Podział komórek

1. Obserwacja cyklu komórkowego w wierzchołku korzenia Expand
   • Hipotezy: Hipoteza eksperymentalna jest taka, że w wycinkach wierzchołków korzeni, które zostały potraktowane nokodazolem, substancją chemiczną, która zakłóca polimeryzację mikrotubularną, wszystkie komórki zostaną zatrzymane na tym samym etapie cyklu komórkowego, a w nieleczonych plasterkach końcówki cebuli wszystkie różne etapy cyklu komórkowego zostaną zwizualizowane. Hipoteza zerowa jest taka, że nie będzie różnic w mitozie między dwiema grupami i że zostaną uwidocznione różne etapy cyklu komórkowego.
   • Aby przygotować się do tego eksperymentu, użyjesz cebuli, która została umieszczona w wodzie na kilka dni, aż zaczną kiełkować nowe białe wierzchołki korzeni. Za pomocą żyletki odetnij 1 cm kawałek od końca jednej z końcówek korzeni.
   • Umieść plasterek cebuli w probówce mikrowirówki oznaczonej jako "N" dla stanu nokodazolu.
   • Następnie odetnij drugi 1 cm kawałek wierzchołka korzenia cebuli i umieść w probówce do mikrowirówki oznaczonej "C" dla warunków kontrolnych.
   • Dodać 2 μl 5 mg/ml nokodazolu do 1 ml wody w probówce mikrowirówki oznaczonej N i 1 ml wody tylko do probówki oznaczonej C.
   • Pozostaw probówki zawierające końcówki korzeni do inkubacji na 12 godzin i przetrzyj miejsce pracy 70% etanolem.
   • Po zakończeniu inkubacji ustaw blok grzewczy na 60 ºC.
   • Umyj końcówki nasączone nokodazolem wodą, a następnie odessaj płyn.
   • Powtórz to pranie jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.
   • Napełnij obie probówki 1 ml jednego normalnego kwasu solnego. Inkubować probówki w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C przez 12-15 minut, a następnie wyrzucić kwas do kolby na odpady.
   • Teraz dodaj 1 ml destylowanej wody kroplami do probówek co najmniej trzy razy, aby przepłukać próbki.
   • Teraz dodaj jeden mikrolitr barwnika DAPI do 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   • Następnie umieść 50 μl tej rozcieńczonej barwnika DAPI w każdej probówce i pozostaw je w temperaturze pokojowej do inkubacji przez 12 minut.
   • Następnie przygotuj trzy płukania wodą destylowaną, jak w kroku 10.
   • Oznacz jeden preparat mikroskopowy jako 'Kontrola', a drugi jako 'Nocodazol'.
   • Przenieś wybarwione korzenie na odpowiednie szkiełka mikroskopowe i dodaj kroplę wody do szkiełka kontrolnego i kroplę nokodazolu do szkiełka nokodazolowego.
   • Użyj żyletki, aby usunąć niepoplamione części każdej końcówki korzenia i umieść szklaną osłonę na każdej próbce.
   • Ostrożnie dociśnij każde szkiełko nakrywkowe opuszkiem palca w rękawiczce, a następnie pozostaw szkiełka na 10 minut.
   • Na koniec obejrzyj slajdy pod obiektywem 40X mikroskopu fluorescencyjnego i zrób obrazy preparatów komórek wierzchołka korzenia.
2. Zrozumienie utraty kontroli nad cyklem komórkowym Expand
   • UWAGA: Zanim komórki będą mogły przejść przez wszystkie etapy cyklu komórkowego, muszą przejść kilka punktów kontrolnych. Te punkty kontrolne są regulowane przez cyklinę i białka kinazy zależnej od cyklin lub CDK. Jeśli cykliny i CDK stwierdzą, że poprzednie zdarzenia komórkowe nie zostały odpowiednio zakończone, zatrzymają komórki na tym etapie i zapobiegną ich proliferacji. W komórkach nowotworowych jedno lub kilka z tych molekularnych ograniczeń regulujących podział komórek zostaje utraconych, co pozwala uszkodzonym komórkom uciec spod kontroli proliferacji komórek. Te nieprawidłowe komórki przekształcają się w guzy, które są masą niekontrolowanie proliferujących komórek, które zakłócają normalne funkcje organizmu. Zauważ, że zanim się podzieli, ta komórka rakowa zaokrągla się i bardzo silnie załamuje światło pod mikroskopem świetlnym. Dzieje się tak, ponieważ nie wszystkie komórki rakowe z powodzeniem dzielą się na komórki potomne po każdej rundzie mitozy. Oznacza to, że często zawierają nadmiar organelli i DNA, a ten wzrost zawartości komórkowej oznacza, że będą załamywać światło intensywniej niż robią to normalne komórki.
3. Wyniki Expand
   • Zbadaj zebrane obrazy i zapisz w Tabeli 1 różne struktury komórkowe i etapy, które można zidentyfikować w plastrze końcówki cebuli, który został potraktowany nokodazolem. Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 1
   • Jeśli są jakieś komórki przechodzące mitozę, zwróć uwagę, jakie etapy podziału komórek widzisz.
   • Zapisz procent komórek w każdym etapie mitozy w Tabeli 1.
   • Następnie przyjrzyj się obrazom nieleczonego plasterka wierzchołka cebuli i zapisz, jakie struktury komórkowe możesz zidentyfikować.
   • Jeśli są jakieś komórki przechodzące mitozę, zastanów się, jakie etapy podziału komórek widzisz, i zapisz procentowy udział komórek w każdym etapie mitozy w Tabeli 1.

