Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit
3 oktober 2008
We ontwikkelden de Visual-Motor Reactie op het motorvermogen van larvale zebravis kwantificeren in reactie op licht stappen en verlaagt. We hebben ook onderzocht zebravis visie mutanten, waaronder de no optokinetische reactie (NRC) mutanten, waarvan gedacht werd dat volledig blind wanneer het wordt getest door een andere visie assay, de optokinetische reflex.
In het Dowling-lab bestuderen we de fysiologie en ontwikkeling van het netvlies bij zebravissen om vast te stellen of zebravismutanten die geen beweging kunnen detecteren, wel licht kunnen waarnemen en dus niet blind zijn. Om dit te onderzoeken, testen we hun visuele motorische respons of VMR. We verzamelen de zebravissen ongeveer vier dagen na de bevruchting.
Plaats ze in 96-wellplaten, bereid een geschikte imaging-opstelling voor, lijn de videotrackingsoftware uit met de plaat en track vervolgens de motorische respons van de vissen na overgangen van licht naar donker of van donker naar licht, wat we de VMR noemen. Hallo, ik ben Farida Imran van het laboratorium van John Dowling en de afdeling Molecular and Cellular Biology aan de Harvard University.
En ik ben Jason Rio. Ik kom uit het laboratorium van Alexander Shear, eveneens onderdeel van de afdeling moleculaire en cellulaire biologie aan de Harvard University. Vandaag laten we u de visuele motorische respons bij zebravissen op toenames en afnames van licht zien.
Laten we beginnen. Om de assay voor de visuele motorische respons te starten, kweekt u eerst wild-type zebravislarven onder een licht-donkercyclus bij 28 °C tot ten minste vier dagen na bevruchting. Voor de beste gedragsresultaten hanteren wij gewoonlijk een licht-donkercyclus van 14 uur licht vanaf 9:00 uur en 10 uur donker vanaf 23:00 uur.
Voorkom overbevolking van de larven. Gewoonlijk houden we niet meer dan 50 larven in een enkele Petrischaal. Vijf dagen na de bevruchting brengen we de zebravissen over naar een 96-wells plaat met een welvolume van 650 µL om de larven voldoende zwemruimte te bieden.
Breng met een plastic transferpipet voorzichtig één larve per putje over. Nadat de vissen in de putjes zijn overgebracht, vult u elk putje met voldoende viswater zodat het wateroppervlak bijna gelijk ligt met de bovenkant van de putjes. Let erop dat de putjes niet te vol of te weinig worden gevuld om optische problemen voor de opnamecamera te voorkomen.
Zorg er daarnaast voor dat er geen luchtbellen in de wells terechtkomen. De vissen zijn nu klaar om te worden gemonitord op hun locomotorische reacties op licht en donker. Laten we de in de plaat geplaatste zebravissen naar het registratieapparaat brengen.
Laten we beginnen met een overzicht van de opnameapparatuur. De 96-wells plaat met de vissen wordt in de opnamekamer geplaatst, hier in deze witte tray, en op zijn plaats gehouden met een veer of elastiek. De camera is achterin de box geplaatst en is via spiegels aan de bovenkant van de box, hier gelokaliseerd, op de plaat gefocust.
De hoek van deze spiegels kan worden aangepast door aan de schroeven te draaien die de spiegels op hun plaats houden. De opnamekamer wordt van onderaf verlicht door infrarode LED's. Hierdoor kan de camera de vissen zelfs in het donker vastleggen.
De larven kunnen IR-licht niet detecteren, waardoor deze constante IR-verlichting het experiment niet beïnvloedt. Witte LED's verlichten de opnamekamer daarnaast van onderaf. Deze worden apart van de IR-lampen aangestuurd voor experimenten die langer dan enkele uren duren.
De kamer kan worden gevuld met zacht stromend water om te helpen een constante temperatuur te handhaven gedurende de duur van het experiment. Het water wordt vanuit een reservoir gepompt door een kleine aquariumpomp en wordt verwarmd tot 28 °C met een typische onderwaterverwarmer voor aquaria. Het water loopt weg via een groot afvoergat en wordt teruggevoerd naar het reservoir om storende trillingen vanuit de ruimte te minimaliseren.
