Analiza fizjologicznych leukocytów za pośrednictwem selektyny E toczących się po śródbłonku mikronaczyniowym

Summary

Ten raport dostarcza wizualnego obrazu analizy komory przepływu równoległego do badania interakcji śródbłonka leukocytów pod wpływem fizjologicznego naprężenia ścinającego. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania roli ligandów selektyny śródbłonka (E) i selektyny E leukocytów, które wywołują toczenie leukocytów na powierzchni komórek śródbłonka.

Abstract

Selektyna E jest białkiem błonowym typu 1 na komórkach śródbłonka mikronaczyniowego, które pomaga zainicjować rekrutację krążących leukocytów do tkanek skóry, kości i stanu zapalnego. Ekspresja selektyny E jest konstytutywna dla mikronaczyń skórnych i kostnych i jest indukowana przez cytokiny prozapalne, takie jak IL-1α/ i TNF-α, na mikronaczyniach w tkankach objętych stanem zapalnym. Ten receptor lektyny pośredniczy w słabych interakcjach wiązania z ligandami przeciwreceptorowymi węglowodanów na krążących leukocytach, co skutkuje charakterystycznym zachowaniem toczenia. Ponieważ interakcje te poprzedzają bardziej stabilne zdarzenia adhezyjne i aktywność diapedozy, charakterystyka aktywności toczenia leukocytów i identyfikacja ligandów selektyny E leukocytów były głównymi celami w badaniach nad transportem leukocytów i zapaleniem oraz w opracowywaniu leków przeciwzapalnych (1-5). Intencją tego raportu jest przedstawienie wizualnego, kompleksowego opisu najpowszechniej stosowanej technologii do badania interakcji ligandów E-selektyny E-selektyny w warunkach fizjologicznego przepływu krwi. Nasze laboratorium we współpracy z Harvard Skin Disease Research Center korzysta z najnowocześniejszego aparatu z równoległą płytką w komorze przepływowej, któremu towarzyszy cyfrowa wizualizacja i nowe oprogramowanie do rejestracji NIS-Elements. Technologia ta pozwala nam analizować zdarzenia przyczepności w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji na ekranie, a także rejestrować aktywność toczenia w formacie wideo. Parametry adhezji komórek, takie jak częstotliwość walcowania, odporność na ścinanie oraz skuteczność wiązania/wiązania, są obliczane za pomocą oprogramowania NIS-Elements, eksportowane do arkusza kalkulacyjnego Excel i poddawane analizie statystycznej. W przedstawionej tutaj demonstracji wykorzystaliśmy komorę przepływową z równoległą płytką do zbadania zależnej od selektyny E aktywności toczenia leukocytów na żywych ludzkich komórkach śródbłonka szpiku kostnego (hBMEC). Ludzkie hematopoetyczne komórki progenitorowe KG1a, które wyrażają wysoki poziom ligandu selektyny E, zostały użyte jako nasz model leukocytów, podczas gdy unieśmiertelniona linia komórkowa hBMEC, komórki HBMEC-60, została użyta jako nasz model komórek śródbłonka (6). Aby indukować i symulować natywną ekspresję selektyny E w komorze przepływowej, komórki HBMEC-60 zostały najpierw aktywowane za pomocą IL-1. Nasza prezentacja wideo pokazała, że analiza przepływu na płytce równoległej jest odpowiednią metodą do badania fizjologicznych czynności toczenia leukocytów za pośrednictwem selektyny E oraz że funkcjonalną charakterystykę ligandów selektyny E leukocytów w komorze przepływowej można ustalić poprzez zastosowanie trawienia proteazy lub glikozydazy.

Protocol

1. Przygotowanie monowarstwy hBMEC (HBMEC-60 Cell) na szalkach Petriego do komory przepływowej

1. Pokryj 35 x 10 mm szalki do hodowli tkankowej 2 ml 20 μg/ml fibronektyny (w PBS) przez noc w temperaturze 4°C lub przez 3 godziny w temperaturze 37°C.
2. Odessać roztwór fibronektyny z szalek i dodać 1,5 x10⁵ komórek HBMEC-60 [Pożywka 199 z HEPES i glutaminą, 10% FBS, 10% surowicy ludzkiej, 5 jednostek / ml heparyny, 1ng / ml rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów, 1% penicylina-streptomycyna] do naczynia i pozwól im rosnąć do >90% zbieżności. (Trwa to 2 dni)
3. Odessać pożywkę wzrostową i, aby zwiększyć ekspresję selektyny E, dodać świeżą pożywkę z 50 ng / ml IL-1β przez 4-6 godzin. Monowarstwy komórek są teraz gotowe do testu walcowego. Aby zablokować funkcję selektyny E, można dodać neutralizującą anty-ludzką selektynę E moAb (klon BBIG-E4 (5D11)) w ilości 20 μg / ml przez ~ 1 godzinę w temperaturze 37°C.

