How does mobile phase composition affect compound separation in thin-layer chromatography?

Mobile phase polarity directly influences how far compounds travel on the stationary phase. Pure hexane, an apolar solvent, causes polar compounds like phenol and benzoic acid to move minimally, preventing effective separation. A 60/40 hexane-ethyl acetate mixture, moderately polar, allows compounds to travel farther and space farther apart, enabling better differentiation based on their individual polarities.

What does the Rf value tell you about a compound in TLC?

The Rf value is the ratio of the distance a compound travels from the starting line to the distance the solvent front travels. It quantifies how strongly a compound interacts with the stationary phase relative to the mobile phase. Compounds with lower Rf values have higher affinity for silica gel, while those with higher Rf values interact more strongly with the mobile phase and travel farther.

Why is proper TLC plate handling important before spotting compounds?

TLC plates must be held only by their edges or top with tweezers to prevent damaging or contaminating the silica gel layer. Chips or scratches in the silica gel compromise separation quality and can cause irregular solvent flow. Undamaged plates ensure consistent, reliable results when you apply samples and develop the chromatogram.

How do you identify an unknown compound using reference standards on TLC?

Run the unknown sample alongside reference compounds on the same TLC plate using the same mobile phase. After development and visualization, compare the unknown's spot position and Rf value to those of the reference standards. If the unknown's spot aligns with a reference spot, that compound is present. Multiple spots indicate a mixture of compounds.

What is the purpose of using UV light and iodine vapor to visualize TLC plates?

UV light reveals compounds through fluorescent markers in the silica gel, making spots visible as dark areas against a glowing green background. Iodine vapor creates brown and yellow spots by reacting with organic compounds, providing an alternative visualization method. Using both techniques ensures comprehensive spot detection and accurate compound identification.

Why must the solvent level be below the sample spots when developing a TLC plate?

If the solvent level contacts the spots initially, capillary action will draw solvent directly into the samples, causing them to dissolve and spread excessively. This ruins the separation and makes accurate measurements impossible. Proper solvent positioning ensures samples migrate upward through the stationary phase in a controlled, predictable manner.

How does compound polarity relate to separation on a polar stationary phase?

On polar silica gel, less polar compounds have lower affinity and travel farther, while more polar compounds bind strongly and travel less. Benzoic acid, the most polar compound tested, showed the lowest Rf value, whereas butyl phenyl ether, the least polar, showed the highest. This inverse relationship between polarity and distance traveled enables effective separation and identification.

Chromatografia cienkowarstwowa

Koncepcje Przygotowanie instruktora Protokół studencki

0 wyświetleń03:07 min

Chromatografia cienkowarstwowa lub TLC to technika stosowana do rozdzielania związków organicznych na podstawie różnic w ich polarności. System TLC składa się z trzech elementów: fazy stacjonarnej, substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika rozwojowego.

Faza stacjonarna to powierzchnia, na której zostaną oddzielone związki, która zwykle składa się z wyjątkowo polarnego żelu krzemionkowego. Analizowane związki lub mieszaniny są substancjami rozpuszczonymi. Rozcieńczone roztwory substancji rozpuszczonych są nakrapiane na jednej krawędzi płytki za pomocą cienkich kapilarni.

Dno płytki jest następnie zanurzane w rozpuszczalniku wywołującym, który jest zwykle rozpuszczalnikiem organicznym, który jest mniej polarny niż faza stacjonarna. Rozpuszczalnik przemieszcza się w górę płytki poprzez działanie kapilarne. Gdy rozpuszczalnik przechodzi przez plamy substancji rozpuszczonej, niesie ze sobą część każdej substancji rozpuszczonej. Ta mieszanina substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika jest fazą ruchomą.

Górna część fazy ruchomej nazywana jest frontem rozpuszczalnika. Gdy faza ruchoma przemieszcza się w górę płytki, cząsteczki substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika tymczasowo przyklejają się do fazy stacjonarnej w oparciu o ich polarność.

