Name: Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Leer hoe je methyleringspatronen in DNA analyseert met MeDIP voor epigenetisch onderzoek. Deze methode isoleert methylated DNA fragmenten met anti-5mC antilichamen en magnetische beads.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen de leden van de Brown en Lam laboratoria bedanken voor hun deelname aan bekritiseren deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research en de Michael Smith Foundation for Health Research.

DNA-extractie en monstervoorbereiding DNA uit een verscheidenheid van verschillende monsters (gekweekte cellen, vers ingevroren en in formaline gefixeerde paraffine ingebedde weefsels) kan worden gebruikt voor MeDIP. Het is belangrijk om in hoge mate gezuiverd DNA te gebruiken zonder bijbehorende eiwitten zoals histonen. Het is ook belangrijk om zo veel RNA te verwijderen als mogelijk uit de steekproef, als het kan interfereren met zowel DNA kwantificatie en antilichaam bindend. De hoeveelheid DNA gebruikt voor MeDIP kan variëren van 200 ng tot 1 ug, afhankelijk van de hoeveelheid DNA beschikbaar. Om aan te tonen dit protocol, zal 1 ug DNA worden gebruikt. Het volgende protocol zal van hoge kwaliteit dubbelstrengs DNA van gekweekte cellen. Andere protocollen moeten worden gebruikt voor extractie van DNA van andere soorten monsters. <ol><li> Voeg 400 ul van de spijsvertering buffer naar een cel pellet in een 1,7 ml Eppendorf buis. </li><li> Voeg 100 ug van proteïnase K aan de buis, en &#39;s nachts bij 50 ° C. incubeer </li><li> Voeg 500 ul fenol pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Herhaal stap 3 tot en met 5 keer. </li><li> Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Voeg 40 ug van RNase A en incubeer 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Voeg 500 ul fenol pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Herhaal de stappen 11 tot en met 13 keer. </li><li> Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Voeg 1/10e volume 3 M natriumacetaat (40 pl) en meng goed. </li><li> Voeg 2 volumes (900 pl) van 100% ethanol, goed mengen en plaats bij -20 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol. </li><li> Voeg 500 ul koude 70% ethanol te wassen. Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder 70% ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol door pipetteren. </li><li> De lucht droog de pellet met de kap open voor 10 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van de resterende ethanol te verwijderen. </li><li> Resuspendeer DNA in 50 ul van gesteriliseerde dH2O overnacht bij 4 ° C. </li><li> Kwantificeren van het DNA met behulp van een NanoDrop spectrofotometer. Een A-260: Een 280-verhouding van 1,8 is ideaal. </li><li> Bepaal DNA kwaliteit en grootte bereik op een agarose gel met 100 bp ladder. Zo weinig als 10 ng genomisch DNA kan worden uitgevoerd op een 1,7% agarosegel, gevolgd door kleuring met behulp van een kleurstof die zeer gevoelig is voor kleine hoeveelheden DNA, zoals SYBR Gold. </li><li> In een gesiliconiseerde tube per monster, 1 ug van DNA in een totaal volume van 50 ui met de rest van het volume uit met gesteriliseerd dH 2 O. </li></ol> DNA ultrasoonapparaat DNA sonicatie en het MeDIP het protocol moet worden uitgevoerd in siliconzied-buizen niet specifiek binden van proteïnen aan buiswanden te voorkomen. Optimale sonicatie tijden voor de DNA-monsters zijn gebaseerd op de mate van fragmentatie DNA-monster als bepaald met behulp van gel elektroforese (stap 27). Bijvoorbeeld, moet DNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen van een zeer hoog moleculair gewicht, en zal vervolgens vereisen meer duurt dan DNA geëxtraheerd uit archiefmateriaal monsters, die vaak gedeeltelijk afgebroken. Indien monsters zijn van uniform hoog moleculair gewicht, is het redelijk op dit punt door te gaan met de sonicatie zoals beschreven in dit protocol zonder controle van elk monster apart. Indien monsters worden versnipperd en met archiefwaarde monsters, zal het nodig zijn om de ultrasoonapparaat procedure waarschijnlijk door het verlagen van sonicatie keer om 300-100 bp fragmenten te verkrijgen aan te passen. Als u verwacht dat monsters die zijn gedeeltelijk afgebroken, de optimalisering van ultrasoonapparaat parameters kunnen worden uitgevoerd op een representatieve steekproef van die van belang proces. Gebaseerd op de mate van DNA-fragmentatie waargenomen van gelelektroforese (stap 27), kan de onderzoeker vooruit op de optimale sonicatie tijd voor het monster. Hier beschrijven we een methode om 300-1000 bp DNA-fragmenten verkrijgen door sonicatie met een geautomatiseerde sonicating apparaat (Bioruptor van Diagenode, UCD-200 TM) met een hoog moleculair gewicht DNA. <ol><li> Water in Biorupter moet op 4 ° C. </li><li> Sonificeer 7 minuten op de automatische instellingen (30 sec op 30 seconden uit op maximaal vermogen). </li><li> Verwijder de 800 ng (40 ul) van gesoniceerd product en plaats in gesiliconiseerde 1,7 ml centrifugebuis voor de immunoprecipitatie (IP) reactie. </li><li> Gereserveerd resterende 200 ng (10 ul) om te dienen als input (IN) referentie-DNA (bewaren bij 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON van gemethyleerde DNA <ol><li> Denaturatie van de DNA dat zal voor IP-reactie (800 ng) worden gebruikt bij 95 ° C gedurende 10 minuten in een waterbad. </li><li> Koel onmiddellijk op ijs. Volledig te laten afkoelen DNA (ongeveer 5 minuten op het ijs) voordat u verder gaat met de volgende stap. </li><li> Voeg 5 ug monoklonaal antilichaam. </li><li> Voeg IP-buffer (gebruikt bij kamertemperatuur in dit protocol) tot een eindvolume van 500 pi. </li><li> Incubeer 2 uur bij 4 ° C in roterende buis houder. </li><li> Vlak voordat stap 5 is