Name: Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Leer hoe je methyleringspatronen in DNA analyseert met MeDIP voor epigenetisch onderzoek. Deze methode isoleert methylated DNA fragmenten met anti-5mC antilichamen en magnetische beads.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen de leden van de Brown en Lam laboratoria bedanken voor hun deelname aan bekritiseren deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research en de Michael Smith Foundation for Health Research.

DNA-extractie en monstervoorbereiding DNA uit een verscheidenheid van verschillende monsters (gekweekte cellen, vers ingevroren en in formaline gefixeerde paraffine ingebedde weefsels) kan worden gebruikt voor MeDIP. Het is belangrijk om in hoge mate gezuiverd DNA te gebruiken zonder bijbehorende eiwitten zoals histonen. Het is ook belangrijk om zo veel RNA te verwijderen als mogelijk uit de steekproef, als het kan interfereren met zowel DNA kwantificatie en antilichaam bindend. De hoeveelheid DNA gebruikt voor MeDIP kan variëren van 200 ng tot 1 ug, afhankelijk van de hoeveelheid DNA beschikbaar. Om aan te tonen dit protocol, zal 1 ug DNA worden gebruikt. Het volgende protocol zal van hoge kwaliteit dubbelstrengs DNA van gekweekte cellen. Andere protocollen moeten worden gebruikt voor extractie van DNA van andere soorten monsters. <ol><li> Voeg 400 ul van de spijsvertering buffer naar een cel pellet in een 1,7 ml Eppendorf buis. </li><li> Voeg 100 ug van proteïnase K aan de buis, en &#39;s nachts bij 50 ° C. incubeer </li><li> Voeg 500 ul fenol pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Herhaal stap 3 tot en met 5 keer. </li><li> Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Voeg 40 ug van RNase A en incubeer 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Voeg 500 ul fenol pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Herhaal de stappen 11 tot en met 13 keer. </li><li> Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en meng grondig, maar voorzichtig door om te keren. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Voeg 1/10e volume 3 M natriumacetaat (40 pl) en meng goed. </li><li> Voeg 2 volumes (900 pl) van 100% ethanol, goed mengen en plaats bij -20 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol. </li><li> Voeg 500 ul koude 70% ethanol te wassen. Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder 70% ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol door pipetteren. </li><li> De lucht droog de pellet met de kap open voor 10 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van de resterende ethanol te verwijderen. </li><li> Resuspendeer DNA in 50 ul van gesteriliseerde dH2O overnacht bij 4 ° C. </li><li> Kwantificeren van het DNA met behulp van een NanoDrop spectrofotometer. Een A-260: Een 280-verhouding van 1,8 is ideaal. </li><li> Bepaal DNA kwaliteit en grootte bereik op een agarose gel met 100 bp ladder. Zo weinig als 10 ng genomisch DNA kan worden uitgevoerd op een 1,7% agarosegel, gevolgd door kleuring met behulp van een kleurstof die zeer gevoelig is voor kleine hoeveelheden DNA, zoals SYBR Gold. </li><li> In een gesiliconiseerde tube per monster, 1 ug van DNA in een totaal volume van 50 ui met de rest van het volume uit met gesteriliseerd dH 2 O. </li></ol> DNA ultrasoonapparaat DNA sonicatie en het MeDIP het protocol moet worden uitgevoerd in siliconzied-buizen niet specifiek binden van proteïnen aan buiswanden te voorkomen. Optimale sonicatie tijden voor de DNA-monsters zijn gebaseerd op de mate van fragmentatie DNA-monster als bepaald met behulp van gel elektroforese (stap 27). Bijvoorbeeld, moet DNA geëxtraheerd uit gekweekte cellen van een zeer hoog moleculair gewicht, en zal vervolgens vereisen meer duurt dan DNA geëxtraheerd uit archiefmateriaal monsters, die vaak gedeeltelijk afgebroken. Indien monsters zijn van uniform hoog moleculair gewicht, is het redelijk op dit punt door te gaan met de sonicatie zoals beschreven in dit protocol zonder controle van elk monster apart. Indien monsters worden versnipperd en met archiefwaarde monsters, zal het nodig zijn om de ultrasoonapparaat procedure waarschijnlijk door het verlagen van sonicatie keer om 300-100 bp fragmenten te verkrijgen aan te passen. Als u verwacht dat monsters die zijn gedeeltelijk afgebroken, de optimalisering van ultrasoonapparaat parameters kunnen worden uitgevoerd op een representatieve steekproef van die van belang proces. Gebaseerd op de mate van DNA-fragmentatie waargenomen van gelelektroforese (stap 27), kan de onderzoeker vooruit op de optimale sonicatie tijd voor het monster. Hier beschrijven we een methode om 300-1000 bp DNA-fragmenten verkrijgen door sonicatie met een geautomatiseerde sonicating apparaat (Bioruptor van Diagenode, UCD-200 TM) met een hoog moleculair gewicht DNA. <ol><li> Water in Biorupter moet op 4 ° C. </li><li> Sonificeer 7 minuten op de automatische instellingen (30 sec op 30 seconden uit op maximaal vermogen). </li><li> Verwijder de 800 ng (40 ul) van gesoniceerd product en plaats in gesiliconiseerde 1,7 ml centrifugebuis voor de immunoprecipitatie (IP) reactie. </li><li> Gereserveerd resterende 200 ng (10 ul) om te dienen als input (IN) referentie-DNA (bewaren bij 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON van gemethyleerde DNA <ol><li> Denaturatie van de DNA dat zal voor IP-reactie (800 ng) worden gebruikt bij 95 ° C gedurende 10 minuten in een waterbad. </li><li> Koel onmiddellijk op ijs. Volledig te laten afkoelen DNA (ongeveer 5 minuten op het ijs) voordat u verder gaat met de volgende stap. </li><li> Voeg 5 ug monoklonaal antilichaam. </li><li> Voeg IP-buffer (gebruikt bij kamertemperatuur in dit protocol) tot een eindvolume van 500 pi. </li><li> Incubeer 2 uur bij 4 ° C in roterende buis houder. </li><li> Vlak voordat stap 5 is voltooid, voor