Bardziej polarne substancje rozpuszczone są silnie przyciągane do fazy stacjonarnej, więc częściej się przyklejają i pozostają zablokowane przez jakiś czas. Mniej polarnych substancji rozpuszczonych przykleja się rzadziej i nie pozostaje zablokowane na długo. Oznacza to, że mniej substancji rozpuszczonych polarnie spędza więcej czasu w fazie ruchomej niż substancje rozpuszczone bardziej polarnie. Innymi słowy, mniej polarnych substancji rozpuszczonych przemieszcza się szybciej niż więcej polarnych substancji rozpuszczonych.

Aby uzyskać dobrą separację między związkami, rozpuszczalnik powinien być wystarczająco polarny, aby poruszać najbardziej polarną substancją rozpuszczoną. Oto kilka popularnych rozpuszczalników w kolejności zwiększania polarności. Czasami dwa rozpuszczalniki są łączone, aby uzyskać pożądaną polarność.

Ponieważ większość związków organicznych jest biała lub bezbarwna, płytki TLC zwykle zawierają związek fluorescencyjny. W świetle UV związki organiczne pojawią się jako ciemne plamy na świecącej płytce.

Po wizualizacji związków można zmierzyć, jak daleko się przebyły i obliczyć współczynnik opóźnienia lub R_f dla każdego z nich. Wartość ta jest odległością przebytą przez substancję rozpuszczoną podzieloną przez całkowitą odległość przebytą przez fazę ruchomą.

Jeśli rozpuszczalnik zostanie odpowiednio dobrany, każda substancja rozpuszczona będzie miała wyraźnie inny R_f. Dzięki temu możemy zidentyfikować związki składowe w mieszaninach poprzez dopasowanie wartości R_fdo znanych związków.

W tym laboratorium użyjesz TLC do określenia R_f kilku znanych związków, a następnie użyjesz tych wartości_{R f} do określenia tożsamości nieznanego związku.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Lara Al Hariri i Ahmed Basabrain z University of Massachusetts Amherst, MA, USA

