Aktywność enzymatyczna
- Podstawowy eksperyment enzymatyczny z peroksydazą
- Aby rozpocząć, należy określić punkt odniesienia dla reakcji enzymatycznej peroksydazy. Przygotuj substrat, dodając 7 ml wody destylowanej do czystej probówki, a następnie dodaj 0,2 ml gwajakolu. Uwaga: Gwajakol jest wskaźnikiem zmieniającym kolor, który staje się bardziej żółto-pomarańczowy w miarę postępu reakcji enzymatycznej.
- Następnie dodaj 0,3 ml 0,1% H2O2.
- Za pomocą markera oznacz podłoże probówki, a następnie przykryj probówkę kawałkiem folii uszczelniającej.
- Trzymając pokrywę na miejscu, odwróć rurkę cztery razy, aby wymieszać zawartość tuby.
- W drugiej probówce dodaj 6,0 ml wody destylowanej i 1,5 ml peroksydazy rzepy i oznacz tę probówkę jako "Enzym".
- Przykryj tę probówkę nowym kawałkiem folii uszczelniającej i wymieszaj te roztwory przez cztery inwersje, jak opisano wcześniej (krok 4).
- Gdy obie probówki zostaną wymieszane, umieść minutnik na stole, obok stojaka na probówki, a następnie wlej zawartość z probówki z substratem do probówki, uważając, aby nie rozlać żadnego płynu.
- Następnie przelej całą objętość z probówki enzymatycznej z powrotem do probówki z substratem, aby dokładnie wymieszać roztwory i przykryj probówkę z substratem kolejnym kawałkiem folii uszczelniającej.
- Umieść probówkę w stojaku i uruchom stoper.
- Obserwuj kolor w probówce z substratem po 0, 1, 2, 3, 4 i 5 minutach, po mieszaniu.
- Aby określić ilościowo względną zmianę koloru i szybkość reakcji, dopasuj obserwowany kolor do najbliższego koloru w wzorcu. UWAGA: Zrobienie zdjęcia obserwowanej intensywności koloru w każdym punkcie próbkowania może ułatwić rejestrowanie wyników.
- Zapisz kolory, które widzisz w tabeli. Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę 1
- Badanie wpływu pH na aktywność peroksydazy
- HIPOTEZY: W tym ćwiczeniu hipoteza eksperymentalna zakłada, że szybkość reakcji osiągnie maksimum lub optimum przy neutralnym pH w średnim zakresie i że te szybkości będą wyższe lub mniej więcej równe szybkości wyjściowej. Hipoteza zerowa jest taka, że nie będzie różnic w szybkości reakcji między wartością wyjściową a leczeniem pH.
- Najpierw oznacz sześć czystych probówek dla każdego z sześciu poziomów buforu pH 3 - 8 i słowo "Enzym".
- Następnie dodaj 6 ml odpowiednich roztworów buforowych pH dostarczonych przez instruktora do każdej z probówek.
- Następnie dodaj 1,5 ml peroksydazy rzepy do każdej probówki, uważając, aby nie zanieczyścić zakraplacza roztworem buforowym.
- Przykryj probówki enzymatyczne folią uszczelniającą i delikatnie odwróć każdą probówkę, aby wymieszać zawartość probówki.
- Jak opisano w podstawowym eksperymencie reakcji, przygotuj substraty dla tych reakcji, dodając 7 ml wody destylowanej, 0,2 ml gwajakolu i 0,3 ml 0,1% H2O2 do sześciu nowych czystych probówek.
- Następnie oznacz sześć dodatkowych czystych probówek poziomami pH 3 - 8 i słowem "Roztwór" i przygotuj minutnik.
- Pracując szybko, wlej probówkę z substratem i probówkę pH do odpowiedniej probówki z roztworem. Powtórz ten krok dla każdego z różnych poziomów pH.
- Następnie przykryj probówki folią uszczelniającą i wymieszaj każdą probówkę z czterema inwersjami. Umieść każdą probówkę w stojaku na tubki, gdy są wymieszane.
- Obserwuj kolor w każdej probówce o godzinie 0 i natychmiast uruchom stoper. Kontynuuj obserwację koloru w każdej probówce w odstępach minutowych, do 5 minut.
