Name: Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor fluorescente etikettering van celoppervlakte-eiwitten met CyDye DIGE-technologie. Deze aanpak verrijkt laag abundante eiwitten zonder fractionering en maakt differentiële analyse mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer en Sigurd Krieger aan het Instituut voor Klinische Pathologie van de Universiteit van Wenen, Oostenrijk voor hun samenwerking.

Celcultuur <ol><li> Groei Chinese hamster ovarium cellen (CHO-K1) met behulp van standaard celkweek procedures in F-12 Ham medium met Glutamax ik ​​dat 10% foetaal kalf serum, 50 U / ml penicilline, en 50 ug / ml streptomycine sulfaat (Invitrogen). </li><li> Exchange het kweekmedium aan serum-vrije media. Label de cel oppervlakte-eiwitten werden op verschillende tijdstippen met CyDye DIGE Fluor Cy3 of Cy5 minimale kleurstoffen (zie rubriek celoppervlak Labeling, hieronder). </li><li> Pool gelijke aantallen van cellen van elk tijdstip en label met CyDye DIGE Fluor Cy2. Gebruik deze als een interne standaard voor elke 2-D gel. </li><li> Het merendeel van de experimenten kan worden uitgevoerd met CHO-K1 cellen, maar de muis embryo fibroblasten (3T3 L1) en de muis ascites lymfoom lymfoblasten (EL4) kan ook gebruikt worden (gegevens niet getoond). </li><li> Groeien de twee laatste soorten cellen in DMEM medium met Glutamax II, maar gebruik anders identieke omstandigheden gebruikt worden voor de CHO-K1 cellen. </li></ol> Celoppervlak etikettering <ol><li> Haal voorzichtig hechtende cellen niet-enzymatisch, tellen en te delen in porties van 5-10 x106 cellen. Voor cellen in suspensie te groeien, laat het los stap. </li><li> Centrifugeer de celsuspensies op ongeveer 800 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatanten die het medium. </li><li> Was de pellets door resuspendion in Balanced Salt Solution 1 ml ijskoud Hank&#39;s (HBSS) pH 8,5. Gecentrifugeerd bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 200 ui ijskoude etikettering buffer (HBSS pH 8,5, 1 M ureum). </li><li> Label de intacte cellen met 600 pmol CyDye DIGE kleurstoffen Fluor minimaal gedurende 20 minuten op ijs in het donker. </li><li> Quench de reactie door het toevoegen van 20 pi 10 mM lysine. Incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Was twee keer de oppervlakte-gemerkte cellen door resuspensie in 500 pi HBSS pH 7,4, gevolgd door centrifugatie bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten. </li></ol> Cellysis en fractionering <ol><li> Lyse de oppervlakte-gemerkte cellen in 150 ul koude lysis buffer (7 M ureum, 2 M thio, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM magnesiumacetaat pH 8,5). Laat het ijs gedurende ten minste 1 uur met af en toe vortexen. </li><li> Centrifugeer de lysaten bij 10 000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Breng het supernatans naar een nieuwe buis. Dit monster is de niet-gefractioneerde monster dat alle cellulaire eiwitten. </li><li> Parallel, wassen celpellets, zoals hierboven, dan fractioneren (met behulp van een membraan fractionering kit, Pierce) in membraan en de cytosolische fracties voorafgaand aan de 2-D gel elektroforese. Het membraan fractie bevat interne en celoppervlak membraaneiwitten. </li><li> Ter vergelijking, volg dan de standaard Ettan DIGE procedure 3, en lyse, label, en, ten slotte, fractioneren van de cellen. Bepaal de proteïne concentratie in de monsters met behulp van de 2 - D Quant Kit (GE Healthcare). </li></ol> 2-D elektroforese <ol><li> Hydrateren Immobiline DryStrip gels, pH 3-11NL (24 cm) met behulp van Immobiline DryStrip Reswelling tray, 24 cm in 450 ul DeStreak rehydration solution (0,5% IPG Buffer) &#39;s nachts. </li><li> Breng de CyDye-gelabelde monsters (wat overeenkomt met 50 ug totaal eiwit) om DryStrip gels Immobiline door anodische cup laden in het spruitstuk en de iso-elektrische focussering (IEF) met behulp van Ettan IPGphor II IEF-systeem volgens de instructies uit te voeren. </li><li> Na het IEF, evenwicht van de strips in twee stappen en plaats op de top van grote (26 x 20 cm) 12,5% polyacrylamide gels (SDS-PAGE). Overlay met 0,5% agarose (in rijklare buffer met broomfenolblauw). Run 2-D elektroforese met behulp van Ettan DALTtwelve grote verticale System bij 5 W / gel gedurende 30 minuten, en dan bij 15 W / gel totdat de kleurstof front bereikt de onderkant van de gel. </li></ol> Imaging en data-analyse <ol><li> Na het voltooien van 2-D elektroforese, scan de gels voor Cy2, Cy3 of Cy5 met behulp van een Typhoon 9410 Variable Mode Imager. </li><li> Vergelijk spot kaarten van membraanfracties, cytosolische fracties, en niet-gefractioneerd monsters met behulp van DeCyder 2-D-Verschil Analyse Software 4. </li></ol> Post-vlekken <ol><li> Na de beeldvorming, zilver vlekken op de gels volgens de standaard procedure 5. </li></ol> Eiwit identificatie <ol><li> Telen, oogsten, wassen en lyseren preparatieve bedragen (ongeveer 1 mg totaal eiwit van 10 x106 CHO-cellen) van cellen, zoals hierboven beschreven voor een niet-gefractioneerde monster. Gebruik een Cy5 celoppervlak gelabelde monster (zie boven) als een piek, en toe te passen in combinatie met de niet-geëtiketteerde preparatieve hoeveelheden eiwitten. </li><li> Het uitvoeren van 2-D elektroforese als hierboven beschreven, maar deze keer, aplly 600 ug ongelabelde cel lysaat samen met 50 ug celoppervlak gelabeld spike door anodische cup toepassing. Gebruik referentie markers om de juiste plek plukken toe te staan, en plaats wordentussen de glazen platen voor de gel gieten volgens de aanbevelingen 3. </li><li> Scan de gel in Cy5 kanaal naar de Cy5 celoppervlak spot kaart, gevolgd door een totaal eiwit kleuring met behulp van Deep purple totaal eiwit vlek 3 te verkrijgen. </li><li> Match samen de twee plek kaarten met behulp van de DeCyder 2-D software en maak een keuze lijst voor alle plaatsen die overeenkomt met de Cy 5 gelabelde cel oppervlakte-eiwitten. Pick cel-oppervlakte-eiwitten met behulp van de Ettan plek handling station, uittreksel uit de gel stekkers, en trypsinate het gebruik van de Ettan vergister. Identificeren met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie. </li></ol> Tabel 1. Een Ettan DIGE experiment werd uitgevoerd met behulp van monsters van serum uitgeputte cellen geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling protocol in figuur 1. <table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Monster </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> De tijd van het serum uitputting </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Gelabeld met CyDye </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Gel nummer </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 1 </td><td style="text-align:center;"> - </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 2 </td><td style="text-align:center;"> 30 minuten </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 3 </td><td style="text-align:center;"> 2 uur </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 4 </td><td style="text-align:center;"> 4 uur </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 5 </td><td style="text-align:center;"> 16 uur </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 3 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