voltooid, voor te bereiden Dynabeads door wassen (Steps 6-11). Eerst grondig resuspendeer de kralen in de flacon door vortexen. </li><li> Transfer 30 pl (~ 2 x 10 7) van de geresuspendeerde Dynabeads per reactie plus 1, in een nieuwe gesiliconiseerde buis (bijvoorbeeld als het doen 8 reacties, genoeg parels te verwijderen voor 9, dat wil zeggen 270 pi). </li><li> Plaats de buis op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipet uit de bovendrijvende. Bij het verwijderen van supernatant, vermijd contact met de kralen tegen binnenwand (waar de kralen te trekken naar de magneet) met de pipetpunt. </li><li> Haal de buis van de magneet, en resuspendeer de kralen in een overmaat volume van IP-buffer (750 ul-1000 pi). Plaats de buis terug op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Herhaal het wassen nog een keer, en dan resuspendeer de gewassen kralen in IP buffer in het oorspronkelijke volume verwijderd in stap 7. </li><li> Voeg 30 pl gewassen Dynabeads aan elk IP reactie </li><li> Incubeer in een draaiende buis houder voor 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Na incubatie is voltooid, plaatst u de buis op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipet uit de bovendrijvende. Vermijd het aanraken van de binnenwand van de buis (waar de kralen te trekken naar de magneet) met de pipetpunt. Voeg 500 ul van IP-buffer. Meng de buis inhoud en zet het terug op de magnetische rek voor 2 minuten. Herhaal wassen met 500 ul IP buffer een keer. </li><li> Na het verwijderen van het supernatant van de laatste wassen, resuspendeer de kralen in 400 ul van de spijsvertering buffer. </li><li> Behandel de reactie met 100 ug van proteïnase K en &#39;s nachts bij 50 ° C. incubeer </li></ol> ZUIVERING VAN immunogeprecipiteerd DNA <ol><li> Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en vortex grondig. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Herhaal de stappen 1 tot en met 3 als de interfase tussen de waterige en organische lagen troebel. </li><li> Voeg 1 / 10 e deel 3 M natriumacetaat (40 pl) en vortex. </li><li> Voeg 1 ui van glycogeen (20 pg / pl) en vortex. </li><li> Voeg 2 volumes (1000 pl) van 100% ethanol, vortex, en plaats bij -20 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol. </li><li> Voeg 500 ul koude 70% ethanol te wassen. Vortex kort en spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder 70% ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol door pipetteren. </li><li> De lucht droog de pellet met de kap open voor 10 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van de resterende ethanol te verwijderen. </li><li> Resuspendeer DNA pellet in 10 pi gesteriliseerd dH 2 0. </li></ol> Validatie door PCR <ol><li> U kunt testen om ervoor te zorgen dat uw MeDIP procedure werkt door het uitvoeren van de MeDIP protocol met behulp van normale menselijke DNA (mannelijk of vrouwelijk), en vervolgens het testen van een regio die bekend worden verrijkt voor de methylatie. </li><li> Verwijder 30% van de MeDIP product aan PCR tube, en nog eens 30% van de MeDIP product naar een andere PCR buis. </li><li> Zet 10 ng van IN DNA in een PCR-buis, en 10 ng van IN DNA in een andere PCR-buis. Je hebt nu vier afzonderlijke PCR-reacties in te stellen. </li><li> Voer PCR met behulp van H19 en CTRL primers zoals aangegeven in tabel 1. </li><li> Bereid twee mastermixes (een voor elke primer set) voor PCR-reacties met 12,5 ui totaal volume zoals aangegeven in tabel 2. </li><li> Thermocycle de PCR met behulp van de voorwaarden vermeld in tabel 3. </li><li> Run 5 ul van PCR-producten op een 2% agarosegel voor visualisatie. </li><li> De verwachte resultaten voor een succesvolle MeDIP zijn weergegeven in tabel 4. </li></ol> Tafels Tabel 1: H19 en CTRL primers voor PCR validatie. <table border="1"><tbody><tr><td> Primer Set </td><td> Voorwaartse primer </td><td> Reverse primer </td><td> Verwachte Product Maat </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (control) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Mastermixes voor PCR-reacties. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (per Rxn) </td><td> CTRL Mix (per Rxn) </td></tr><tr><td&gt; DDH 2 O </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> 10X Buffer </td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mM elk) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mm) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Primers (H19_F / R of CTRL_F / R) (10 uM elk F / R) </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. PCR thermocyling voorwaarden. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Verwachte PCR-resultaten voor succesvolle MeDIP. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Template-DNA </td></tr><tr><td> Primer wordt gebruikt </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positief </td><td> Positief </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positief </td><td> Negatief </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
<li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+cancer+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">The history of cancer epigenetics.</a> Nature reviews. 4, 143-153 (2004).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Er is een groeiend besef van de belangrijke rol van DNA-methylatie speelt bij de ziekte, zijn daarom de ontwikkeling van assays om deze wijziging te meten steeds belangrijker 3, 12, 13. De MeDIP techniek is een hulpmiddel vatbaar voor het screenen van zowel het hele genoom en locus-specifieke niveau 6, 7. Deze techniek zorgt voor een snelle weergave van DNA-methylatie niveaus met behulp van beperkte hoeveelheden van het starten van DNA en maakt een eenvoudige vergelijkingen tussen verschillende bro...