Hipoteza eksperymentalna jest taka, że w plasterkach wierzchołków korzeni, które zostały potraktowane nokodazolem, substancją chemiczną zakłócającą polimeryzację mikrotubularną, wszystkie komórki zostaną zatrzymane na tym samym etapie cyklu komórkowego, a w nietraktowanych plasterkach końcówki cebuli wszystkie różne etapy cyklu komórkowego zostaną uwidocznione. Hipoteza zerowa jest taka, że nie będzie różnic w mitozie między dwiema grupami i że zostaną uwidocznione różne etapy cyklu komórkowego. Aby przygotować się do tego eksperymentu, użyjesz cebuli, która została umieszczona w wodzie na kilka dni, aż zaczną kiełkować nowe białe końcówki korzeni.

Użyj żyletki, aby odciąć centymetrowy kawałek od końca jednej z końcówek korzeni. Umieść plasterek cebuli w probówce do mikrowirówki oznaczonej N dla stanu nokodazolu. Następnie odetnij drugi centymetrowy kawałek wierzchołka korzenia cebuli i umieść w probówce do mikrowirówki oznaczonej jako C dla warunków kontrolnych.

Dodaj dwa mikrolitry po pięć miligramów na mililitr nokodazolu do jednego mililitra wody w probówce do mikrowirówki oznaczonej N i jeden mililitr wody do probówki oznaczonej C. Pozostaw probówki zawierające końcówki korzeni do inkubacji przez 12 godzin i przetrzyj miejsce pracy 70% etanolem. Po zakończeniu inkubacji ustaw blok grzewczy na 60 stopni Celsjusza. Końcówki nasączone nokodazolem należy przepłukać wodą, a następnie odessać płyn.

Powtórz to pranie dwa razy, w sumie trzy prania. Napełnij obie probówki jednym mililitrem jednego normalnego kwasu solnego. Inkubować probówki w bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 12 do 15 minut, a następnie wyrzucić kwas do kolby na odpady i dodać jeden mililitr destylowanej wody kroplami do probówek co najmniej trzy razy, aby przepłukać próbki.

Teraz dodaj jeden mikrolitr barwnika DAPI do 10 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Następnie umieść 50 mikrolitrów rozcieńczonej plamy DAPI w każdej probówce i pozostaw je w temperaturze pokojowej do inkubacji przez 12 minut. Po tym przygotowaniu trzy destylowane wody płucze, jak właśnie pokazano.

Oznacz jeden szkiełko mikroskopowe jako kontrolny, a drugi jako nokodazol. Przenieś wybarwione korzenie na odpowiednie szkiełka mikroskopowe i dodaj kroplę wody do szkiełka kontrolnego i kroplę nokodazolu do szkiełka nokodazolowego. Użyj żyletki, aby usunąć niepoplamione części każdej końcówki korzenia i umieść szklaną osłonę na każdej próbce.

Ostrożnie dociśnij każde szkiełko nakrywkowe opuszkiem palca w rękawiczce, a następnie pozostaw szkiełka na 10 minut. Na koniec obejrzyj szkiełka pod 40-krotnym obiektywem mikroskopu świetlnego lub fluorescencyjnego i uchwyć obrazy preparatów komórek wierzchołka korzenia. Zanim komórki będą mogły przejść przez wszystkie etapy cyklu komórkowego, musi przejść kilka punktów kontrolnych.

Te punkty kontrolne są regulowane przez cyklinę i białka kinazy zależnej od cyklin lub CDK. Jeśli cykliny i CDK stwierdzą, że poprzednie zdarzenia komórkowe nie zostały odpowiednio zakończone, zatrzymają komórki na tym etapie i zapobiegną ich proliferacji. W komórkach nowotworowych jedno lub kilka z tych molekularnych ograniczeń regulujących podział komórek zostaje utraconych, co pozwala uszkodzonym komórkom uciec spod kontroli proliferacji komórek.

Te nieprawidłowe komórki przekształcają się w guzy, które są masą niekontrolowanie proliferujących komórek, które zakłócają normalne funkcje organizmu. Zauważ, że zanim się podzieli, ta komórka rakowa zaokrągla się i bardzo silnie załamuje światło pod mikroskopem świetlnym. Dzieje się tak, ponieważ nie wszystkie komórki rakowe z powodzeniem dzielą się na komórki potomne po każdej rundzie mitozy.

Oznacza to, że często zawierają nadmiar organelli i DNA, a ten wzrost zawartości komórkowej oznacza, że będą załamywać światło intensywniej niż robią to normalne komórki. Teraz, gdy wszystkie dane zostały zebrane, spójrzmy na nasze wyniki. Jakie struktury komórkowe można zidentyfikować w plasterku wierzchołka cebuli, który był traktowany nokodazolem?

Czy jakieś komórki przechodzą mitozę? Jakie etapy podziału komórek widzisz? Zapisz w tabeli procent komórek na każdym etapie mitozy.

Następnie spójrz na nieprzetworzony plasterek cebuli. Jakie struktury komórkowe możesz zidentyfikować? Czy jakieś komórki przechodzą mitozę?

Jakie etapy podziału komórek widzisz? Zapisz w tabeli procentową zawartość komórek na każdym etapie mitozy. Zauważył Pan/Pani, że większość komórek w plasterkach cebuli poddanych działaniu nokodazolu znajduje się na tym samym etapie mitozy ze względu na właściwości zaburzające mikrotubule odczynnika, które zapobiegają tworzeniu się włókien wrzeciona, a następnie segregacji chromosomów i podziałowi komórek.

Wiele różnych etapów mitozy jest widocznych w komórkach nieleczonego wycinka, jednak ponieważ mitoza jest procesem ciągłym w zdrowych organizmach.