Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen
November 26th, 2008
Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.
Mijn naam is Maria en ik werk bij Y Healthcare in NOS in Zweden. Celoppervlakte-eiwitten zijn vaak betrokken bij communicatie tussen cellen en hun omgeving en zijn daarom van bijzonder belang in onderzoek, met als doel meer inzicht te krijgen in ziekten en andere biologische variaties veroorzaakt door veranderingen in de cel omgeving. In deze video laat ik je een eenvoudig side-eye dodge celoppervlakte-etiketteringsprotocol zien en je zult deze weinig voorkomende eiwitten visueel kunnen verrijken zonder fysische verbetering en de verschillen van deze celoppervlakte-eiwitten kunnen bestuderen met de technologie.
Als je deze technologie interessant vindt, kun je meer informatie vinden in de 2D handleiding. Bovendien hebben we een applicatie nota over dit specifieke onderwerp die je kunt downloaden van job In het celoppervlakte-etiketteringsprotocol dat bovenaan te zien is, label je de cellen terwijl ze nog intact zijn. Tijdens het etiketteringsproces heeft de kleurstof alleen toegang tot de celoppervlakte-eiwitten.
Na de etiketteringsstap worden de cellen geanalyseerd om de celoppervlakte-specifieke etikettering te verifiëren. Het labelmonster werd gefractioneerd in membraan- en cytosolische eiwitten. Een niet gefractioneerd monster werd parallel bereid.
Voor vergelijking is deze fractioneringsanalyse niet noodzakelijk, maar werd hier gedaan om te laten zien dat het celoppervlakteprotocol specifiek is voor celoppervlakte-eiwitpunten. We voerden ook het standaard ETH niet-diet-etiketteringsprotocol uit dat hieronder te zien is, de cellen liggen voor het labelen, en op deze manier zijn alle cellulaire eiwitten toegankelijk voor labelen. Na de label stap worden de monsters onderworpen aan 2D-elektroforese.
A hechtende cellen worden losgemaakt met een niet-enzymatische procedure om vertering van de celoppervlakte-eiwitten die worden aangewezen, te voorkomen. In dit protocol gebruiken we de rubberen politieman, maar het gebruik van enzym drie celdissociatie media is ook een optie tel en verdeel de celsuspensies in vakken van vijf tot 10 miljoen cellen per buis. De cellen worden vervolgens gepelleteerd en gewassen in H-P-S-S-P-H 7.4 om sporen van celcultuur te verwijderen.
Mediabesmetting door serumeiwitten en fluorescerende componenten kan interfereren met labelen en detectie. Cellen die in suspensie groeien, worden direct gepelleteerd en gewassen vóór de label stap na het wassen. Het celpalette wordt opgeschort in 200 microliter ijskoud labelbuffer met HPSS pH 8.5 en één molair uria.
Voor optimale labelvoorwaarden van celoppervlakte-eiwitten controleer altijd de pH. Voor het labelen gebruikten we 600 pic mold side-eye voor 10 miljoen CHO cellen. De optimale verhouding van side-eye tot celaantal zal variëren afhankelijk van het celtype.
Aangezien we de exacte eiwitconcentraties op het celoppervlak niet kennen. Hoe de optimale voorwaarden voor side-eye labelen van eiwitten te bepalen, wordt beschreven in de 2D-elektroforese principes en methoden handleiding. De cellen worden gedurende 20 minuten op ijs in het donker geïncubeerd met side eye D vloer, minimaal dik voor.
Na de labelreactie wordt de niet-reactieve kleurstof geblust door 20 microliter 10 millimolar lysine toe te voegen. De labelcellen worden nu twee keer gewassen in koude HPSS pH 7.4 buffer om het overtollige side eye te verwijderen. Er zal daarom geen vrije kleurstof overblijven voor ongewenste intracellulaire labelen of eiwitten in de volgende stap, die cellyse is.
De eiwitten op het celoppervlak zijn nu gelabeld en de cellen zijn klaar om te worden gelyseerd. Het pellet van de verloren wasstap wordt opgeschort in 150 microliter koude lysebuffer die zeven molair uria, twee molair thi uria, 4% chaps 30 millimolar trees vijf millimolar magnesiumacetaat pH 8.5 bevat en minimaal een uur op ijs wordt geplaatst met occasioneel vortexen taxing. De monsters zijn nu klaar voor 2D-scheiding.
De eerste stap in de elektrolyse is het voorbereiden van IPD-strips voor rehydratie. Bereid een district rehydratieoplossing door IPG-buffer toe te voegen die overeenkomt met het pH-interval van de gebruikte strips en voeg de oplossing toe in de lens van de rehydratielade. Verwijder de beschermende film van de IPG-strip en plaats de strips voorzichtig met een gedroogd gel naar beneden in de rehydratielade die de rehydratieoplossing bevat.
Sluit het deksel van de IPG-doos en rehydreer de strips een nacht. In de eerste dimensie, iso-elektrisch focussen, worden de eiwitten gescheiden volgens hun pi. Dit wordt uitgevoerd met behulp van de IPG vier drie.
De gehydrateerde strips worden in de manifold geplaatst en de elektrode wordt bovenop gemonteerd. 50 microgram van elk monster werd aangebracht met behulp van monsterapplicatie-kappen. We hebben ofwel direct niet-gefractioneerde monsters toegepast zonder voorafgaande fractionering of de monsters gefractioneerd in membraan- en cytosolische fracties voordat ze werden aangebracht.
