Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Om de chromatinen-DNA-interacties te bestuderen die de neuronen-specifieke genexpressie in het menselijk brein reguleren, moet eerst een zuivere populatie van neuronale kernen worden verkregen. Postmortem menselijk hersenweefsel wordt gehomogeniseerd en de totale kernen worden geïsoleerd middels dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Vervolgens worden de kernen gelabeld met neuronen-specifieke antilichamen, geïsoleerd via flowmetrische sortering, en tot slot geconcentreerd met ultracentrifugatie.

Hoi, ik ben Anish Matan van het laboratorium van Dr. Sharon McBarian hier bij de afdeling psychiatrie van de University of Massachusetts Medical School. Vandaag laat ik u een procedure zien voor de isolatie van neuronale kernen uit postmortem menselijk hersenweefsel. Laten we beginnen.

Begin voor elk te sorteren kernmonster met duizend milligram bevroren postmortaal hersenweefsel. Met deze hoeveelheid kunt u ongeveer 5 miljoen neuronale kernen verkrijgen na fluorescentie-geactiveerde sortering. Om de extractie van de kernen te starten, plaatst u 250 milligram hersenweefsel in een centrifugebuis met vijf ml lysisbuffer en zet u deze op ijs.

Zodra het weefsel is ontdooid, wordt het gedurende één minuut op ijs doorgehomogeniseerd. Na homogenisatie wordt het gehomogeniseerde weefsel overgebracht naar een doorzichtige ultracentrifugebuis van 15 ml, waarna de buis op ijs wordt geplaatst. Herhaal deze homogenisatie voor het resterende weefsel.

Pipette vervolgens voorzichtig negen ml sucrose-oplossing op de bodem van de ultracentrifugebuisjes om een concentratiegradiënt op te zetten, zodat de gehomogeniseerde weefseloplossing bovenop de sucrose-oplossing komt te liggen. Weeg nu de ultracentrifugebuisjes om ervoor te zorgen dat ze tijdens de ultracentrifugatie in balans zijn. Corrigeer het gewicht indien nodig door lysebuffer aan de bovenste laag toe te voegen. Nadat de buisjes zijn gewogen, worden ze in de ultracentrifuge geplaatst met behulp van de SW 28-rotor; ultracentrifuge de monsters bij 107163,6 RCF gedurende 2,5 uur bij vier graden.

Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt de supernatant evenals de laag debris bij de concentratiegradiënt afgezogen. Wees voorzichtig om het pellet onderin de buis, waarin de kernen zich bevinden, niet te verstoren. Voeg vervolgens 500 µL 1X PBS toe aan elk pellet en laat dit 20 minuten op ijs staan.

Resuspendeer na 20 minuten de pellets door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen. De incubatie op ijs zorgt ervoor dat de pellets enigszins vanzelf oplossen, waardoor de kernen gemakkelijker te resuspenderen zijn en de stress op de kernen wordt verminderd. Breng vervolgens de resuspensie en de kernen over in centrifugebuizen van twee ml.

Combineer de nucleïnezuuroplossing uit twee van de ultracentrifugebuisjes in elk microcentrifugebuisje en plaats de monsters opnieuw op ijs. Nu de extractie van nucleïnezuur voltooid is, ga ik over naar de stap van immunokleuring om neuronale kernen te isoleren via FACSorting. Het monster dat kernen bevat, zal worden geïncubeerd met een immunokleuringsmengsel bestaande uit primaire en secundaire antilichamen, alsook blokkeringsmiddelen. Maak het immunokleuringsmengsel door 1,2 µL neuron-specifiek antilichaam NeuN toe te voegen aan 300 µL 1x PBS. Voeg vervolgens honderd µL blokkeringsmengsel toe, dat 0,5% BSA en 10% normaal konijkensereum in 1x PBS bevat.

Voeg ten slotte één microliter van het secundaire antilichaam LOR 4 88 toe. Bereid daarnaast een immunokleuring voor voor een negatieve controlemonster voor dit immunokleuringsmengsel. Weglaten van het primaire antilichaam en vervang dit door 1,2 microliter 1x PBS.

Vortex nu de immuunkleuringsmengsels en laat deze vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker incuberen terwijl de kleuringsmengsels incuberen. Bereid de controlekernmonsters voor de negatieve controle voor door 20 µL van de resuspendeerde kernen over te brengen naar een buisje van 2 ml met 980 µL 1X PBS. Bereid daarnaast een ongekleurde controle voor, die enkel de kernoplossing en PBS bevat.

Pipetteer nu 20 µL van de kernen in een andere buis en vul het volume weer aan tot 1 mL met 1X PBS. Plaats vervolgens alle monsters terug op ijs. Tegen deze tijd zijn de mengsels voor de immunokleuring klaar.

Voeg tijdens het incuberen 401 µL van het mengsel toe aan het betreffende monster. Het kernmonster ontving het mengsel dat zowel nieuw als LOR 4 88 bevat. Het negatieve controlemonster ontving een mengsel dat alleen het secundaire antilichaam LOR 4 88 bevat, terwijl er aan het ongekleurde controlemonster geen immunokleuring is toegevoegd.

