Ondersteunde Planar dubbellagen voor de vorming van studie van immunologische synapsen en Kinapse

Hi, ik ben Mike Dustin van het Geral Institute en de New York University School of Medicine. Vandaag neem ik je mee door de procedure van het vormen van ondersteunende planaire Biolay voor het onderzoek van de immunologische synaps. Dus laten we beginnen.

Om de lipide dubbellaag te maken, bereiden we een oplossing van 20% nikkel, chelatiserend lipide en 80% fosfatidyelcholine in de juiste hoeveelheden in een glazen buis met een tot twee milliliter chloroform methaan. De eerste stap is het verdampen van het oplosmiddel onder een stroom stikstofgas in een warm waterbad van 30 tot 37 graden Celsius. Dit duurt meestal ongeveer 15 minuten.

Vervolgens verwijderen we elk resterend oplosmiddel onder hoog vacuüm met behulp van een lyofilisator gedurende 90 minuten. Daarna lossen we de lipiden op in 2% N octaal glucocide detergent in een zoutoplossing om een ​​eindconcentratie van 0,4 millimolair te bereiken. Dit creëert een oplossing van gemengde detergente fosfolipide micellen om liposomen te vormen.

Je dialyseert deze oplossing tegen drie verversingen van tris-zoutoplossing om het detergent te verwijderen en liposomen te vormen. We werken meestal met volumes van ongeveer een milliliter met buisjes met een diameter van zes millimeter met een cutoff van ongeveer 10 kilodalton en zijn voorzichtig om luchtbellen te voorkomen tijdens het klemmen van de buis. We steriliseren deze oplossing en voeren de dialyse uit onder schone omstandigheden en hanteren het met handschoenen gesteriliseerd met 70% ethanol.

Deze oplossing moet kristalhelder zijn en wordt onder Argonne-gas bewaard om oxidatie te voorkomen. Als de oplossing troebel is, dan heb je meerwandige blaasjes gegenereerd en moet je opnieuw beginnen. Om het experiment op te zetten, moeten we eerst bepalen hoeveel ICAM een en MHC op een bepaald oppervlak van een nikkelchelerende dubbellaag worden afgezet bij een bepaalde concentratie van oplosbaar eiwit.

Om dit te doen, zetten we dubbellagen af op glazen staven met een diameter van vijf micrometer. Incubeer de glazen kralen met eiwit oplossingen onder omstandigheden die die in de stroomcellen gebruikt voor beeldvorming benaderen, en lees vervolgens de dichtheid van gebonden eiwit uit door een flow immuno fluorometrische assay. FSI-gelabelde antilichamen met bekende aantallen fluoresceïne per molecuul worden gebruikt om de op het oppervlak gebonden eiwitten te detecteren en fluoresceïne standaardkralen worden gebruikt om de flow micro fluorimeter te kalibreren.

We zullen omstandigheden vaststellen die benaderen die op antigeen presenterende cellen met 200 moleculen per vierkante micrometer van ICAM een en 0,2 tot 20 moleculen per vierkante micrometer van I-E-K-M-C-C 91 1 0 3, complexe planaire dubbellagen vormen zich spontaan wanneer de liposomen versmelten met glas, maar alleen als het goed is schoongemaakt om schoon glas te maken. We gebruiken zure piana-oplossing, een vers bereid mengsel van zwavelzuur en 30% waterstofperoxide, dat al het organische materiaal vernietigt en het glasoppervlak ook zeer hydrofiel achterlaat.

Bij het werken met piranha dragen we volledige beschermende kleding, inclusief een zuurschort en zware zuurbestendige handschoenen. Het afval moet zorgvuldig worden gescheiden van organisch afval en op de juiste manier worden gedisponeerd. Om de zure piranha-oplossing te bereiden, voeg je 75 milliliter geconcentreerd zwavelzuur toe aan een droge beker en voeg je dan voorzichtig 25 milliliter 30% waterstofperoxide toe.

De oplossing warmt snel op tot meer dan 100 graden Celsius, dompel vervolgens de droge dekplaatjes gedurende 15 minuten in de oplossing. Na deze incubatie in piranha, dompel je de dekplaatjes in gezuiverd water en spoel ze dan een minuut lang aan elke kant. Droog vervolgens de dekplaatjes met behulp van een vacuümbron om het gezuiverde water af te tappen.

Laat de piranha-oplossing afkoelen en voeg toe aan de piranha-afvalcontainer, die met een losse dop wordt achtergelaten, goed gemarkeerd in de afzuigkap om de dubbellagen te vormen. Ons lab gebruikt bi FCS twee kamers, die de voordelen hebben van geïntegreerde verwarming. Het FCS twee systeem staat op een roestvrij stalen basis die een microfluïdische manifold met een 0,5 millimeter bovenste afdichting vastklemt, een micro aquaduct glijbaan bedekt met indium tin oxide voor verwarming aan één kant en met een vloeibare groef aan de andere kant.

Een stofvrije 0,25 millimeter afdichting die de hoogte van de stroomkamer definieert en de piranha gereinigde 40 millimeter ronde dekplaat waarop de dubbellaag wordt gevormd om de stroomcel te assembleren en planaire dubbellagen te vormen. Plaats de manifold met de buizen omhoog gericht op een vlakke ondergrond. Plaats vervolgens de 0,5 millimeter afdichting met gaten gepositioneerd over de vloeistofbuizen en zorg ervoor dat deze vlak zit.

Plaats voorzichtig de micro aquaduct glijbaan met de vloeistofkanalen naar boven en zorg ervoor dat deze vlak zit zonder enige neerwaartse druk toe te passen totdat je verifieert dat de gaten in de glijbaan de microfluïdische buizen uitlijnen. Leg vervolgens de stofvrije 0,25 millimeter afdichting met een rechthoekige uitsparing op de micro aquaduct glijbaan zodat het kanaal is uitgelijnd met de vloeistofkanalen en er geen grote luchtruimen zijn. Plaats zoveel als vijf een microliter druppels liposoom suspensie op het oppervlak van de micro aquaduct glijbaan in een patroon zodat de afstand tussen het middelpunt van elke druppel 2,5 millimeter is. De vijf liposoom druppels kunnen verschillende samenstellingen hebben, maar in dit geval zullen we slechts twee dubbellagen vormen, een met geen nikkelchelerende lipiden en een met 10% nikkelchelerende lipiden.

Zodra deze druppels op hun plaats zijn, plaats je voorzichtig het dekplaatje in één beweging op het oppervlak, klem het zo snel mogelijk vast aan de basis. De liposoom druppels moeten contact maken met het dekplaatje. Dit contact mag niet worden verbroken, omdat de dubbellagen waarschijn