<table><tbody><tr><td>Biorupter sonicator</td><td>Instrument</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>1.7ml SafeSeal microcentrifugebuisjes</td><td>Overig</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ND 3300 spectrophotometer</td><td>Instrument</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primair antilichaam: Anti-5&amp;rsquo;-methylcytosine muis mAb</td><td>Reagens</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam: Dynabeads M-280 schaap anti-muis IgG</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisch buisjesrek</td><td>Instrument</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Instrument</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>IP-buffer</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Bewaard bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Digestiebuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

gemethyleerd dna immunoprecipitatie

Methylated DNA Immunoprecipitation

De identificatie van DNA-methylatie patronen is een gemeenschappelijke procedure in de studie van de epigenetica, zoals methylatie is bekend dat significante effecten op de genexpressie hebben, en is betrokken bij een normale ontwikkeling en ziekte<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Zo is de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen gemethyleerd DNA en niet-gemethyleerd DNA is essentieel voor het genereren van methylatie profielen voor dergelijke studies. Gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP) is een efficiënte techniek voor de extractie van gemethyleerd DNA van een steekproef van belang<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Een monster van zo weinig als 200 ng van DNA is voldoende voor het antilichaam, of immunoprecipitatie (IP), reactie. DNA is gesoniceerd in fragmenten, variërend in grootte van 300-1000 bp, en is verdeeld in immunogeprecipiteerd (IP) en de ingang (IN) porties. IP-DNA wordt vervolgens warmte gedenatureerd en vervolgens geïncubeerd met anti-5&#39;mC, waardoor het monoklonale antilichaam om gemethyleerd DNA te binden. Na dit, zijn magnetische korrels met een secundair antilichaam met affiniteit voor het primaire antilichaam toegevoegd en geïncubeerd. Deze kraal-linked antilichamen binden het monoklonale antilichaam dat wordt gebruikt in de eerste stap. DNA gebonden aan het antilichaam complex (gemethyleerd DNA) is gescheiden van de rest van het DNA met behulp van een magneet om de complexen te trekken uit de oplossing. Enkele wasbeurten met behulp van IP-buffer worden dan uitgevoerd om de ongebonden, niet-gemethyleerd DNA te verwijderen. De gemethyleerde DNA / antilichaam complexen worden dan verteerd met proteïnase K aan de antilichamen waardoor alleen de gemethyleerd DNA intact te verteren. De verrijkte DNA wordt gezuiverd door fenol: chloroform extractie aan het eiwit materiaal te verwijderen en vervolgens geprecipiteerd en geresuspendeerd in water voor later gebruik. PCR-technieken kunnen worden gebruikt om de efficiëntie van de MeDIP te valideren door het analyseren van de amplificatieproducten van IP en in DNA voor de regio&#39;s waarvan bekend is dat het gebrek en waarvan bekend is dat gemethyleerde sequenties bevatten. Het gezuiverde gemethyleerd DNA kan vervolgens worden gebruikt voor de locus-specifieke (PCR) of genoom-brede (microarray en sequencing) methylering studies, en is vooral handig wanneer toegepast in combinatie met andere research tools zoals gen expressie profilering en array comparatieve genoom hybridisatie ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Nader onderzoek naar DNA methylatie zal leiden tot de ontdekking van nieuwe epigenetische doelstellingen, die op hun beurt, kunnen nuttig zijn bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische of prognostische onderzoek tools voor ziekten zoals kanker die gekenmerkt worden door afwijkend gemethyleerd DNA<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

De identificatie van DNA-methyleringspatronen is een veelvoorkomende procedure in de studie van de epigenetica, aangezien bekend is dat methylering significante effecten heeft op ...