- Na każdym interwale użyj kodu koloru w normie, aby zapisać obserwowane kolory w swojej tabeli.
- Badanie wpływu temperatury na aktywność peroksydazy
- HIPOTEZY: W tym ćwiczeniu hipoteza eksperymentalna jest taka, że szybkość reakcji osiągnie optimum powyżej temperatury pokojowej lub 23 °C, ale poniżej szybkości denaturacji enzymów i że ta maksymalna szybkość będzie wyższa niż szybkość wyjściowa. Hipoteza zerowa jest taka, że nie będzie różnic w szybkości reakcji między linią bazową a obróbką temperaturową.
- Napełnij zlewkę o pojemności 800 ml mniej więcej do połowy górnej krawędzi lodem i wlej zimną wodę do zlewki, aby stworzyć kąpiel lodową. Oznacz tę zlewkę jako "Lód".
- Następnie oznacz cztery nowe zlewki o pojemności 600 ml tymi samymi temperaturami, co probówki z substratem i dodaj do każdej z nich 150 ml wody z kranu.
- Używając płyty grzejnej i termometru, doprowadź zlewki do temperatury 25, 35, 45 i 60 °C, zgodnie z ich etykietami.
- Przygotuj pięć dodatkowych par substratu i probówek enzymatycznych, zgodnie z opisem dla reakcji podstawowej, używając wody destylowanej w probówce z enzymami, zamiast buforu pH.
- Oznacz probówki z podłożem jako "Lód", "25 °C", "35 °C", "45 °C" i "60 °C".
- Gdy wszystkie kąpiele wodne osiągną odpowiednie temperatury, wymieszaj ze sobą substrat i roztwory enzymów, najpierw wlewając zawartość każdej probówki z substratem do probówki z enzymem, a następnie wlewając zawartość probówki z enzymem z powrotem do probówki z substratem.
- Przykryj rurki z podłożem folią uszczelniającą i obserwuj kolory w czasie 0.
- Następnie umieść probówki w odpowiednich kąpielach w zlewkach, w oparciu o etykietę temperatury, którą otrzymała każda probówka i uruchom stoper.
- Dla każdego 1-minutowego interwału wyjmij rurki z wody i zapisz ich kolor, używając stabdard jako odniesienia.
- Następnie umieść je w ich kąpielach, aż każdy punkt czasowy, do 5 minut, zostanie zarejestrowany.
- Wyniki
- Aby określić linię bazową dla reakcji, narysuj wykres zmiany intensywności koloru w czasie. UWAGA: Liczba jednostek, o które kolor wzrósł w ciągu 5 minut, posłuży jako podstawowa szybkość reakcji do porównania względnego.
- Teraz narysuj różnicę w intensywności koloru w stosunku do poziomów pH użytych w pierwszym eksperymencie.
- Dodaj linię bazową do porównania, a następnie określ, czy optymalna szybkość reakcji była wyższa niż, niższa lub równa linii bazowej.
- Korzystając z tego wykresu, określ optymalne pH dla reakcji. Uwaga: Reakcja może nie zachodzić przy każdym pH. Optymalne pH dla enzymu peroksydazy mieści się zazwyczaj w zakresie 6 - 7. Wystawiając enzym na działanie substratu o różnych poziomach pH, zauważysz spadek szybkości reakcji, ponieważ pH enzymu staje się bardziej zasadowe, co sprawia, że enzym jest bardziej niestabilny.
- Na koniec narysuj na wykresie różnicę w intensywności kolorów w czasie dla różnych temperatur użytych w drugim eksperymencie, używając tej samej linii bazowej do porównania.
- Korzystając z tego wykresu, określ optymalną temperaturę dla reakcji i porównaj ją z linią bazową. UWAGA: Reakcja może nie zachodzić w każdej temperaturze. W tym eksperymencie reakcja wydaje się najbardziej efektywna około 45 °C, a powyżej tej wartości enzym peroksydazy zaczyna się denaturować. Z tego powodu nie powinien powodować zmiany koloru w zlewce o temperaturze 60 °C. Szybkość reakcji również zwolni lub zatrzyma się w łaźni lodowej, ponieważ nie ma wystarczającej ilości energii, aby enzym mógł katalizować reakcję.