Kruislingse overdracht van de monsters naar de coldron en draai deze 45 minuten lang in het donker. Nu de incubatie van 45 minuten is voltooid, breng ik de monsters naar de flowcytometrie-kernfaciliteit van de University of Massachusetts Medical School voor fluorescentie-geactiveerde sortering. Tijdens het transport naar de kernfaciliteit moeten de monsters op ijs en in het donker worden bewaard. Bij de flowcytometrie-kernfaciliteit worden de monsters eerst gefilterd door een 40 micron filter en vervolgens gedurende enkele minuten door het instrument gehaald terwijl ze koud worden gehouden.

Dit wordt gedaan om enkele voorlopige gegevens te verkrijgen vóór het sorteren. De ongekleurde controle stelt de mate van negatieve fluorescentie vast. Pas op basis van deze informatie de gevoeligheid van het apparaat voor fluorescentie aan.

De gekleurde controle wordt gebruikt om fluorescentie te controleren. Eventuele achtergrondruis door fluorescentie op dit punt stelt de juiste gates vast die nodig zijn voor sortering. Er worden verschillende gates gebruikt om monsters te sorteren.

Hier zijn enkele typische gegevens voor de eerste gate. Deze fax-analysekaart toont een representatieve steekproef nadat de gate is aangepast. De eerste gate herkent patronen van debris en levensvatige kernen op basis van een combinatie van instellingen, zoals fluorescentie en algemene visuele ervaring.

De x-as representeert de forward scatter, wat overeenkomt met de relatieve grootte, terwijl de y-as de side scatter weergeeft, wat staat voor de interne complexiteit zoals granulariteit. De eerste gate kan ook een indicatie geven van de grootte van de verschillende kernen die in ons monster zijn gevonden. Hiermee kan het debris worden gescheiden van de feitelijke kernen, en hier volgen enkele typische gegevens van de tweede gate.

Deze fax-chart toont een voorbeeld van een tweede gate, waarmee kernen individueel gesorteerd kunnen worden terwijl aggregaten worden weggeworpen. Deze gate kijkt naar verschillen in de tijd die kernen nodig hebben om door de laser te gaan. Aggregaten doen hier normaal gesproken langer over.

Deze specifieke parameter is zeer belangrijk, aangezien de inclusie van aggregaten de zuiverheid kan beïnvloeden, omdat sommige fluorescerende kernen aan niet-fluorescerende kernen gebonden kunnen zijn. Ten slotte volgen hier typische gegevens uit de derde gate. Deze gate is ingesteld op een specifieke fluorescentiegolflengte die overeenkomt met die van het fluorofoor in ons secundaire antilichaam.

In deze faxgrafiek ziet u het fluorescentieniveau langs de x-as en een dieprode kanaaldetector, PECY zeven langs de y-as. Deze dot blots bieden een beter visueel overzicht wanneer ze simpelweg worden vergeleken met een enkelkleurig histogram. Het plaatsen van SCADA maakt het mogelijk om nieuwe en positieve neuronale kernen te sorteren en te scheiden van nieuwe en negatieve niet-neuronale kernen.

Nadat alle gates zijn gekozen, worden de kernen in één XPBS gesorteerd. Zodra het volledige monster door de feitelijke sortering is gegaan, wordt de zuiverheid van de sortering gecontroleerd door een Eloqua van het gesorteerde monster door het instrument te halen. Hier is een voorbeeld van een optimaal resultaat.

Vergelijk hier het monster vóór de sortering, dat een gemengde populatie kernen bevat, met de gesorteerde Eloqua waarin de meeste negatieve kernen zijn geëlimineerd. Let op dat de zuiverheidspercentages gebaseerd zijn op het aantal events dat het monster contamineert op basis van de ingestelde gates. Houd er rekening mee dat er bij de eerste run van het monster door de machine enige bleaching kan optreden, wat kan leiden tot een verminderde intensiteit; om hiervoor te corrigeren, moeten mogelijk enkele aanpassingen worden gedaan.

Zodra het monster is gesorteerd, kan de verwerking van de kernen beginnen. Neem hiervoor 10 µL van het gesorteerde monster en voeg twee µL sucrose-oplossing, 50 µL 1 M calciumchloride en 30 µL 1 M magnesiumacetaat toe. Als er minder dan 10 µL gesorteerd monster aanwezig is, vul het volume dan aan tot 10 µL met 1X PBS of pas de hoeveelheden van de overige materialen dienovereenkomstig aan.

Keer het monster vervolgens enkele keren om en plaats het gedurende 15 minuten op ijs. Centrifugeer het monster na 15 minuten in een swing-bucket rotor bij 1 786 RCF gedurende 15 minuten bij vier graden. Aspireer na centrifugatie voorzichtig het supernatant zonder het witte pellet onderin de buis te verstoren.

Los vervolgens het pellet op in 200 µL van de passende oplossing die nodig is voor de voorafgaande experimenten. In dit geval lossen we het pellet op in downing-buffer voor het daaropvolgende chip-experiment. Resuspendeer vervolgens het pellet door middel van pipetteren.

Op dit punt kunt u de kernen overbrengen naar een kleiner buisje en dit in een vriezer van -80 °C plaatsen tot verder gebruik. Ik heb u zojuist laten zien hoe u neuronale kernen isoleert uit postmortem menselijk hersenweefsel. Met deze kernen kunt u verschillende analyses uitvoeren, zoals chromatine-immunoprecipitatie.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de monsters altijd op ijs te bewaren, aangezien de kernen niet gefixeerd zijn en kunnen degraderen bij een hoge temperatuur. Daarnaast is het belangrijk om menselijk weefsel te behandelen volgens de veiligheidsnormen voor biosafety level twee of hoger. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.