Wpływ kompozycji fazy ruchomej na separację związków
W tej części laboratorium użyjesz TLC, aby porównać, jak dobrze czysty heksan i mieszanina 60% heksanu i 40% octanu etylu mogą oddzielić fenol, kwas benzoesowy i eter butylofenylowy, mierząc odległość, jaką związek przebył w każdym rozpuszczalniku.
- Przed rozpoczęciem laboratorium załóż fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe. Uwaga: Heksan i octan etylu są lotne, toksyczne i łatwopalne, dlatego zawsze pracuj z nimi w dygestorium. Zmień rękawice, jeśli dostaniesz na nie rozpuszczalnik, ponieważ heksan i octan etylu przenikną do rękawic nitrylowych w ciągu kilku minut.
- Teraz weź ręcznik papierowy i połóż go na blacie. Ostrożnie podnieś płytkę TLC za pomocą pęsety na samym końcu płytki. nuta: Zawsze trzymaj płytki TLC za krawędzie lub na samej górze pęsetą, aby uniknąć uszkodzenia lub zanieczyszczenia żelu krzemionkowego.
- Poszukaj odprysków lub zadrapań w żelu krzemionkowym i zdobądź nową płytkę, jeśli to konieczne. W porządku, jeśli jest trochę odprysków tylko na jednym końcu, ponieważ może to być góra.
- Umieść talerz na ręczniku papierowym w swoim dygestorii i połóż obok niego linijkę metryczną. Za pomocą ołówka grafitowego delikatnie narysuj mały znak na żelu krzemionkowym ~1 cm od górnej części płytki. Napisz "100" na tabliczce nad znakiem.
- Następnie delikatnie zaznacz tabliczkę 1 cm nad dnem po obu stronach. Ostrożnie narysuj linię prostą między dolnymi znakami, aby wyznaczyć linię startu.
- Następnie dodaj 3 równomiernie rozmieszczone małe znaki do linii startowej, tak aby zewnętrzne znaki znajdowały się co najmniej 0,5 cm od boków płyty. nuta: Ważne jest, aby żel krzemionkowy był tutaj nieuszkodzony, więc jeśli porysujesz go ołówkiem, przygotuj nową płytkę.
- Teraz prześledź kontur płytki TLC w swoim notatniku laboratoryjnym i dokładnie skopiuj znaki na płycie. Oznacz te trzy znaki jako "fenol", "kwas benzoesowy" i "eter butylofenylowy". Możesz również oznaczyć znaki na samej tabliczce.
- Przygotuj drugą płytkę TLC oznaczoną '60/40' w ten sam sposób. Teraz przynieś oznaczone płytki na wspólną ławkę i zlokalizuj roztwory fenolu, kwasu benzoesowego i eteru butylofenylowego o stężeniu 1 mg / ml w etanolu.
- Zanurz czystą kapilarnę w jednym z trzech roztworów. Krótko i lekko przetrzyj kapilatę prostopadle do punktu przecięcia między linią startu a znakiem tego związku. Powinieneś zauważyć dwa razy dla każdego związku.
- Użyj tej samej kapilary, aby dostrzec ten sam roztwór na swojej drugiej płytce TLC. Plamy nie powinny mieć więcej niż 2 mm średnicy. Następnie należy wyrzucić naczynia włosowate i zamknąć fiolkę.
- Znajdź pozostałe dwa roztwory na płytkach, w ten sam sposób, używając czystych naczyń włosowatych. Należy uważać, aby nie zanieczyścić krzyżowo roztworów. Uwaga: Jeśli plamka jest bardzo jasna lub bardzo mała, poczekaj, aż wyschnie, a następnie umieść ten sam roztwór na suchym miejscu. Jeśli plamka jest nadal mokra, działanie kapilarne może sprawić, że będzie zbyt szerokie i rozcieńczone.
- Gdy zrobisz trzy plamki na każdej płytce, wyrzuć naczynia włosowate i przynieś płytki z powrotem do swojego kaptura. Trzymaj talerze płasko leżąc do wyschnięcia.
- Teraz oznacz słoik o pojemności 50 ml jako '100% hexanu' i przynieś słoik, jego nakrętkę i 10-mililitrowy cylinder z podziałką do okapu rozpuszczalnika.
- Odmierz 2 – 3 ml czystego heksanu za pomocą swojego butla z podziałką i wlej go do słoika, aby napełnić go na głębokość 0,62 – 0,7 cm. Zakręć butelkę i słoik i wróć do swojego dygestorium.
