Chromatografia cienkowarstwowa
chromatografia
Chromatografia to technika stosowana w chemii organicznej do rozdzielania związków w mieszaninie na podstawie ich różnic w rozpuszczaln…
Chromatografia cienkowarstwowa lub TLC to technika stosowana do rozdzielania związków organicznych na podstawie różnic w ich polarności. System TLC składa się z trzech elementów: fazy stacjonarnej, substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika rozwojowego.
Faza stacjonarna to powierzchnia, na której zostaną oddzielone związki, która zwykle składa się z wyjątkowo polarnego żelu krzemionkowego. Analizowane związki lub mieszaniny są substancjami rozpuszczonymi. Rozcieńczone roztwory substancji rozpuszczonych są nakrapiane na jednej krawędzi płytki za pomocą cienkich kapilarni.
Dno płytki jest następnie zanurzane w rozpuszczalniku wywołującym, który jest zwykle rozpuszczalnikiem organicznym, który jest mniej polarny niż faza stacjonarna. Rozpuszczalnik przemieszcza się w górę płytki poprzez działanie kapilarne. Gdy rozpuszczalnik przechodzi przez plamy substancji rozpuszczonej, niesie ze sobą część każdej substancji rozpuszczonej. Ta mieszanina substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika jest fazą ruchomą.
Górna część fazy ruchomej nazywana jest frontem rozpuszczalnika. Gdy faza ruchoma przemieszcza się w górę płytki, cząsteczki substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika tymczasowo przyklejają się do fazy stacjonarnej w oparciu o ich polarność.
Bardziej polarne substancje rozpuszczone są silnie przyciągane do fazy stacjonarnej, więc częściej się przyklejają i pozostają zablokowane przez jakiś czas. Mniej polarnych substancji rozpuszczonych przykleja się rzadziej i nie pozostaje zablokowane na długo. Oznacza to, że mniej substancji rozpuszczonych polarnie spędza więcej czasu w fazie ruchomej niż substancje rozpuszczone bardziej polarnie. Innymi słowy, mniej polarnych substancji rozpuszczonych przemieszcza się szybciej niż więcej polarnych substancji rozpuszczonych.
Aby uzyskać dobrą separację między związkami, rozpuszczalnik powinien być wystarczająco polarny, aby poruszać najbardziej polarną substancją rozpuszczoną. Oto kilka popularnych rozpuszczalników w kolejności zwiększania polarności. Czasami dwa rozpuszczalniki są łączone, aby uzyskać pożądaną polarność.
Ponieważ większość związków organicznych jest biała lub bezbarwna, płytki TLC zwykle zawierają związek fluorescencyjny. W świetle UV związki organiczne pojawią się jako ciemne plamy na świecącej płytce.
Po wizualizacji związków można zmierzyć, jak daleko się przebyły i obliczyć współczynnik opóźnienia lub Rf dla każdego z nich. Wartość ta jest odległością przebytą przez substancję rozpuszczoną podzieloną przez całkowitą odległość przebytą przez fazę ruchomą.
Jeśli rozpuszczalnik zostanie odpowiednio dobrany, każda substancja rozpuszczona będzie miała wyraźnie inny Rf. Dzięki temu możemy zidentyfikować związki składowe w mieszaninach poprzez dopasowanie wartości Rf do znanych związków.
W tym laboratorium użyjesz TLC do określenia Rf kilku znanych związków, a następnie użyjesz tych wartościR f do określenia tożsamości nieznanego związku.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Chromatografia cienkowarstwowa lub TLC to technika stosowana do rozdzielania związków organicznych na podstawie różnic w ich polarności. System TLC składa się z trzech elementów: fazy stacjonarnej, substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika rozwojowego.
Faza stacjonarna to powierzchnia, na której zostaną oddzielone związki, która zwykle składa się z wyjątkowo polarnego żelu krzemionkowego. Analizowane związki lub mieszaniny są substancjami rozpuszczonymi. Rozcieńczone roztwory substancji rozpuszczonych są nakrapiane na jednej krawędzi płytki za pomocą cienkich kapilarni.
Dno płytki jest następnie zanurzane w rozpuszczalniku wywołującym, który jest zwykle rozpuszczalnikiem organicznym, który jest mniej polarny niż faza stacjonarna. Rozpuszczalnik przemieszcza się w górę płytki poprzez działanie kapilarne. Gdy rozpuszczalnik przechodzi przez plamy substancji rozpuszczonej, niesie ze sobą część każdej substancji rozpuszczonej. Ta mieszanina substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika jest fazą ruchomą.