te bereiden Dynabeads door wassen (Steps 6-11). Eerst grondig resuspendeer de kralen in de flacon door vortexen. </li><li> Transfer 30 pl (~ 2 x 10 7) van de geresuspendeerde Dynabeads per reactie plus 1, in een nieuwe gesiliconiseerde buis (bijvoorbeeld als het doen 8 reacties, genoeg parels te verwijderen voor 9, dat wil zeggen 270 pi). </li><li> Plaats de buis op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipet uit de bovendrijvende. Bij het verwijderen van supernatant, vermijd contact met de kralen tegen binnenwand (waar de kralen te trekken naar de magneet) met de pipetpunt. </li><li> Haal de buis van de magneet, en resuspendeer de kralen in een overmaat volume van IP-buffer (750 ul-1000 pi). Plaats de buis terug op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Herhaal het wassen nog een keer, en dan resuspendeer de gewassen kralen in IP buffer in het oorspronkelijke volume verwijderd in stap 7. </li><li> Voeg 30 pl gewassen Dynabeads aan elk IP reactie </li><li> Incubeer in een draaiende buis houder voor 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Na incubatie is voltooid, plaatst u de buis op de magnetische rek voor 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipet uit de bovendrijvende. Vermijd het aanraken van de binnenwand van de buis (waar de kralen te trekken naar de magneet) met de pipetpunt. Voeg 500 ul van IP-buffer. Meng de buis inhoud en zet het terug op de magnetische rek voor 2 minuten. Herhaal wassen met 500 ul IP buffer een keer. </li><li> Na het verwijderen van het supernatant van de laatste wassen, resuspendeer de kralen in 400 ul van de spijsvertering buffer. </li><li> Behandel de reactie met 100 ug van proteïnase K en &#39;s nachts bij 50 ° C. incubeer </li></ol> ZUIVERING VAN immunogeprecipiteerd DNA <ol><li> Voeg 500 ul 01:01 fenol / chloroform pH 7 en vortex grondig. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de waterige (top) fractie naar een nieuwe buis. </li><li> Herhaal de stappen 1 tot en met 3 als de interfase tussen de waterige en organische lagen troebel. </li><li> Voeg 1 / 10 e deel 3 M natriumacetaat (40 pl) en vortex. </li><li> Voeg 1 ui van glycogeen (20 pg / pl) en vortex. </li><li> Voeg 2 volumes (1000 pl) van 100% ethanol, vortex, en plaats bij -20 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol. </li><li> Voeg 500 ul koude 70% ethanol te wassen. Vortex kort en spin bij 13 000 g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder 70% ethanol, pols draaien, en verwijder de resterende ethanol door pipetteren. </li><li> De lucht droog de pellet met de kap open voor 10 minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van de resterende ethanol te verwijderen. </li><li> Resuspendeer DNA pellet in 10 pi gesteriliseerd dH 2 0. </li></ol> Validatie door PCR <ol><li> U kunt testen om ervoor te zorgen dat uw MeDIP procedure werkt door het uitvoeren van de MeDIP protocol met behulp van normale menselijke DNA (mannelijk of vrouwelijk), en vervolgens het testen van een regio die bekend worden verrijkt voor de methylatie. </li><li> Verwijder 30% van de MeDIP product aan PCR tube, en nog eens 30% van de MeDIP product naar een andere PCR buis. </li><li> Zet 10 ng van IN DNA in een PCR-buis, en 10 ng van IN DNA in een andere PCR-buis. Je hebt nu vier afzonderlijke PCR-reacties in te stellen. </li><li> Voer PCR met behulp van H19 en CTRL primers zoals aangegeven in tabel 1. </li><li> Bereid twee mastermixes (een voor elke primer set) voor PCR-reacties met 12,5 ui totaal volume zoals aangegeven in tabel 2. </li><li> Thermocycle de PCR met behulp van de voorwaarden vermeld in tabel 3. </li><li> Run 5 ul van PCR-producten op een 2% agarosegel voor visualisatie. </li><li> De verwachte resultaten voor een succesvolle MeDIP zijn weergegeven in tabel 4. </li></ol> Tafels Tabel 1: H19 en CTRL primers voor PCR validatie. <table border="1"><tbody><tr><td> Primer Set </td><td> Voorwaartse primer </td><td> Reverse primer </td><td> Verwachte Product Maat </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (control) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Mastermixes voor PCR-reacties. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (per Rxn) </td><td> CTRL Mix (per Rxn) </td></tr><tr><td&gt; DDH 2 O </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> 10X Buffer </td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mM elk) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mm) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Primers (H19_F / R of CTRL_F / R) (10 uM elk F / R) </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. PCR thermocyling voorwaarden. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Verwachte PCR-resultaten voor succesvolle MeDIP. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Template-DNA </td></tr><tr><td> Primer wordt gebruikt </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positief </td><td> Positief </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positief </td><td> Negatief </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
<li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+cancer+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">The history of cancer epigenetics.</a> Nature reviews. 4, 143-153 (2004).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Er is een groeiend besef van de belangrijke rol van DNA-methylatie speelt bij de ziekte, zijn daarom de ontwikkeling van assays om deze wijziging te meten steeds belangrijker 3, 12, 13. De MeDIP techniek is een hulpmiddel vatbaar voor het screenen van zowel het hele genoom en locus-specifieke niveau 6, 7. Deze techniek zorgt voor een snelle weergave van DNA-methylatie niveaus met behulp van beperkte hoeveelheden van het starten van DNA en maakt een eenvoudige vergelijkingen tussen verschillende bro...