Eiwitconcentratie Een overzicht van de twee etikettering workflows is weergegeven in figuur 1. Omdat de cellen zijn nog steeds intact wanneer geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling-protocol, worden alleen de cel oppervlakte-eiwitten worden blootgesteld aan de kleurstof. In de standaard Ettan DIGE protocol, worden de cellen gelyseerd voor de etikettering en de eiwitten zowel binnen als buiten de cel zijn gelabeld (Fig 1). De relatieve hoeveelheid kleurstof aan eiwit in de cel-o...

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>IPG Buffer pH 3-11NL</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>Hulpmiddel</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox kit</td><td>Hulpmiddel</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>DeStreak rehydratie-oplossing</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip Cover Fluid</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 IEF-unit</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor Manifold</td><td>Instrumentcomponent</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelve gelgieter</td><td>Hulpmiddel</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelve scheidingsunit en voeding/besturingseenheid</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>230 V unit: 80-6466-27</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spot Picker</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Digester</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spotter</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>DeCyder 2-D differentiële analysesoftware</td><td>Overig</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant analysesoftware</td><td>Overig</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>Ureum</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne dithiothreïtol (DTT)</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromfenolblauw</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne glycerol 87%</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne TEMED</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ammoniumpersulfaat</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne glycine</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>2-D monstervoorbereiding voor membraaneiwitten</td><td>Reagens</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinesulfaat</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

selectieve etikettering van cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van cydye dige fluor minimal kleurstoffen