- Oznacz drugi słoik o pojemności 50 ml jako '60% heksan, 40% octanu etylu' i przynieś go wraz z czystym cylindrem z podziałką do okapu rozpuszczalnika. Odmierz 2 – 3 ml mieszanki 60/40 do słoika i wróć do dygestorium.
- Ustaw talerze obok słoików, aby porównać względne położenie rozpuszczalnika i plam. Poziom rozpuszczalnika powinien znajdować się poniżej plam dla każdej płytki.
- Następnie weź trzy kawałki bibuły filtracyjnej, połóż bibułę filtracyjną pionowo pod ścianą w każdym słoiku, a następnie szczelnie zakręć słoiki.
- Inicjuj każdą tabliczkę powyżej znaku, abyś mógł je później zidentyfikować. Upewnij się, że bibuły filtracyjne w słoikach nasyciły się rozpuszczalnikiem i że plamy na płytkach są całkowicie suche.
- Teraz otwórz słoik ze 100% heksanem i użyj pęsety, aby delikatnie umieścić płytkę 100 w słoiku, utrzymując płytkę na poziomie powierzchni rozpuszczalnika, gdy wchodzi do rozpuszczalnika. Zamknij szczelnie słoik, uważając, aby nie potrząsnąć talerzem.
- Pozostaw słoik nieruchomo, podczas gdy rozpuszczalnik przemieszcza się w górę płytki. Wywołanie w czystym heksanie trwa zwykle około 7 – 10 minut. Miej oko na płytkę, aby upewnić się, że rozpuszczalnik nie dotrze do góry.
- Gdy czoło rozpuszczalnika z czystego heksanu znajduje się około 1 cm od górnej krawędzi płytki, odzyskaj go za pomocą pęsety. Połóż go na ręczniku papierowym żelem krzemionkowym skierowanym do góry i szybko zaznacz przód rozpuszczalnika linią i ołówkiem w poprzek płytki. Pozostaw płytkę leżącą płasko, gdy rozpuszczalnik odparuje.
- Umieść drugą płytkę w eluencie 60/40 w ten sam sposób. Poczekaj, aż czoło rozpuszczalnika płytki 60/40 znajdzie się około 1 cm od góry, a następnie wyjmij go i szybko oznacz przód rozpuszczalnika w ten sam sposób.
- Gdy 100% płytka heksanowa całkowicie wyschnie, podnieś ją pęsetą i przynieś wraz z ołówkiem do lampy UV na wspólnej ławce.
- Umieść płytkę pod lampą i oświetl ją światłem UV. Płytka będzie świecić na zielono z powodu markera fluorescencyjnego w warstwie żelu krzemionkowego. Ciemne plamy to związki.
- Ostrożnie obrysuj ołówkiem każde miejsce, nawet jeśli nie posunęło się zbyt daleko.
- Następnie wyłącz lampę i przynieś swój talerz do okapu do produkcji jodu. Otwórz komorę jodową. Za pomocą pęsety delikatnie umieść płytkę pionowo w komorze jodowej, a następnie ponownie przykryj komorę.
- Poczekaj 3 – 4 minuty, aż opary jodu pozostaną w miejscach. Następnie wyjmij płytkę pęsetą, zamknij komorę i obrysuj brązowe i żółte plamy na talerzu. Te plamy zbledną, więc zaznacz je szybko.
- Wizualizuj suchą płytkę 60/40 pod wpływem światła UV, a następnie z oparami jodu w ten sam sposób. nuta: Aby uniknąć reakcji ubocznych, zawsze sprawdzaj płytki w świetle UV przed wystawieniem ich na działanie jodu.
- Teraz precyzyjnie skopiuj plamy i czoła rozpuszczalnika na odpowiednie rysunki płytek w swoim notatniku laboratoryjnym. Dla każdej płytki zmierzyć i zapisać wysokość czoła rozpuszczalnika w stosunku do linii początkowej.
- Na koniec, zmierz odległość między środkiem każdego miejsca a jego linią startu i zapisz to w swoim notatniku laboratoryjnym. Możesz teraz przejść do następnej części laboratorium.
Identyfikacja nieznanego związku
W drugiej połowie laboratorium użyjesz TLC, aby dowiedzieć się, co znajduje się w nieznanym leku przeciwbólowym. Może zawierać jeden lub więcej z tych związków: aspirynę, kofeinę i paracetamol. Związki te są wysoce polarne, więc jako eluentu użyjesz gotowej mieszanki 90% octanu etylu i 10% heksanu.

