Ondersteunde Planar dubbellagen voor de vorming van studie van immunologische synapsen en Kinapse

Hoi, ik ben Mike Dustin van het Geral Institute en de New York University School of Medicine. Vandaag leid ik u door de procedure voor het vormen van ondersteunende planaire biolagen voor de studie van de immunologische synaps. Laten we beginnen.

Om de lipide dubbellaag te maken, bereiden we een oplossing van 20% nikkelchelaterend lipide en 80% fosfatidylcholine in de juiste hoeveelheden voor in een glazen buis met één tot twee milliliter chloroform-methanol. De eerste stap is het verdampen van het oplosmiddel onder een stroom nitrogengas in een warm waterbad van 30 tot 37 °C. Dit duurt gewoonlijk ongeveer 15 minuten.

Verwijder vervolgens alle resterende oplosmiddel onder hoog vacuüm met behulp van een lyofilisator gedurende 90 minuten. Los daarna de lipiden op in een saline buffer met 2%N octylglucoside-detergens tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 millimolar. Dit creëert een oplossing van gemengde detergens-fosfolipide-micellen om liposomen te vormen.

Deze oplossing wordt gedialyseerd tegen drie wisselingen tris-zoutoplossing om het detergens te verwijderen en liposomen te vormen. Meestal werken we met volumes van ongeveer één milliliter met slangjes van zes millimeter diameter en een cutoff rond de 10 kilodalton, waarbij we er zorgvuldig op toezien dat er geen luchtbellen aanwezig zijn tijdens het klemmen van de slangjes. We filteren deze oplossing steriel, voeren de dialyse uit onder schone omstandigheden en hanteren de oplossing met handschoenen die zijn gesteriliseerd met 70% ethanol.

Deze oplossing moet kristalhelder zijn en wordt onder argon-gas bewaard om oxidatie te voorkomen. Als de oplossing troebel is, heeft u meerwandige vesicles gevormd en moet u opnieuw beginnen. Om het experiment op te zetten, moeten we eerst bepalen hoeveel ICAM-1 en MHC worden afgezet op een bepaald oppervlak van een nikkel-chelating bilayer bij een gegeven concentratie van oplosbaar eiwit.

Hiervoor brengen we dubbellagen aan op glasparels met een diameter van vijf micrometer. Incubeer de glasparels met eiwitoplossingen onder omstandigheden die benaderen hoe de flowcellen worden gebruikt voor beeldvorming, en lees vervolgens de dichtheid van het gebonden eiwit af met een flow-immunofluorometrische assay. FSI-gelabelde antilichamen met een bekend aantal fluoresceïne-moleculen per molecuul worden gebruikt om de oppervlaktegebonden eiwitten te detecteren, en fluoresceïne-standaardparels worden gebruikt om de flow-microfluorimeter te kalibreren.

We zullen condities vaststellen die benaderen wat er op antigeenpresenterende cellen plaatsvindt, met 200 moleculen per vierkante micrometer ICAM-1 en 0,2 tot 20 moleculen per vierkante micrometer I-E-K-M-C-C 91 1 0 3. Complexe vlakke dubbellagen vormen zich spontaan wanneer de liposomen met het glas fuseren, maar alleen als dit correct is gereinigd. Om het glas te reinigen gebruiken we een piranha-oplossing, een vers bereid mengsel van zwavelzuur en 30% waterstofperoxide, dat alle organische materialen vernietigt en het glasoppervlak bovendien zeer hydrofiel maakt.

Bij het werken met piranhaoplossing dragen wij volledige beschermende kleding, waaronder een zuurbestendig schort en zware zuurbestendige handschoenen. Het afval moet zorgvuldig worden gescheiden van organisch afval en op de juiste wijze worden afgevoerd. Om de piranha-zuuroplossing te bereiden, voegt u 75 milliliters geconcentreerd zwavelzuur toe aan een droog bekerglas en voegt u vervolgens voorzichtig 25 milliliters 30% waterstofperoxide toe.