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Oppervlakte-eiwitten staan ​​centraal in het vermogen van de cel om te reageren op zijn omgeving en de interactie met naburige cellen. Ze staan ​​bekend als inductoren van bijna alle intracellulaire signalering. Bovendien spelen ze een belangrijke rol in het milieu aanpassing en behandeling met geneesmiddelen, en zijn vaak betrokken zijn bij de ziekte pathogenese en pathologie (1). Eiwit-eiwit interacties zijn intrinsiek aan signaalwegen, en om meer inzicht te krijgen in deze complexe biologische processen, zijn gevoelige en betrouwbare methoden nodig voor het bestuderen van cel-oppervlakte-eiwitten. Twee-dimensionale (2-D) electroforese wordt op grote schaal gebruikt voor de detectie van biomarkers en andere doelen in complexe eiwit monsters differentiële veranderingen te bestuderen. Cel oppervlakte-eiwitten, mede door hun lage abundantie (1 2% van cellulaire eiwitten), zijn moeilijk te detecteren in een 2-D gel zonder fractionering of een andere vorm van verrijking. Ze zijn ook vaak slecht vertegenwoordigd in 2-D gels vanwege hun hydrofobe karakter en een hoog moleculair gewicht (2). In deze studie presenteren we een nieuw protocol voor het intacte cellen met behulp van CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen voor specifieke etikettering en de opsporing van deze belangrijke groep van eiwitten. De resultaten toonden aan specifieke etikettering van een groot aantal cel-oppervlakte-eiwitten met een minimale etikettering van intracellulaire eiwitten. Dit protocol is een snelle, eenvoudig te gebruiken, en alle drie CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen (Cy 2, 3 en Cy Cy 5) kan worden gebruikt om cel-oppervlakte-eiwitten label. Deze functies zorgen voor multiplexing het gebruik van de 2-D fluorescentie Verschil gelelektroforese (2-D DIGE) met Ettan DIGE techniek en de analyse van eiwit-expressie veranderingen met behulp van DeCyder 2-D Differentiële analyse software. Het niveau van de cel-oppervlakte-eiwitten werd gevolgd tijdens het serum uithongering van de CHO-cellen voor verschillende lengtes van de tijd (zie tabel 1). Kleine veranderingen in overvloed werden gedetecteerd met hoge nauwkeurigheid, en de resultaten worden ondersteund door omschreven statistische methoden.

Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Oppervlakteproteïnen zijn essentieel voor het vermogen van de cel om te reageren op zijn omgeving en om te interageren met naburige cellen. Het staat bekend dat zij inductoren zijn van ...

Mijn naam is Maria en ik werk bij Y Healthcare in NOS in Zweden. Celoppervlakte-eiwitten zijn vaak betrokken bij de communicatie tussen cellen en hun omgeving en zijn daarom van bijzonder belang in onderzoek dat erop gericht is meer inzicht te krijgen in ziekten en andere biologische variaties die worden veroorzaakt door veranderingen in de celomgeving. In deze video laat ik u een eenvoudig protocol zien voor de labeling van het celoppervlak via de side-eye dodge methode, waarmee u deze eiwitten met een lage abundantie visueel kunt verrijken zonder fysieke versterking, om vervolgens de verschillen tussen deze celoppervlakte-eiwitten met deze technologie te bestuderen.Als u deze technologie interessant vindt, kunt u meer informatie vinden in het 2D-handboek. Bovendien hebben we een applicatienota over dit specifieke onderwerp die u kunt downloaden van job. In het protocol voor celoppervlaklabeling dat bovenaan wordt getoond, labelt u de cellen terwijl ze nog intact zijn. Tijdens het labelingsproces heeft de kleurstof alleen toegang tot de eiwitten op het celoppervlak.Na de labelingsstap worden de cellen geanalyseerd om de specifieke labeling van het celoppervlak te verifiëren. Het g

selective-labelling-cell-surface-proteins-using-cydye-dige-fluor

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

CFSE labels covalent langlevende intracellulaire moleculen met de fluorescente kleurstof, carboxyfluoresceïne. Als zodanig, als een CFSE-gelabelde cel zich deelt, zijn nakomelingen hebben de helft van de fluorescentie, die daarmee kan worden gebruikt om de celdeling te beoordelen. Dit artikel beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor het labelen muis lymfocyten met CFSE.

Het gebruik van carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFSE) om lymfocytproliferatie Monitor

Succesvol gebruik van cell tracking kleurstoffen aan immuun cel functie en proliferatie monitoren omvat verschillende kritische stappen. We beschrijven werkwijzen voor: 1) het verkrijgen helder, uniform en reproduceerbaar label-ing met membraan kleurstoffen, 2) het selecteren fluorochromen en data acquisitie niet, en 3) het kiezen van een model gebaseerd op celproliferatie kleurstof verdunning kwantificeren.

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Het protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden met een commercieel verkrijgbare DNA-gel vlek, verwerving van time lapse-serie van live gelabelde cellen door super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM), en automatische tracking van nucleoïde beweging.

Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Leer een eenvoudige methode voor fluorescente etikettering van celoppervlakte-eiwitten met CyDye DIGE-technologie. Deze aanpak verrijkt laag abundante eiwitten zonder fractionering en maakt differentiële analyse mogelijk.

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Meer video's verkennen