Deze video demonstreert een protocol voor gemethyleerde DNA-immunoprecipitatie of MeDIP. Een methode die wordt gebruikt om op een onbevooroordeelde wijze specifiek gemethyleerd DNA te isoleren. DNA-methylering bij zoogdieren wordt gekenmerkt door de toevoeging van een methylgroep aan de C5-positie van cytosine.Wanneer het aanwezig is in een CpG-dinucleotide, is het een reversibele epigenetische markering die een belangrijke rol speelt bij de normale ontwikkeling, evenals bij verschillende ziekteprocessen. Normale functies van DNA-methylering omvatten X-chromosoom-inactivering bij vrouwtjes, het uitschakelen van repetitieve elementen, genomische imprinting en het behoud van genomische stabiliteit. DNA-methylering is bovendien aangetoond als een factor bij talrijke ziekten, zoals kanker, het syndroom van de Angelman, het syndroom van Prader-Willi en het centrumere instabiliteit- en gelaatsafwijkingssyndroom.In kankers kan bijvoorbeeld abnormale hypermethylering van promotors leiden tot het uitschakelen van vitale tumorsuppressorgenen. Terwijl onjuiste hypomethylering resulteert in chromosomale instabiliteit en activatie van oncogenen, wordt de voorbereiding voltooid door het DNA eerst via sonicatie in fragmenten te splitsen met een grootte variërend van 300 tot 1000 baseparen. Het gesoniceerde DNA wordt vervolgens gedenatureerd bij 95 °C.Primaire antilichamen, die vijf-methazine herkennen, worden toegevoegd om zich te kunnen binden aan gemethyleerde DNA-fragmenten. Secundaire antilichamen, geconjugeerd aan magnetische dyna-beads, worden gebruikt om de DNA-fragmenten te isoleren die door het primaire antilichaam zijn gebonden. Ongemethyleerde fragmenten worden verwijderd en de antilichamen worden afgebroken door proteinase.Reiniging met fenol-chloroform verwijdert het verteerde eiwit en precipitatie zuivert het DNA, dat nu is verrijkt met gemethyleerde fragmenten. Vervolgens kan het DNA worden gebruikt voor toepassingen zoals PCR-microarray en sequencing. De procedure wordt over het algemeen uitgevoerd over een periode van twee dagen.Dag één omvat de DNA-preparatie, sonicatie, immunoprecipitatie en proteïnedigestie. Dag twee omvat pH-chloroformextractie en ethanolprecipitatie om het DNA dat is verrijkt voor methylering te zuiveren en te isoleren. Er zijn enkele speciale materialen nodig voor de uitvoering, waaronder gesiliconiseerde centrifugebuisjes, een DNA-sonicatieapparaat, een primaire antilichaam, anti-5'-methylcytosine muis monoklonaal antilichaam, een secundair antilichaam, Dynabeads geconjugeerd aan schaap anti-muis IgG en een magnetisch buisjesrek.De eerste stap in het meet-up-protocol is de preparatie van DNA. Het is essentieel om vooraf de aard van het DNA te beoordelen. Kennis van de toestand van het monster-DNA, of het nu primair dubbel- of enkelstrengs is, is vereist aangezien een nauwkeurige kwantificering van het monster van het grootste belang is en verschillende methoden voor het bepalen van de DNA-hoeveelheid nadelig kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid van ongewenste DNA-soorten.De hoeveelheid dubbelstrengs DNA kan eenvoudig worden bepaald via spectrale fotometrie met een NanoDrop 3000; breng 1,5 µL aan en stel het meettype in op nucleïnezuur, selecteer DNA 50 als berekening en initialiseer het instrument met 1,5 µL water. Reinig de pedestals en nul het instrument met 1,5 µL van de vloeistof. De monsteroplossing is gereed; reinig de pedestals, breng 1,5 µL van het monster aan en druk op meten.De concentratie wordt gegeven en kan worden gebruikt. Om het aantal microliters te berekenen dat ik nodig heb, is een A$_{260}$/A$_{280}$-verhouding van 1,8 hier ideaal. Er wordt een monster van 1 µg voorbereid.Een monster van slechts 200 nanogram is echter voldoende om succesvolle resultaten te verkrijgen. Laad het DNA-monster in een schone gesiliconeerde buis. Voeg voldoende steriel water toe om het uiteindelijke volume op 50 microliters te brengen.DNA-sonificatie en immunoprecipitatie moeten worden uitgevoerd in gesiliconiseerde buisjes om aspecifieke binding van DNA en eiwitten aan de wanden van de buisjes te voorkomen. Zodra het DNA is voorbereid, moet het monster worden gesonificeerd; sonificatie is vereist om het DNA te fragmenteren, aangezien immunoprecipitatie efficiënter is met kleinere DNA-fragmenten. Plaats