De oplossing warmt snel op tot meer dan 100 °C, waarna de droge dekglasjes gedurende 15 minuten in de oplossing worden ondergedompeld. Na deze incubatie in piranha-oplossing worden de dekglasjes in gezuiverd water gedompeld en vervolgens een minuut aan beide zijden afgespoeld. Droog de dekglasjes daarna met een vacuümbron om het gezuiverde water af te voeren.

Laat de piranha-oplossing afkoelen en voeg deze toe aan de afvalcontainer voor piranha-oplossing, die met een losse dop in de zuurkast staat en duidelijk is gemarkeerd voor het vormen van de dubbellagen. Ons laboratorium maakt gebruik van bi FCS two-kamers, die het voordeel hebben van geïntegreerde verwarming. Het FCS two-systeem bevindt zich op een roestvrijstalen basis die een microfluïdisch manifold klemmet met een bovenste pakking van 0,5 millimeter, een micro-aqueduct-dia die aan één zijde is gecoat met indiumtinoxide voor verwarming en aan de andere zijde een fluïdische groef heeft.

Een stofvrije pakking van 0,25 millimeter die de hoogte van de flowkamer bepaalt en een met piranha gereinigde ronde dekglasplaat van 40 millimeter waarop de dubbellaag wordt gevormd om de flowcel te assembleren en planaire dubbellagen te vormen. Plaats het manifold met de buizen naar boven gericht op een vlak oppervlak. Plaats vervolgens de pakking van 0,5 millimeter met de gaten over de vloeistofbuizen en zorg ervoor dat deze plat aansluit.

Plaats de micro-aqueductdia voorzichtig met de vloeistofkanalen naar boven en zorg ervoor dat deze plat rust zonder neerwaartse druk uit te oefenen, totdat is geverifieerd dat de gaten in de dia zijn uitgelijnd met de microfluïdische buisjes. Leg vervolgens de stofvrije 0,25 millimeter pakking met een rechthoekige uitsparing bovenop de micro-aqueductdia, zodat het kanaal is uitgelijnd met de vloeistofkanalen en er geen grote luchtruimtes aanwezig zijn. Plaats maximaal vijf druppels van 1 µL liposoomsuspensie op het oppervlak van de micro-aqueductdia in een patroon waarbij de afstand van centrum tot centrum tussen elke druppel 2,5 millimeter is. De vijf liposoomdruppels kunnen verschillende samenstellingen hebben, maar in dit geval zullen we slechts twee dubbellagen vormen, één zonder nikkelchelaterende lipiden en één met 10% nikkelchelaterende lipiden.

Zodra deze druppels zijn geplaatst, plaatst u het dekglas voorzichtig in één beweging op het oppervlak en klemt u dit zo snel mogelijk vast aan de basis. De liposoomdruppels moeten contact maken met het dekglas. Dit contact mag niet worden verbroken, aangezien de dubbellagen waarschijnlijk al zijn gevormd en enige verstoringen kunnen leiden tot defecte dubbellagen.

Op dit punt is het belangrijk om te onthouden de posities van de dubbellaagen te markeren met een paar kleine inktstippen op het objectglas, om de positionering van het dekglas op de microscoop te vergemakkelijken. Wacht 20 minuten om er zeker van te zijn dat het systeem geëquilibreerd is; breng vervolgens alle oplossingen over met een spuit van 20 milliliter, verbonden met ongeveer 20 centimeter flexibele slang en een driewegkraan. Een andere poort van de kraan wordt vervolgens via een kort stuk slang verbonden met de flowcel om het dode volume tussen de kraan en de flowcel te minimaliseren.

Vul de spuit met Heis-gebufferde zoutoplossing met magnesiumchloride, calciumchloride, glucose en humaan serumalbumine. Ontlucht de slang en de stopkraan zodat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Sluit dit vervolgens aan op de flowcellen en druk in één beweging vijf milliliter door, terwijl u erop let dat er geen luchtbellen over de dubbellaag passeren.

