Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie
2 januari 2009
Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).
Deze video demonstreert een protocol voor gemethyleerde DNA-immunoprecipitatie of meetup. Een methode die wordt gebruikt om gemethyleerd DNA op een onbevooroordeelde manier specifiek te isoleren. DNA-methylatie bij zoogdieren wordt gekenmerkt door de toevoeging van een methylgroep aan de C-vijfpositie van cytosine.
Wanneer aanwezig in een CPG-dinucleotide, is het een omkeerbare epigenetische markering die een belangrijke rol speelt in normale ontwikkeling, evenals bij verschillende ziekteprocessen. Normale functies van DNA-methylatie omvatten X-chromosoominactivatie bij vrouwen, herhaalde elementen silencing, genomische imprinting en het behoud van genomische stabiliteit. DNA-methylatie is ook aangetoond om een rol te spelen bij tal van ziekten zoals kanker, het syndroom van der Willi, engelman-syndroom en immunodeficiëntie, centri merische instabiliteit en syndroom van afwijkingen in het gezicht.
Bij kankers, bijvoorbeeld, kunnen abnormale hypermethylering en promotors resulteren in het onderdrukken van vitale tumorsuppressorgenen. Onjuiste hypomethylering resulteert in chromosomale instabiliteit en oncogene activatie. Meetup wordt bereikt door DNA eerst te soniceren tot fragmenten met een grootte van 300 tot 1000 basenparen. Het gesoniceerde DNA wordt vervolgens gedenatureerd bij 95 graden Celsius.
Primaire antilichamen, die vijf prime methazijn herkennen, worden toegevoegd en gebonden aan gemethyleerde DNA-fragmenten. Secundaire antilichamen, geconjugeerd aan magnetische dyna-beads, worden gebruikt om fragmenten van DNA te isoleren die zijn gebonden door het primaire antilichaam. Ongemethyleerde fragmenten worden verwijderd en de antilichamen worden verteerd door proteïnase.
KA fenyl chloroform schoonmaak verwijdert het verteerde eiwit en precipitatie zuivert het DNA, dat nu verrijkt is met gemethyleerde fragmenten. Meetup, DNA kan worden gebruikt voor toepassingen zoals PCR-microarray en sequencing. Meetup wordt over het algemeen uitgevoerd als een tweedaagse procedure.
Dag één omvat DNA-voorbereiding, sonicatie, immunoprecipitatie en eiwitvertering. Dag twee omvat pH-chloroformextractie en ethanolprecipitatie om het DNA te zuiveren en het voor methylering verrijkte DNA te isoleren. Er zijn enkele speciale materialen die vereist zijn voor meetup, waaronder gesiliconiseerde centrifugeerbuisjes, een DNA-sonaticatieapparaat, primaire antilichamen, anti-vijf prime methazijn muis, monoklonaal antilichaam, secundair antilichaam, dyna-beads, geconjugeerd aan schapen, anti-US IgG en een magnetische buisjesstandaard.
De eerste stap in het meetup-protocol is de voorbereiding van DNA. Het is onmisbaar om de aard van het DNA van tevoren te beoordelen. Het kennen van de toestand van het monster-DNA, of het voornamelijk dubbel- of enkelstrengs is, is vereist, aangezien nauwkeurige kwantificering van het monster van het grootste belang is en verschillende methoden voor het bepalen van DNA-hoeveelheid kunnen nadelig worden beïnvloed door de aanwezigheid van ongewenste DNA-soorten.
De hoeveelheid dubbelstrengs DNA kan eenvoudig worden bepaald met behulp van spectrale fotometrie met behulp van een NanoDrop 3, 300 nd laad 1,5 microliter en stel het meettype in op nucleïnezuur, selecteer DNA 50 als de berekening en initialiseer het instrument met 1,5 microliter water. Reinig de voetplaten en blancheer het instrument met 1,5 microliter van de vloeistof. Het monster wordt opgelost in de voetplaten, laad 1,5 microliter van het monster en druk op meten.