het monster in de sonicator, zorg dat de vermogensinstelling op hoog staat en dat de machine is ingesteld op 30 seconden aan en 30 seconden uit. Vul de basis tot aan de vullijn met water van 4 °C.Sonicate het monster gedurende zeven minuten. Wanneer de sonicatie is voltooid, neemt u de buis uit de apparaat en plaatst u deze op ijs. Het is belangrijk om de sonicatiecondities vooraf te optimaliseren voor uw verwachte monster en DNA-grootte.Een gedeeltelijk gedegradeerd DNA-monster vereist bijvoorbeeld een kortere sonicatietijd. Sonicatieproducten kunnen worden gevisualiseerd met standaard elektroforetische technieken. Op dit punt zijn DNA-fragmenten met een lengte variërend van 300 tot 1000 baseparen gewenst voor later gebruik.Bij microarray- en PCR-analyses dient u één vijfde van uw DNA te reserveren om als input- of referentiedna te dienen; in dit geval worden 800 nanogram gesoniceerd DNA gebruikt voor de immunoprecipitatie en wordt de rest apart gezet als referentiedna. De volgende stap in het mediaprotocol is de immunoprecipitatie of IP-reactie; voordat het primaire antilichaam wordt toegevoegd, moet het DNA worden gedenatureerd. Denaturatie is noodzakelijk omdat het primaire antilichaam gevoelig is voor enkelstrengs DNA.Plaats de monsterbuis 10 minuten in een waterbad van 95 °C. Zodra de denaturatiestap is voltooid, dient de buis onmiddellijk voor ten minste vijf minuten op ijs te worden geplaatst. Dit voorkomt dat het gedenatureerde DNA weer anneleert en zorgt voor een optimale antilichaambinding zodra het monster is afgekoeld.Centrifugeer de buis kort om de inhoud naar de bodem te trekken. Voeg vervolgens het primaire antilichaam toe. De hoeveelheid gebruikte antilichamen moet worden getitreerd voor elke batch en voor elke fabrikant.In dit geval voegen we vijf microgram primair antilichaam toe en voegen we vervolgens immunoprecipitatiebuffer of IP-buffer toe tot een eindvolume van 500 µL. Vervolgens wordt het IP-DNA in een rotator geplaatst en twee uur geïncubeerd bij vier °C. Rotatie is noodzakelijk om klontering van antilichamen in de buis tijdens de incubatie te voorkomen.Ongeveer 15 minuten voordat de incubatie van het primaire antilichaam is voltooid, worden de magnetische dyna beads gereinigd en voorbereid. Resuspendeer eerst de beads in het vial grondig door middel van vortexen. Draag vervolgens 30 µL beads over naar een schone gesiliconiseerde buis en plaats deze buis op een magnetisch rek voor meerdere reacties.Breng 30 µL beads per reactie over, plus voldoende voor één extra reactie om rekening te houden met pipetteerfouten of onbedoeld verlies van beads. Voor acht reacties worden bijvoorbeeld voldoende beads voor negen reacties of 270 µL overgebracht.De magnetische kralen zullen naar de wand van het magnetische rek worden getrokken. Wacht twee minuten zodat de kralen kunnen migreren en zich kunnen nestelen in een duidelijke streep op de wand van de buis. Verwijder vervolgens het supernatant met een pipet en gooi dit weg; wees hierbij voorzichtig om te voorkomen dat de kralen op de achterwand met de pipetpunt worden verstoord.Vervang het supernatant door een overmaat aan IP-buffer, vortex en plaats het opnieuw op het magnetische rek gedurende twee minuten. Herhaal deze wasstap nogmaals en resuspendeer de waskralen in hun oorspronkelijke volume IP-buffer. Haal de monsterbuis uit de rotator wanneer de incubatie is voltooid.Om de immunoprecipitatie te voltooien, voegt u 30 µL schone beads toe aan de reactie en plaatst u de buis opnieuw in een rotator voor twee uur bij 4 °C. Tijdens deze incubatie zal het secundaire antilichaam, dat anti-muis IgG is, binden aan het primaire muisantilichaam. De anti-muis-antilichamen zijn geconjugeerd aan magnetische dyna beads, waardoor de gebonden producten eenvoudig kunnen worden teruggewonnen en de daaropvolgende zuiveringsstap kan worden uitgevoerd.Zodra de incubatie met beide antilichamen is voltooid, plaatst u de IP-buis gedurende twee minuten op het magnetische rek. Op dit punt is het gemethyleerde DNA gebonden aan het primaire antilichaam, dat op zijn beurt is gebonden aan het met dyna beads geconjugeerde secundaire antilichaam. Verwijder en gooi het supernatant weg en vervang dit door 500 µL IP-buffer.Meng de inhoud van de buis en plaats deze gedurende twee minuten terug in