De gehele registratie-eenheid staat op een zware balans-tafel. Wanneer het registratieapparaat gereed is, wordt een doosdeksel gebruikt om de dieren af te dekken en hen verder te isoleren van het licht. Laten we nu overgaan tot de uitlijning van de 96.
Plaats eerst de 96-wells plaat met de vissen in de opnamekamer, waarbij het computergrid van de videotracking-software wordt gebruikt. Wanneer een waterbad wordt gebruikt voor langetermijnexperimenten, plaats de plaat dan langzaam in het water, zodat het waterniveau zich kan aanpassen zonder over de plaat te lekken. Controleer in de ViewPoint videotracking-software of alle larven en het experiment zichtbaar zijn op het computerscherm.
Lijn met de bedieningselementen van de software het raster van de videotracking-software uit met de putjes van de 96-wells plaat, zodanig dat elke vis zich binnen een vierkant van het raster bevindt. Deze stap is zeer belangrijk voor al uw opnames. De trackingcomputer zal de beweging voor elk van deze vakken afzonderlijk berekenen.
Als het computernetwerk niet correct is uitgelijnd, kunnen sommige visbewegingen verloren gaan of, erger nog, twee aangrenzende vissen kunnen hetzelfde gebied innemen en na de uitlijning als één vis worden geteld. De timing voor het aan- en uitschakelen van de lampen is in de computer geprogrammeerd.
Gewoonlijk laten we de larven drie uur lang wennen aan een lichtere donkeradaptatie in de box. Dit dient niet alleen om een baseline-activiteitsniveau vast te stellen, maar geeft de larven ook de gelegenheid om tot rust te komen na het pipetteren en hanteren. Vervolgens sluiten we de deur van onze opnamekamer en starten we de opname.
In de praktijk registreren we de activiteit van elke vis per seconde, maar de ViewPoint-software registreert in feite de data frame voor frame. Hieronder op het scherm ziet u een realtime spoor van één enkele vis. Wat betreft de pixelbeweging geeft de witte lijn aan dat het aantal pixelwijzigingen onder een ingestelde drempelwaarde ligt en de groene lijn geeft aan dat de pixelwijziging boven de drempelinstelling ligt.
De drempelwaarde zal enigszins afhangen van uw specifieke camera- en lichtopstelling. Voor onze opstelling gebruiken we doorgaans een drempelwaarde van vier pixels. Dat wil zeggen dat wanneer er minder dan vier pixels veranderen, dit als achtergrond wordt beschouwd.
Als meer dan vier pixels bewegen, duidt dit erop dat de vis in beweging is. We hebben empirisch vastgesteld dat deze drempelwaarde bijna alle zwembewegingen en draaibewegingen van de larven detecteert. Hoewel de opnamebakken de larven vrij goed isoleren, doen we toch het licht in de kamer uit en zorgen we ervoor dat onderbrekingen door mechanisch geluid worden geminimaliseerd, zoals het openen en sluiten van deuren in de kamer, het organiseren van een danceparty of het uitvoeren van onze fitnessroutines.
Nadat het experiment is voltooid, draagt u de verzamelde gegevens over naar een Excel-blad of naar uw favoriete analysepakket. Dit is hoe de gegevens eruitzien. Ze bevatten de tijd en seconden vanaf het begin van het experiment en de activiteit van elke larve per seconde.
Hier is een grafiek die de activiteit van één enkel larve over de gehele duur van het experiment laat zien, waarbij verschillende 'aan'- en 'uit'-responsen door de pijlen in de grafiek worden aangegeven. Deze grafiek toont de gemiddelde activiteit van 40 vissen over de gehele duur van het experiment, met verschillende 'aan'- en 'uit'-responsen zoals aangegeven door de pijlen. Zoals u kunt zien, zijn de 'aan'- en 'uit'-responsen prominent en consistent.
Dit experiment naar de visuele motorische respons kan ook worden uitgevoerd op mutante vissen. Voor deze studies plaatsen we doorgaans wild-type vissen en mutante vissen in een dambordpatroon op dezelfde plaat voor optimale controle. Let erop dat u noteert welk type vis in elke put is geplaatst wanneer u mutante vissen op dezelfde plaat als wild-type vissen gebruikt.