De concentratie wordt gegeven en kan worden gebruikt. Om het aantal microliters te berekenen dat nodig is voor mij, dompel een A twee 60 tot twee 80 verhouding van 1,8 is hier ideaal. Een monster van één microgram wordt bereid.
Echter, een monster van slechts 200 nanogram is voldoende om succesvolle resultaten te verkrijgen. Voor meetup, laad het DNA-monster in een schone, gesiliconiseerde buis. Voeg voldoende steriele water toe om het eindvolume tot 50 microliter te brengen.
DNA-sonaticatie en immunoprecipitatie moeten worden uitgevoerd in gesiliconiseerde buisjes om niet-specifieke binding van DNA en eiwitten aan buiswanden te voorkomen. Zodra het DNA is voorbereid, moet het monster worden gesonaticeerd. Sonaticatie is vereist om het DNA te fragmenteren, aangezien immunoprecipitatie efficiënter is met kleinere DNA-fragmenten. Laad het monster in de sonatice, zorg ervoor dat de vermogensinstelling op hoog staat en dat de machine is ingesteld op 30 seconden. 30 seconden uit, vul de basis met vier graden Celsius water tot aan de vullijn.
Soniceer het monster gedurende zeven minuten. Wanneer de sonaticatie is voltooid, verwijder de buis en plaats deze op ijs. Het is belangrijk om de sonaticatievoorwaarden voor uw verwachte monster, DNA-grootte van tevoren te optimaliseren.
Een gedeeltelijk gedegradeerd DNA-monster vereist bijvoorbeeld een kortere sonaticatietijd. Sonaticatieproducten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van standaard elektroforetische technieken. DNA-fragmenten met een grootte van 300 tot 1000 basenparen zijn op dit punt gewenst voor later gebruik.
In microarray- en PCR-assays zou u een vijfde van uw DNA moeten reserveren om als invoer- of referentie-DNA te dienen. In dit geval zal 800 nanogram gesoniceerd DNA worden gebruikt voor de immunoprecipitatie en de rest zal worden opzij gezet als referentie-DNA. De volgende stap in het mediaprotocol is de immunoprecipitatie of IP-reactie. Voorafgaand aan de toevoeging van het primaire antilichaam, moet het DNA worden gedenatureerd. Denaturatie is vereist omdat het primaire antilichaam gevoelig is voor enkelstrengs DNA.
Plaats het monster in een waterbad van 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Wanneer de denaturatiestap voltooid is, plaatst u de buis onmiddellijk in ijs gedurende ten minste vijf minuten. Dit voorkomt dat het gedenatureerde DNA opnieuw kneedt en zorgt voor optimale antilichaambinding wanneer het monster is afgekoeld.
Draai de buis kort door om de inhoud naar de bodem te trekken. Vervolgens moet het primaire antilichaam worden toegevoegd. De hoeveelheid gebruikt antilichaam moet voor elke batch en voor elke fabrikant worden getitreerd.
In dit geval voegen we vijf microgram primaire antilichaam toe en voegen ver
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een protocol voor gemethyleerde DNA-immunoprecipitatie (MeDIP), een methode die wordt gebruikt om specifiek gemethyleerd DNA op een onbevooroordeelde manier te isoleren. DNA-methylering speelt een cruciale rol bij de normale ontwikkeling en diverse ziekteprocessen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Epigenetica
Achtergrond
- DNA-methylering omvat de toevoeging van een methylgroep aan de C5-positie van cytosine.
- Het dient als een omkeerbare epigenetische markering, in het bijzonder in CpG-dinucleotiden.
- Deze modificatie is essentieel voor processen zoals X-chromosoominactivatie en genomische imprinting.
- Abnormale DNA-methylering is gekoppeld aan ziekten zoals kanker en diverse syndromen.
Doel van de studie
- Om het MeDIP-protocol voor het isoleren van gemethyleerd DNA te demonstreren.
- Om het belang van DNA-methylering bij ontwikkeling en ziekte te benadrukken.