<table><tbody><tr><td>Biorupter sonicator</td><td>Instrument</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>1.7ml SafeSeal microcentrifugebuisjes</td><td>Overig</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ND 3300 spectrophotometer</td><td>Instrument</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primair antilichaam: Anti-5&amp;rsquo;-methylcytosine muis mAb</td><td>Reagens</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam: Dynabeads M-280 schaap anti-muis IgG</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisch buisjesrek</td><td>Instrument</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Instrument</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>IP-buffer</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Bewaard bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Digestiebuffer</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

gemethyleerd dna immunoprecipitatie

Methylated DNA Immunoprecipitation

De identificatie van DNA-methylatie patronen is een gemeenschappelijke procedure in de studie van de epigenetica, zoals methylatie is bekend dat significante effecten op de genexpressie hebben, en is betrokken bij een normale ontwikkeling en ziekte<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Zo is de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen gemethyleerd DNA en niet-gemethyleerd DNA is essentieel voor het genereren van methylatie profielen voor dergelijke studies. Gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP) is een efficiënte techniek voor de extractie van gemethyleerd DNA van een steekproef van belang<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Een monster van zo weinig als 200 ng van DNA is voldoende voor het antilichaam, of immunoprecipitatie (IP), reactie. DNA is gesoniceerd in fragmenten, variërend in grootte van 300-1000 bp, en is verdeeld in immunogeprecipiteerd (IP) en de ingang (IN) porties. IP-DNA wordt vervolgens warmte gedenatureerd en vervolgens geïncubeerd met anti-5&#39;mC, waardoor het monoklonale antilichaam om gemethyleerd DNA te binden. Na dit, zijn magnetische korrels met een secundair antilichaam met affiniteit voor het primaire antilichaam toegevoegd en geïncubeerd. Deze kraal-linked antilichamen binden het monoklonale antilichaam dat wordt gebruikt in de eerste stap. DNA gebonden aan het antilichaam complex (gemethyleerd DNA) is gescheiden van de rest van het DNA met behulp van een magneet om de complexen te trekken uit de oplossing. Enkele wasbeurten met behulp van IP-buffer worden dan uitgevoerd om de ongebonden, niet-gemethyleerd DNA te verwijderen. De gemethyleerde DNA / antilichaam complexen worden dan verteerd met proteïnase K aan de antilichamen waardoor alleen de gemethyleerd DNA intact te verteren. De verrijkte DNA wordt gezuiverd door fenol: chloroform extractie aan het eiwit materiaal te verwijderen en vervolgens geprecipiteerd en geresuspendeerd in water voor later gebruik. PCR-technieken kunnen worden gebruikt om de efficiëntie van de MeDIP te valideren door het analyseren van de amplificatieproducten van IP en in DNA voor de regio&#39;s waarvan bekend is dat het gebrek en waarvan bekend is dat gemethyleerde sequenties bevatten. Het gezuiverde gemethyleerd DNA kan vervolgens worden gebruikt voor de locus-specifieke (PCR) of genoom-brede (microarray en sequencing) methylering studies, en is vooral handig wanneer toegepast in combinatie met andere research tools zoals gen expressie profilering en array comparatieve genoom hybridisatie ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Nader onderzoek naar DNA methylatie zal leiden tot de ontdekking van nieuwe epigenetische doelstellingen, die op hun beurt, kunnen nuttig zijn bij de ontwikkeling van nieuwe therapeutische of prognostische onderzoek tools voor ziekten zoals kanker die gekenmerkt worden door afwijkend gemethyleerd DNA<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