Hier is een suggestie over hoe u bij kunt houden welke vissen in elk putje zijn geplaatst. Hier zijn de resultaten van de visuele motorische respons, waarin wild-type en mutante larven worden vergeleken. Opnieuw zien we de prominente en consistente aan- en uitresponsen van wild-type larven.
De chalk-mutantlarven, waaraan oogontwikkeling ontbreekt, vertonen echter geen significante toename in activiteit bij zowel toenames als afnames van het licht en hebben een laag basisniveau van activiteit. Deze resultaten vergelijken wildtype-responsen met de NO OKR-mutanten, ook wel NRC-mutanten genoemd. Op basis van de OKR-test werd aangenomen dat de NRC-mutant volledig blind was.
Met behulp van de VMR-test tonen we aan dat de NRC-mutant een normale 'off'-respons heeft en een vertraagde en trage 'on'-respons. De NRC-mutant is dus niet volledig blind, zoals voorheen werd gedacht. We hebben zojuist de visuele motorische respons van zebrafish labate op toenames en afnames van licht laten zien.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het experiment overdag moet worden uitgevoerd, aangezien vissen overdag actiever zijn en gevoeliger reageren op veranderingen in lichtintensiteit dan tijdens de nacht. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de visueel-motorische respons (VMR) van zebravislarven op lichtveranderingen, met een specifieke focus op visuele mutanten. Het onderzoek is erop gericht de visuele vermogens van zebravismutanten te verduidelijken die voorheen als blind werden beschouwd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsbiologie
- Visuele Wetenschappen
Achtergrond
- Zebravisjes worden veelvuldig gebruikt in visonderzoek vanwege hun transparante embryo's en snelle ontwikkeling.
- Inzicht in de visuele respons bij zebravisjes kan leiden tot een beter begrip van het gezichtsvermogen bij gewervelden.
- Eerdere studies suggereerden dat bepaalde zebravismutanten geen vermogen hebben om beweging waar te nemen.
- De visueel-motorische respons (VMR) is een essentiële assay voor het beoordelen van visuele vermogens.
Doel van de studie
- Om de motorische output van zebravissenlarven te kwantificeren als reactie op toenames en afnames van licht.
- Om de visuele vermogens van zebravismutanten te evalueren, specifiek de mutanten zonder optokinetische respons (nrc).
- Om vast te stellen of deze mutanten licht kunnen detecteren, ondanks dat ze in andere assays als blind zijn geclassificeerd.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van zebravissen vier dagen na bevruchting.
- Gebruik van 96-wells platen voor het volgen van motorische reacties.
- Implementatie van videotrackingsoftware voor het analyseren van VMR.
- Beoordeling van motorische reacties na overgangen tussen licht en donker.
Belangrijkste resultaten
- De VMR-assay kwantificeert succesvol de motorische output van zebravissen als reactie op lichtveranderingen.
- Bevindingen wijzen erop dat nrc-mutanten mogelijk niet volledig blind zijn, zoals voorheen werd gedacht.
- De studie biedt nieuwe inzichten in de visuele vermogens van gemuteerde zebravissen.
- De resultaten suggereren potentie voor verder onderzoek naar de mechanismen van het gezichtsvermogen bij vertebraten.
Conclusies
- De VMR is een effectief instrument voor het beoordelen van visuele reacties bij zebravisjes.