het rek. Herhaal deze wasstap nog een keer met IP-buffer. Nadat het supernatant van de laatste wasstap is verwijderd, worden de beads voor de laatste keer geresuspendeerd.Behandel de reactie in 400 µL digestiebuffer met 100 µg proteinase K en incubeer dit een nacht bij 50 °C. De behandeling met proteinase K is noodzakelijk om de antilichaameiwitten en elk resterend eiwit dat aan het DNA is gebonden te verteren, zodat het gemethyleerde DNA in de oplossing vrijkomt. De DNA-zuivering wordt op de tweede dag van de procedure uitgevoerd; haal de digestiebuis uit de incubator.Voeg in een zuurkast 500 µL fenol-chloroform (1:1) bij pH 7 toe aan de buis en vortex grondig. Centrifugeer de buis 10 minuten bij 13.000 ×g. Verwijder voorzichtig de bovenste waterige fase uit de buis zonder de interface te verstoren of delen van de organische laag te verwijderen. Draag de waterige fase over naar een nieuwe buis.Een tweede extractie kan worden uitgevoerd als de interface troebel lijkt. Voeg vervolgens één tiende volume van drie molair natriumacetaat toe, in dit geval 40 µL. Eén µL glycogeen kan als drager worden gebruikt om het opzuiveren van het pellet te vergemakkelijken.Vortex de buis om de inhoud te mengen. Voeg vervolgens twee volumes 100% ethanol toe, vortex en vries het gedurende 20 minuten in bij -20 °C. Na het invriezen wordt het geprecipiteerde DNA gecentrifugeerd bij 13.000 G en 4 °C gedurende 20 minuten.Er zal zich een DNA-pellet vormen op de bodem van de buis. Haal de buis uit de centrifuge en verwijder de ethanol. Let erop dat het pellet op de bodem van de buis niet wordt verstoord.Een korte centrifugeerstap (pulse spin) kan nodig zijn om eventueel resterende ethanol te verwijderen. Voeg om de pellet te wassen 500 µL koude, 70% ethanol toe, vortex en centrifugeer opnieuw gedurende 20 minuten bij 13 000 G en 4 °C. Wanneer de tweede centrifugeerstap is voltooid, wordt de 70% ethanol via een korte centrifugeerstap verwijderd en wordt de resterende ethanol met een pipet afgevoerd.Plaats de buis in een rek met de dop open om het pellet te laten drogen en de resterende ethanol te laten verdampen. Resuspendeer tot slot het pellet, dat uitsluitend DNA bevat dat is verrijkt voor methylering, in 10 µL steriel water en geef het DNA-pellet voldoende tijd om op te lossen voor gebruik. Het is raadzaam om de efficiëntie van de recovery te valideren via PCR.Dit kan worden gedaan door PCR-reacties uit te voeren die zijn ontworpen om producten te amplificeren die gemethyleerde en ongemethyleerde DNA-fragmenten differentieel illustreren voor amplificerende primers van normaal menselijk DNA. De H 19 imprinting control region kan worden gebruikt in combinatie met primers die zijn ontworpen om een regio van het genoom te amplificeren die niet gemethyleerd is. Voorbeelden van primersequenties en PCR-cyclusomstandigheden kunnen worden gevonden in het bijbehorende protocol.Op dit punt is het noodzakelijk om het input- of referentie-DNA terug te halen dat aan het begin van het meetup-protocol apart was gezet. Eén set PCR-reacties wordt opgezet met het input-DNA, en de andere set met het voor methylering verrijkte IP-DNA. Als de meetup succesvol was, zal de IP-PCR een product opleveren met de methyleringsprimers en geen product met de controleprimers.Omgekeerd zou de input-PCR producten moeten genereren met behulp van beide primers, aangezien deze zowel gemethyleerde als ongemethyleerde DNA-fragmenten bevat. DNA dat verrijkt is met gemethyleerde fragmenten kan worden gebruikt voor diverse downstream-applicaties, zoals PCR-sequencing en microarray-analyse.Wanneer het wordt gecombineerd met andere moleculaire biologische technieken, kan het worden gebruikt om de methyleringsstatus van DNA op een locus-specifieke of genoombrede manier te onderzoeken voor methyleringsprofilering of het bestuderen van de epigenomica.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De gouden standaard voor DNA methylatie analyse is genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA. Deze methode maakt gebruik van de verhoogde gevoeligheid van cytosine in vergelijking met 5-methylcytosine (5-MEC) tegen desaminering bisulfiet onder zure omstandigheden. Niet-gemethyleerd cytosines kunnen worden onderscheiden van gemethyleerd cytosines na PCR-amplificatie van het doel genomisch DNA.

DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes' phenotype at various stages in culture.

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Verbeterde Gereduceerde Representatie Bisulfiet Sequencing is een methode voor de voorbereiding van sequencingbibliotheken voor DNA-methylatieanalyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine bisulfietconversie. Dit protocol vereist 50 ng aan uitgangsmateriaal en levert data met base-paarresolutie op GC-rijke genomische regio's.

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Hier presenteren we een protocol om het gehele genoom DNA-methylatie in grootschalige klinische patiënt screening studies met behulp van de Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-seq of MBD-volgende) technologie en de daaropvolgende bioinformatica analyse pijplijn te onderzoeken.

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.

Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

De methylated RNA immunoprecipitation assay is een antilichaamgebaseerde methode die wordt gebruikt om te verrijken voor gemethyleerde RNA-fragmenten. In combinatie met diepe sequencing leidt het tot de identificatie van transcripties met de m5C-wijziging.

Gemethyleerde RNA ImmunoprecipatieTest voor studie m5C Modificatie in Arabidopsis

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR's) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR's terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

Leer hoe je methyleringspatronen in DNA analyseert met MeDIP voor epigenetisch onderzoek. Deze methode isoleert methylated DNA fragmenten met anti-5mC antilichamen en magnetische beads.

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

Meer video's verkennen