmengsels klaar.
Incubeer toe te voegen 401 microliters van het mengsel in het juiste monster. Het kernenmonster ontving het mengsel dat zowel nieuw als LOR 4 88 bevatte. Het negatieve controlemonster ontving een mengsel dat alleen het secundaire antilichaam LOR 4 88 bevatte, terwijl geen immunokleuring werd toegevoegd aan het ongekleurde controlemonster.
Vervolgens brengt u de monsters over naar de coldron en draait u ze 45 minuten in het donker. Nu dat de 45 minuten incubatie voltooid is, zal ik de monsters naar de flowcytometriekernfaciliteit van de University of Massachusetts Medical School brengen om enkele fluorescentie-geactiveerde sorteringen uit te voeren. Tijdens het transport naar de kernfaciliteit moeten de monsters op ijs en in het donker worden bewaard. In de flowcytometriekernfaciliteit worden de monsters eerst gefilterd door een 40 micron filter en vervolgens gedurende enkele minuten door het instrument geleid terwijl ze koud worden gehouden.
Dit wordt gedaan om voorafgaand aan de sorteervoorbereidingen enkele voorlopige gegevens te verkrijgen. De ongekleurde controle stelt de mate van negatieve fluorescentie vast. Op basis van deze informatie past u de machinesensitiviteit aan op fluorescentie.
De gekleurde controle wordt gebruikt om flu te besturen. Eventuele achtergrondruis als gevolg van uit fluorescentie wordt op dit punt ingesteld en de juiste poorten voor het sorteren worden ingesteld. Er worden verschillende poorten gebruikt om monsters te sorteren.
Hier is enkele typische gegevens voor de eerste poort. Deze faxanalysegrafiek toont een representatief monster nadat de poort is aangepast. De eerste poort herkent patronen van puin en levensvatbare kernen op basis van een combinatie van instellingen zoals fluorescentie en algemene visuele ervaring.
De x-as vertegenwoordigt voorwaartse verstrooiing, die over
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het isoleren van neuronale kernen uit postmortem menselijk hersenweefsel, waarbij de uitdagingen worden aangepakt die worden gesteld door cellulaire heterogeniteit in hersenonderzoek. De methode maakt het mogelijk om chromatine-DNA-interacties te bestuderen die neuronale genexpressie reguleren.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Epigenetica
- Celbiologie
Achtergrond
- Hersenweefsel bevat een mix van neuronen en niet-neuronale cellen.
- De meeste tests hebben niet de resolutie om epigenetische markeringen op single-celniveau te bestuderen.
- Het isoleren van pure neuronale kernen is cruciaal voor het begrijpen van genexpressie.
- Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor het bereiken van deze isolatie.
Doel van het onderzoek
- Om een zuivere populatie van neuronale kernen uit menselijk hersenweefsel te verkrijgen.
- Om het onderzoek naar chromatine-interacties in neuronen te vergemakkelijken.
- Om het begrip van neuronale-specifieke genexpressiemechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Homogenisatie van postmortem menselijk hersenweefsel.
- Isolering van totale kernen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
- Labeling van kernen met neuron-specifieke antilichamen.
- Flowmetrisch sorteren en ultracentrifugatie voor concentratie.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een betrouwbaar protocol voor neuronale kernisolatie vastgesteld.
- De methode maakt het mogelijk om chromatine-interacties in neuronen te bestuderen.
- Mogelijke toepassingen in het begrijpen van genexpressie in neurologisch onderzoek.
- Verbeterde resolutie bij het bestuderen van epigenetische markeringen in hersenweefsel.
Conclusies
- Het protocol verbetert de mogelijkheid om neuronale kernen specifiek te bestuderen.
- Het gaat de beperkingen aan die worden gesteld door cellulaire heterogeniteit in hersenweefsel.
- Deze methode kan onderzoek naar neuronale genexpressie en epigenetica bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating pure neuronal nuclei from heterogeneous brain tissue enables precise interrogation of chromatin dynamics and gene regulation mechanisms in neurons, addressing a critical limitation in neuropsychiatric and neurodegenerative target validation. This approach supports mechanistic de-risking by providing a disease-relevant system for epigenetic assays, improving predictive confidence in early discovery stages. The method facilitates translational biomarker identification and preclinical model development by enabling downstream applications such as ChIP-seq and DNA methylation analysis in a purified neuronal context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal-specific transcriptional and epigenetic landscapes to validate disease-associated targets.
- Operational Value: Reduces confounding signals from glial and non-neuronal cells, improving target specificity and hypothesis clarity.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking chromatin states to neuronal gene expression patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neuronal nuclei for chromatin-based assays including ChIP, ATAC-seq, and methylation profiling.
- Operational Value: Standardizes input material for epigenetic screening platforms, enhancing reproducibility across campaigns.
- Scientific Value: Enables quantitative, single-nucleus resolution readouts essential for assay sensitivity and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant human neuronal system to assess target engagement and epigenetic modulation in postmortem tissue.
- Operational Value: Bridges discovery findings with preclinical validation by maintaining neuronal identity across experimental workflows.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct assessment of chromatin modifications in human neurons.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic interrogation of neuronal chromatin states prior to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal gene regulation pathways by isolating nuclei for downstream omics applications.
- Screening: Delivers standardized, purified neuronal nuclei suitable for high-content epigenetic screening assays.
- Analytics: Generates quantitative chromatin and DNA modification readouts that inform target prioritization and structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects epigenetic discoveries in human neurons to preclinical models via conserved regulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal nuclei isolation platform applicable across multiple brain regions and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing biological noise from cellular heterogeneity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of neuronal chromatin assays through standardized isolation and sorting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing mechanistic insight into neuronal target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of epigenetic and gene regulation targets with stronger human relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, epigenetics, and flow cytometry for proper execution and interpretation.
- Dependent on access to ultracentrifugation, fluorescence-activated cell sorting, and antibody validation infrastructure.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure consistency in nuclei yield and purity.
- Must account for postmortem interval and tissue preservation status when applying to diverse donor cohorts.
- Limited to unfixed tissue applications; not compatible with formalin-fixed or paraffin-embedded samples.