- Om een uitgebreid begrip te verschaffen van de methodologie die bij MeDIP komt kijken.
Gebruikte methoden
- Gebruik van antilichamen die specifiek zijn voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).
- Tweedagige procedure voor de selectieve extractie van gemethyleerde DNA-fragmenten.
- Isolatie van genomische DNA-monsters.
- Onbevooroordeelde aanpak voor het bestuderen van DNA-methylering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van gemethyleerde DNA-fragmenten.
- Demonstratie van de effectiviteit van het MeDIP-protocol.
- Inzichten in de rol van DNA-methylering in diverse biologische processen.
- Potentiële toepassingen bij het begrijpen van ziektemechanismen.
Conclusies
- MeDIP is een waardevolle techniek voor het bestuderen van DNA-methylering.
- Het begrijpen van methyleringspatronen kan bijdragen aan ziekteonderzoek.
- Het protocol kan worden toegepast op diverse genomische studies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) maakt onbevooroordeelde verrijking van gemethyleerde DNA-fragmenten mogelijk, wat epigenetische doelwitvalidatie in ontdekkingsonderzoek ondersteunt. Door ziekte-geassocieerde methyleringspatronen te isoleren, biedt MeDIP mechanistische inzichten die therapeutische hypothesetesten en biomarker-afstemming informeren. Deze mogelijkheid versterkt de preklinische risicoreductie door epigenetische veranderingen te koppelen aan ziektemechanismen zoals kanker en ontwikkelingsstoornissen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om epigenetische modificaties te onderzoeken om de functionele rollen van gemethyleerde loci in genregulatie te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door gemethyleerd DNA te isoleren voor functionele validatie in vervolgstappen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door de methyleringsstatus te correleren met ziektefenotypes in preklinische modellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert verrijkt gemethyleerd DNA voor locus-specifieke of genoombrede methyleringsprofilering via PCR, microarray of sequencing.
- Operationele waarde: Standardiseert het inputmateriaal voor reproduceerbare epigenetische screeningcampagnes.
- Schaalbaarheid: Compatibel met downstream-applicaties zoals genexpressieprofilering en array CGH voor geïntegreerde multi-omics analyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt ziekterelateerde systeemmodellering mogelijk door het profileren van aberrante methylering bij kanker en syndromen.
- Operationele waarde: Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via methyleringsspecifieke biomarkers.
- Risicobeperking: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door het identificeren van epigenetische drivers van pathogenese.
Integratie van Pipeline & Workflow
MeDIP past binnen het continuüm van ontdekking, van doelwithypothese tot leadidentificatie, en biedt epigenetische inzichten die de selectie en validatie van targets informeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door gemethyleerd DNA te isoleren om epigenetische bijdragen aan gen-silencing of activering te beoordelen.
- Screening: Maakt assay-klaar materiaal mogelijk voor methyleringsprofilering met kwantitatieve output die geschikt is voor hit-triage.
- Analytics: Levert verrijkt specifiek DNA voor kwantitatieve methyleringsanalyse, wat vergelijking van condities in epigenetische screens mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via methyleringsbiomarkers die zijn afgestemd op ziektemechanismen.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar epigenetisch bemonsteringsinstrument voor meerdere projecten en ziektebeelden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanistische risicoreductie van epigenetische mechanismen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de isolatie van gemethyleerd DNA.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen via de integratie van epigenetische biomarkers en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van ziekterelatie gestuurd door methylering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in epigenetica, immunoprecipitatie en de omgang met nucleïnezuren.
- Afhankelijk van sonicatie-apparatuur, magnetische scheidingsinstrumenten en thermocyclussystemen.
- Vereist gestandaardiseerde IP-buffercondities en antilichaamvalidatie tussen verschillende batches.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten de kwaliteit van de DNA-input, optimalisatie van de fragmentgrootte en soortspecifieke methyleringspatronen.
- Praktische beperkingen omvatten bias in antilichaamspecificiteit en onvolledige denaturatie die de verrijkingsefficiëntie beïnvloedt.