De identificatie van DNA-methyleringspatronen is een veelvoorkomende procedure in de studie van de epigenetica, aangezien bekend is dat methylering significante effecten heeft op ...

Deze video demonstreert een protocol voor gemethyleerde DNA-immunoprecipitatie of MeDIP. Een methode die wordt gebruikt om op een onbevooroordeelde wijze specifiek gemethyleerd DNA te isoleren. DNA-methylering bij zoogdieren wordt gekenmerkt door de toevoeging van een methylgroep aan de C5-positie van cytosine.Wanneer het aanwezig is in een CpG-dinucleotide, is het een reversibele epigenetische markering die een belangrijke rol speelt bij de normale ontwikkeling, evenals bij verschillende ziekteprocessen. Normale functies van DNA-methylering omvatten X-chromosoom-inactivering bij vrouwtjes, het uitschakelen van repetitieve elementen, genomische imprinting en het behoud van genomische stabiliteit. DNA-methylering is bovendien aangetoond als een factor bij talrijke ziekten, zoals kanker, het syndroom van de Angelman, het syndroom van Prader-Willi en het centrumere instabiliteit- en gelaatsafwijkingssyndroom.In kankers kan bijvoorbeeld abnormale hypermethylering van promotors leiden tot het uitschakelen van vitale tumorsuppressorgenen. Terwijl onjuiste hypomethylering resulteert in chromosomale instabiliteit en activatie van oncogenen, wordt de voorbereiding voltooid door het DNA eers

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De gouden standaard voor DNA methylatie analyse is genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA. Deze methode maakt gebruik van de verhoogde gevoeligheid van cytosine in vergelijking met 5-methylcytosine (5-MEC) tegen desaminering bisulfiet onder zure omstandigheden. Niet-gemethyleerd cytosines kunnen worden onderscheiden van gemethyleerd cytosines na PCR-amplificatie van het doel genomisch DNA.

DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes' phenotype at various stages in culture.

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Verbeterde Gereduceerde Representatie Bisulfiet Sequencing is een methode voor de voorbereiding van sequencingbibliotheken voor DNA-methylatieanalyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine bisulfietconversie. Dit protocol vereist 50 ng aan uitgangsmateriaal en levert data met base-paarresolutie op GC-rijke genomische regio's.

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Hier presenteren we een protocol om het gehele genoom DNA-methylatie in grootschalige klinische patiënt screening studies met behulp van de Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-seq of MBD-volgende) technologie en de daaropvolgende bioinformatica analyse pijplijn te onderzoeken.

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.

Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

De methylated RNA immunoprecipitation assay is een antilichaamgebaseerde methode die wordt gebruikt om te verrijken voor gemethyleerde RNA-fragmenten. In combinatie met diepe sequencing leidt het tot de identificatie van transcripties met de m5C-wijziging.

Gemethyleerde RNA ImmunoprecipatieTest voor studie m5C Modificatie in Arabidopsis

Leer hoe je methyleringspatronen in DNA analyseert met MeDIP voor epigenetisch onderzoek. Deze methode isoleert methylated DNA fragmenten met anti-5mC antilichamen en magnetische beads.

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

Meer video's verkennen