De lead is gesloten om de fluorescerende monsters tegen licht te beschermen. Het instrument werd geprogrammeerd volgens de aanbevelingen en overnacht uitgevoerd. Grote 12% lamby-gels werden geproduceerd met behulp van volwassen 12-gel.
Coster verplaatsingsoplossing werd toegevoegd om gepolymeriseerde acry-gels in de slangen te voorkomen. De gels werden een nacht gepolymeriseerd bij kamertemperatuur voor gebruik. Na de iso-elektrische focusering worden de strips verwijderd en geëquilibreerd in SDS-bevattende buffer in twee stappen met behulp van DTT om de di-sulfidebindingen van cysteïneresidu's te verminderen, gevolgd door alkylering met jouw acetamid om modificatie door acrylamide te voorkomen.
De IPG-strips worden in loopbuffer gedompeld en voorzichtig op de grote twee dig-gels geplaatst. Voorkom dat lucht tussen de strips en het gel gevangen zit door het toevoegen van gesmolten 2% agro-oplossing met bromo anol blauw bovenop. De gels zijn nu klaar voor tweede dimensie SDS-pagina scheiding In de tweede dimensie SDS-pagina.
De eiwitten worden gescheiden volgens molecuulgewicht en dit wordt uitgevoerd met tonaal zes systeem. Vul de elektroforesekamer met anodische loopbuffer, plaats de gels en vul het b
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudige methode voor fluorescentiemarkering van celoppervlakte-eiwitten, waardoor hun detectie zonder fractierings wordt verbeterd. De studie maakt gebruik van tweedimensionale elektroforese en Ettan™ DIGE-technologie om differentiële abundantie in deze eiwitten te analyseren.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Eiwitanalyse
- Fluorescentiemarkeringstechnieken
Achtergrond
- Celoppervlakte-eiwitten spelen een cruciale rol in cellulaire communicatie.
- Het begrijpen van deze eiwitten kan inzicht geven in verschillende ziekten.
- Laag abundante eiwitten zijn vaak moeilijk te bestuderen vanwege hun subtiele aanwezigheid.
- Deze studie heeft tot doel de detectie en analyse van dergelijke eiwitten te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een markeringsprotocol te ontwikkelen dat lage abundantie celoppervlakte-eiwitten verrijkt.
- Om het onderzoek naar verschillen in celoppervlakte-eiwitten te vergemakkelijken.
- Om een methode te bieden die geen fysieke verbetering van monsters vereist.
Gebruikte methoden
- Fluorescentiemarkering van intacte cellen.
- Tweedimensionale elektroforese voor eiwitscheiding.
- Ettan™ DIGE-technologie voor verbeterde detectie.
- Analyse van differentiële abundantie in celoppervlakte-eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle markering van celoppervlakte-eiwitten zonder fractierings.
- Verbeterde detectie van laag abundante eiwitten.
- Aangetoonde verschillen in eiwit abundantie met behulp van de ontwikkelde methode.
- Een betrouwbaar protocol geleverd voor toekomstige onderzoekstoepassingen.
Conclusies
- De methode maakt effectief onderzoek van celoppervlakte-eiwitten mogelijk.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar cellulaire communicatie en ziektemechanismen.
- Toekomstige studies kunnen op dit protocol voortzetten voor verdere inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes enables high-specificity detection of low-abundance membrane proteins critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This protocol supports multiplexed, quantitative analysis of protein expression changes, directly informing predictive confidence at key inflection points in the biopharma pipeline. The approach streamlines workflows by eliminating the need for fractionation, enhancing reproducibility and scalability for enterprise R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell-surface protein dynamics relevant to disease and drug response.
- Supports functional target validation by isolating membrane protein changes under defined conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing surface from intracellular protein alterations.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, specifically labeled cell systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, multiplexed outputs using 2-D DIGE and DeCyder analysis software.
- Enables assay standardization and reproducibility by minimizing sample preparation variability.
- Supports reliable compound evaluation by focusing on surface-accessible targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by tracking cell-surface protein changes during environmental or treatment perturbations.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust biomarker detection.
- Reduces translational risk by supporting quantitative, statistically validated protein expression analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and quantitative screening readiness.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cell-surface protein involvement in signaling and adaptation.
- Screening: Provides reproducible, multiplexed assay outputs for comparative analysis.
- Analytics: Delivers quantitative, statistically supported measurements for differential protein expression.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by tracking surface protein changes under disease-relevant conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by eliminating fractionation and enabling multiplexed analysis.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent labeling and 2-D electrophoresis techniques.
- Needs access to compatible imaging and analysis platforms such as Ettan DIGE and DeCyder software.
- Demands cross-team standardization of labeling and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types with optimization of dye-to-cell ratios and labeling conditions.
- Limited by detection of highly hydrophobic or very high molecular weight proteins, as noted in source data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:10
Introduction to Cell Surface Protein Labeling with Ettan DIGE System
1:12
Overview of the Experiment
2:19
Sample Preparation
3:13
Labeling with CyDye DIGE Fluors
4:03
Incubation and Quenching
4:45
Cell Lysis
6:31
First Dimension ISO-Electric Focusing
5:29
Rehydration of IPG Strips
7:27
Gel Casting
9:43
Second Dimension SDS-Page
7:55
Equilibration of IPG Strips
10:29
Gel Scanning
10:52
Results of Cell Surface Protein Labeling
11:21
Comparison with Fractionated Runs
12:30
2D DIGE Analysis
13:27
Conclusions