- Verder onderzoek is gerechtvaardigd om de visuele vermogens van andere zebravismutanten te verkennen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van het gezichtsvermogen en de onderliggende mechanismen bij gewervelden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De visual motor response (VMR)-assay biedt een kwantitatieve high-throughput methode om lichtintensiteitsgestuurde gedragsreacties in zebravislarven te beoordelen, wat mechanistische risicoreductie van doelwitten in het visuele pad mogelijk maakt tijdens de vroege ontdekkingsfase. Door onderscheid te maken tussen bewegingsafhankelijke en lichtafhankelijke visuele functies, ondersteunt de assay doelwitvalidatie en fenotypische screening van verbindingen die fototransductie of retinale signalering moduleren. De automatisering en compatibiliteit met 96-wells formaten verbeteren de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor preklinische triage van doelwitten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door onderscheid te maken tussen de paden voor bewegingsvisie (OKR) en lichtintensiteitsvisie (VMR) bij zebravissen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie van fototransductiegenen mogelijk door locomotorische read-outs te gebruiken als proxies voor visuele responsiviteit.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door mutanten te identificeren met residuele lichtdetectie ondanks blindheid in bewegingsgebaseerde assays, waardoor fout-negatieve conclusies over targets worden verminderd.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op high-throughput screening van verbindingen die invloed hebben op lichtgestuurde gedragsresponsen.
- Kwantitatieve output: Genereert locomotorische activiteitsgegevens met een resolutie van een seconde, waardoor dosis-responsanalyse en EC50-bepaling mogelijk zijn.
- Herbruikbaarheid van het platform: Geautomatiseerde videotracking in 96-wells platen maakt schaalbare screening mogelijk over genetische of chemische bibliotheken met minimale variabiliteit tussen de wells.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert aangeborene visuele beperkingen waarbij de retinale ontwikkeling intact is maar de dynamiek van de lichtrespons is gewijzigd, wat relevant is voor retinale dystrofieën.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen gedragsfenotypen bij zebravis en assays voor visuele functies bij zoogdieren via geconserveerde fototransductiemechanismen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt vroege detectie mogelijk van verbindingen die de responsiviteit bij lichtinstelling herstellen in nrc-mutanten, wat go/no-go-beslissingen ondersteunt bij preklinische visuele therapieën.
Integratie van Pipeline & Workflow
De VMR-assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor modulatoren van de visuele route, door een functionele in vivo readout van de retinale lichtgevoeligheid te bieden voorafgaand aan preklinische werkzaamheidsstudies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van genen die betrokken zijn bij lichtdetectie, onafhankelijk van bewegingsvisie, waardoor het werkingsmechanisme in visuele signaleringspaden wordt verduidelijkt.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare locomotorische output van zebravissen die geschikt is voor het screenen van bibliotheken gericht op fototransductie of circadiane lichtrespons.
- Analytics: Biedt tijdopgeloste activiteitsmetingen (kinetiek van de ON/OFF-respons, piekamplitude, terugkeer naar baseline), wat vergelijkende analyse tussen genotypen of behandelcondities mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt VMR-fenotypen in zebravislarven met preklinische modellen van retinale functie waarbij de verwerking van lichtinput is aangetast.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar, geautomatiseerd gedragsplatform voor projectoverschrijdende evaluatie van modulatoren van het visuele systeem binnen verschillende therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanische ambiguïteit tussen bewegings- en lichtvisiepaden op te lossen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via geautomatiseerde videotrackings en gecontroleerde omgevingscondities (28°C, IR-verlichting).
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door verbindingen te identificeren die lichtresponsief gedrag moduleren, waardoor faalpercentages in een laat stadium bij visuele therapieën worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van functioneel visueel herstel in blindheidsmodellen, wat de kapitaalallocatie in neurowetenschappelijke portfolio's verbetert.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de houderij van zebravissen, ontwikkelingsstadia en het ontwerp van gedragstests.
- Afhankelijk van videotrackingsoftware, beeldsystemen met infraroodcapaciteit en programmeerbare hardware voor lichtregeling.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor het laden van well-plates, drempelinstellingen en de timing van lichtovergangen voor reproduceerbaarheid tussen laboratoria.
- Moet rekening houden met circadiane invloeden, aangezien de responsiviteit van larven op lichtveranderingen varieert per tijdstip van de dag.
- Beperkt tot het detecteren van grove locomotorische responsen; lost geen subcellulaire of circuit-niveau visuele verwerking op zonder aanvullende elektrofysiologie.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:15
Plating Individual Fish into a 96-well Plate
2:41
Survey of the Recording Apparatus
4:19
Alignment of the 96-well Plate with the Computer Grid of the Video-Tracking Software
6:51
Analyzing the Visual Motor Response Data
9:05
Conclusion