Nu heeft u uw dubbellagen om de histidine-getagde proteïnen in de dubbellaag te introduceren. Deze moet eerst worden geblokkeerd met caseïne en worden geladen met nikkel. Vul een spuit van één milliliter met de caseïne-nikkelionoplossing en verbind deze met de zijpoort zonder luchtbellen op te vangen.

Wacht na het injecteren van de oplossing 20 minuten om volledige blokkering mogelijk te maken. Spoel vervolgens de blokeringsoplossing uit met H-B-S-H-S-A vanuit de spuit van 20 milliliter. Injecteer nu 0,5 milliliter H-B-S-H-S-A-oplossing die polyhis-getagd ICAM 1 en IEK bevat.

In dit experiment is ICAM-1 gelabeld met SCI-5. De interacties tussen LFA-1 en ICAM-1 kunnen worden gevolgd door de herschikking van ICAM-1 in de dubbellaag in beeld te brengen. Laat het eiwit 30 minuten binden aan de nikkelgeladen dubbellaag terwijl het eiwit zich aan de dubbellaag hecht. Bevestig de flowcel aan de omgekeerde microscoop met behulp van een op maat gemaakte houder voor de objecttafel.

Sluit vervolgens de verwarmingselektronica aan om het systeem te laten equilibreren bij 37 °C. Gebruik de eerder gemaakte markeringen om de flowcel zodanig te positioneren dat het objectief is uitgelijnd met een van de dubbellagen en gebruik interferentiereflectiemicroscopie om het brandvlak te bepalen door te focussen op het gereflecteerde lichtbeeld van het velddiagram. Was ten slotte het ongebonden ICAM-1 uit de flowcellen.

Neem fluorescentiebeelden van de dubbellaag in het ICAM-1-kanaal in zowel turf M- als widefield-modus. Dit dient om de binding van ICAM-1 op de nikkelgecoate dubbellaag te bevestigen ten opzichte van de nikkelvrije dubbellaag. De flowcel is nu klaar om cellen te ontvangen.

Voor deze demonstratie gebruiken we ND T-celreceptor transgene T-cellen die zijn getransduceerd met een retrovirus dat GFP en Zap 70 codeert; was de cellen één keer met HBSS en incubeer de cellen vervolgens met een Alexa 568-gelabeld Fab-fragment tegen de T-celreceptor, zodat we de TCR-microclusters kunnen volgen. Verdun de cellen na 15 minuten 1:10. Hiermee wordt het H 57-antilichaam voldoende verdund zodat het de TIRF-imaging niet verstoort, terwijl de verzadiging van de T-celreceptor behouden blijft naarmate het aanvankelijk gebonden Fab-fragment begint te dissociëren, en injecteer ze vervolgens in de flowcel.

We beelden de immunologische synaps in beeld in three color turf M-modus. Dit omvat de vorming van de LFA-1, ICAM-1 interactie, de vorming van TCR-clusters en de cSMAC, en de aanhoudende vorming van TCR-microclusters die GFP-ZAP 70 rekruteren. Sommige van deze resultaten zijn duidelijk tijdens de acquisitie, terwijl andere post-processing analyse vereisen om volledig te worden gewaardeerd.

Oké, we hebben zojuist gedemonstreerd hoe ondersteunde planaire dubbellagen kunnen worden gebruikt om de immunologische synaps te bestuderen. Voor het slagen van deze experimenten is het essentieel dat de T-cellen in zeer goede conditie zijn; de PPS-gebufferde zoutoplossing is namelijk niet geschikt voor langdurige T-celkweek. U dient de cellen daarom uit de kweek te halen, in dit medium over te brengen en ze vervolgens zeer snel te gebruiken.

Als u langere experimenten wilt uitvoeren, zijn er enkele zeer goede serumvrije mediumformuleringen die u kunt gebruiken als vervanging voor de gefosfateerde zoutoplossing. Dit houdt de cellen veel langer in leven als u langere eindpunten wilt bestuderen, zoals cytokineproductie of proliferatie van de T-cellen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.