Na tej samej płycie umieścisz trzy związki referencyjne i nieznane. Później użyjesz wartości Rf związków referencyjnych, aby zidentyfikować nieznane. Najpierw dokładnie sprawdź, jaki nieznany materiał został Ci przydzielony do analizy przed rozpoczęciem.
- Teraz połóż czysty ręcznik papierowy w kapturze i zdobądź nową płytkę TLC. Przygotuj górny znak i linię startu w taki sam sposób jak poprzednio. Wykonaj cztery równomiernie rozmieszczone znaczniki na talerzu, upewniając się, że zewnętrzne znaczniki znajdują się w odległości co najmniej 0,5 cm od krawędzi.
- Narysuj dokładną kopię tabliczki w swoim zeszycie laboratoryjnym i oznacz znaczniki jako 'aspiryna', 'paracetamol', 'kofeina' i 'nieznany'.
- A teraz przynieś swój talerz na wspólną ławkę. Znajdź roztwory aspiryny, paracetamolu, kofeiny i nieznanego, które zostały Ci przypisane na odpowiednich znakach, używając czystej kapilary dla każdego roztworu. nuta: Kiedy zauważysz nieznany roztwór, nie zanurzaj kapilary zbyt głęboko w fiolce z roztworem, aby uniknąć zatkania kapilary nierozpuszczalnym materiałem z nieznanej substancji.
- Odrzuć naczynia włosowate i zamknij fiolki przed przyniesieniem płytki z powrotem do dygestoriów. Umieść talerz na ręczniku papierowym, aby zakończyć suszenie.
- Następnie oznacz czysty słoik z nakrętką o pojemności 50 ml '90% octan etylu, 10% heksan' i przynieś go do czystego cylindra z podziałką do okapu rozpuszczalnika.
- Umieść 2 – 3 ml roztworu 90/10 w słoiku i wróć do swojego dygestoria. Upewnij się, że poziom rozpuszczalnika będzie poniżej plam na płytce. Następnie umieść czystą bibułę filtracyjną pionowo w słoiku i szczelnie ją zamknij.
- Gdy płytka TLC wyschnie, a bibuła filtracyjna zostanie nasycona, ostrożnie umieść płytkę w rozpuszczalniku. nuta: Kiedy to robisz, ważne jest, aby trzymać talerz poziomo. Jeśli czoło rozpuszczalnika jest ukośne, przebyta odległość rozpuszczalnika będzie inna dla każdego miejsca, co uniemożliwi wizualne porównanie nieznanego miejsca z punktem odniesienia.
- Poczekaj, aż czoło rozpuszczalnika znajdzie się 1 cm od górnej krawędzi płytki. Następnie wyjmij płytkę, oznacz ją z przodu rozpuszczalnikiem i pozostaw do wyschnięcia, gdy leży płasko.
- Gdy płyta wyschnie, zwizualizuj ją za pomocą światła UV i w komorze jodowej, a następnie obrysuj plamy ołówkiem.
- Nieznany materiał może być mieszaniną związków, więc szukaj uważnie miejsc zgodnych ze wszystkimi trzema punktami odniesienia.
- Następnie precyzyjnie skopiuj plamy na rysunek płytki w swoim notatniku laboratoryjnym. Zmierz i zapisz wysokość czoła rozpuszczalnika i plamki względem linii startu.
- Gdy skończysz, wyjmij ze słoików nasączone rozpuszczalnikiem bibuły filtracyjne i pozwól im wyschnąć w kapturze.
- Wlej resztki rozpuszczalników do standardowych odpadów organicznych, umyj szkło zgodnie ze zwykłymi metodami swojego laboratorium i odłóż sprzęt laboratoryjny.
- Wyrzuć zużyte płytki TLC do kosza laboratoryjnego lub razem z odpadkami szklanymi, w zależności od materiału nośnego.
- Na koniec, gdy filtry wyschną, wyrzuć je razem z pozostałymi śmieciami.
Wyniki
- Oblicz wartości R_f dla fenolu, kwasu benzoesowego i eteru butylofenylowego eluowanego 100% heksanem. Dla każdego związku na płytce TLC zmierz odległość od linii startu do środka jej miejsca. Następnie podziel tę wartość przez odległość od linii startowej do czoła rozpuszczalnika.
- Tylko eter butylofenylowy przesunął się o mierzalną odległość od linii startu, co jest zgodne z tym, że jest najmniej polarny. Aby zapewnić skuteczną separację, wartości R_f powinny różnić się o 0,3 – 0,7. W ten sposób możemy wywnioskować, że fenol i kwas benzoesowy są zbyt polarne, aby można je było skutecznie oddzielić za pomocą rozpuszczalnika niepolarnego, takiego jak czysty heksan.
- Oblicz wartości R_f dla płytki, którą przeprowadziłeś w mieszaninie 60/40 heksanu i octanu etylu. Octan etylu jest rozpuszczalnikiem umiarkowanie polarnym, więc związki przemieszczają się dalej i są bardziej oddalone od siebie na płytce.
- Kolejność rozdzielania pokazuje, że kwas benzoesowy, najbardziej polarny związek, miał najwyższe powinowactwo do żelu krzemionkowego, podczas gdy eter butylofenylowy, najmniej polarny związek, miał najniższe powinowactwo do żelu krzemionkowego. Jest to zgodne z założeniem, że mniej związków polarnych przemieszcza się dalej w polarnych fazach stacjonarnych.
- Spójrz na swoją trzecią płytkę i oblicz wartości R_f dla aspiryny, paracetamolu i kofeiny. Kofeina, najbardziej polarny kompleks z całej trójki, podróżowała najmniej. Paracetamol przebył drugą najdalszą drogę, podczas gdy aspiryna, najmniej polarna, przebyła najwięcej.
- Na koniec, zidentyfikuj związki w swoim nieznanym materiale, porównując jego miejsce lub plamki z trzema punktami odniesienia.

Browse More Videos

Thin Layer Chromatography

TLC Plate

Solvent Front

Rf Values