Górna część fazy ruchomej nazywana jest frontem rozpuszczalnika. Gdy faza ruchoma przemieszcza się w górę płytki, cząsteczki substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika tymczasowo przyklejają się do fazy stacjonarnej w oparciu o ich polarność.
Bardziej polarne substancje rozpuszczone są silnie przyciągane do fazy stacjonarnej, więc częściej się przyklejają i pozostają zablokowane przez jakiś czas. Mniej polarnych substancji rozpuszczonych przykleja się rzadziej i nie pozostaje zablokowane na długo. Oznacza to, że mniej substancji rozpuszczonych polarnie spędza więcej czasu w fazie ruchomej niż substancje rozpuszczone bardziej polarnie. Innymi słowy, mniej polarnych substancji rozpuszczonych przemieszcza się szybciej niż więcej polarnych substancji rozpuszczonych.
Aby uzyskać dobrą separację między związkami, rozpuszczalnik powinien być wystarczająco polarny, aby poruszać najbardziej polarną substancją rozpuszczoną. Oto kilka popularnych rozpuszczalników w kolejności zwiększania polarności. Czasami dwa rozpuszczalniki są łączone, aby uzyskać pożądaną polarność.
Ponieważ większość związków organicznych jest biała lub bezbarwna, płytki TLC zwykle zawierają związek fluorescencyjny. W świetle UV związki organiczne pojawią się jako ciemne plamy na świecącej płytce.
Po wizualizacji związków można zmierzyć, jak daleko się przebyły i obliczyć współczynnik opóźnienia lub Rf dla każdego z nich. Wartość ta jest odległością przebytą przez substancję rozpuszczoną podzieloną przez całkowitą odległość przebytą przez fazę ruchomą.
Jeśli rozpuszczalnik zostanie odpowiednio dobrany, każda substancja rozpuszczona będzie miała wyraźnie inny Rf. Dzięki temu możemy zidentyfikować związki składowe w mieszaninach poprzez dopasowanie wartości Rf do znanych związków.
W tym laboratorium użyjesz TLC do określenia Rf kilku znanych związków, a następnie użyjesz tych wartościR f do określenia tożsamości nieznanego związku.
View the full transcript and gain access to JoVE Lab Manual videos
Q1: What are the three main components of a thin-layer chromatography system?
A TLC system consists of the stationary phase, the mobile phase, and the solute. The stationary phase is typically polar silica gel on a plate. The mobile phase is usually an organic solvent less polar than the stationary phase. The solute is the dilute solution of compounds being analyzed, spotted on the plate's edge using capillaries.
Q2: How does polarity affect compound separation in thin-layer chromatography?
Polar compounds strongly attract to the polar silica gel stationary phase and travel slowly up the plate. Less polar compounds interact weakly with the stationary phase and travel faster. This polarity separation allows different compounds to move at different rates, creating distinct spots that can be identified by their retardation factor values.
Q3: What is the retardation factor and how is it calculated?
The retardation factor, or Rf, is the ratio of the distance traveled by a solute to the distance traveled by the mobile phase. It is calculated by measuring from the starting line to the center of the compound spot, then dividing by the distance from the starting line to the solvent front. Rf values typically range from 0 to 1 and help identify unknown compounds by comparison to known standards.
Q4: Why are fluorescent compounds added to TLC plates?
Most organic compounds are colorless or white, making them invisible on the plate. Fluorescent compounds in the TLC plate glow under UV light at 254 nanometers. Organic solutes appear as dark spots against the glowing background, allowing visualization and measurement of how far each compound traveled during separation.
Q5: How does capillary action move the solvent up a TLC plate?
When the bottom of the TLC plate is immersed in the development solvent, capillary action draws the solvent up the plate against gravity. As the solvent travels upward, it carries solute molecules with it, forming the mobile phase. This continuous movement allows compounds to separate based on their interactions with the stationary phase and solvent.
Q6: What solvent polarity is needed for effective TLC separation?
The development solvent should be just polar enough to move the most polar solute while maintaining separation. For effective separation, retardation factors should be approximately 0.3 to 0.7 apart. If the solvent is too polar, all compounds move together; if too nonpolar, compounds don't move. Trial and error or mixing two solvents often achieves optimal polarity.
Q7: How can you identify an unknown compound using TLC?
First, determine the Rf values of known reference compounds using the same solvent and TLC plate. Then, run the unknown compound under identical conditions and calculate its Rf. By comparing the unknown's Rf to the known standards, you can identify which compound it matches. This method relies on consistent Rf values for specific solute-solvent-stationary phase combinations.