2. Przygotowanie ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych KG1a do komory przepływowej

1. Ludzkie hematopoetyczne komórki progenitorowe KG1a są hodowane do konfluencji (1x10⁶ komórek/ml) w RPMI-1640 z glutaminą i 10% FBS/1% penicyliny-streptomycyny i są pipetowane bezpośrednio z kolby do użycia w teście komory przepływowej.
2. Liczba komórek jest obliczana za pomocą hemacytometru, a następnie komórki są ponownie zawieszane w 1 x 10 6 komórek/ml w HBSS z 10 mM HEPES (bufor h/h) i 2 mM CaCl₂
3. Komórki są przechowywane na lodzie do czasu użycia w teście.

3. Przygotowanie mikroskopu, komory przepływowej z równoległą płytką i pompy strzykawkowej (Rysunek 1)

Rysunek 1.Ilustracja analizy komory przepływowej z płytą równoległą. Odwrócony mikroskop, pompa strzykawkowa Harvard, komputer/kamera i komora przepływowa z równoległą płytką są umieszczone w optymalnym układzie w celu wydajnej i powtarzalnej analizy komórek.

1. Włącz zasilanie i źródło światła do odwróconego mikroskopu i zasilanie do pompy strzykawkowej i wybierz obiektyw 10X w mikroskopie. Umieść
2. stożkową probówkę o pojemności 50 ml w uchwycie i napełnij H/H i 2mM CaCl₂.
3. Umieść 5 ml plastikowych probówek w uchwycie na probówki poniżej stożkowej probówki 50 ml
4. Umieść strzykawkę 60 ml w pompie strzykawkowej (upewnij się, że zarówno tłok, jak i korpus strzykawki są zabezpieczone).
5. Przymocuj 3-kierunkowy zawór odcinający do końca strzykawki 60 ml i podłącz strzykawkę 5 ml do 3-kierunkowego kurka odcinającego.
6. Umieść aparat z komorą przepływu równoległego (GlycoTech, Inc.) na stoliku mikroskopowym z rurką wejściową po prawej stronie, rurką wyjściową po lewej stronie i rurą próżniową z tyłu.
7. Podłącz rurkę próżniową do próżni i otwórz zawór powietrza, aby umożliwić przyleganie równoległego aparatu płytowego do stage. (Sprawdza się, czy spódnica próżniowa w komorze przepływowej jest szczelna.) Zakręć zawór powietrza.
8. Podłącz przewód wyjściowy (po lewej stronie mikroskopu) do 3-drogowego kurka odcinającego. Aparatura jest obecnie przygotowana do umieszczenia na płycie jednowarstwowej HBMEC-60.
9. Umieść jednowarstwową płytkę HBMEC-60 i umieść na środku mikroskopu.
10. Włącz próżnię i umieść aparat komory przepływowej nad płytą tak, aby płyta jednowarstwowa znajdowała się pośrodku.
11. Delikatnie opuść aparat z komorą przepływową na jednowarstwową płytę HBMEC-60 i pozwól, aby aparat z komorą przepływową zassał się w dół. (Nie powinno być żadnych odgłosów ulatniającego się powietrza i w tym momencie może być konieczne wywarcie nacisku na komorę, aby ścisnąć gumową uszczelkę.)
12. Po ustanowieniu próżni umieść rurkę wejściową (po prawej) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej H/H z 2mM CaCl₂.
13. Otwórz 3-drogowy kurek odcinający, aby umożliwić przepływ do strzykawki o pojemności 60 ml i ustaw pompę w "trybie pompy".
14. Aby usunąć powietrze z przewodów wejściowych/wyjściowych bez podnoszenia komórek na płytce, użyj pompy strzykawkowej ustawionej na 2 ml / minutę do napełnienia rurki wlotowej, a następnie szybko ustaw na 0,5 ml / minutę tuż przed dotarciem płynu do aparatu. Konieczne jest dokładne zagruntowanie tego zestawu i unikanie pęcherzyków powietrza, które podniosą monowarstwę z płyty.
15. Po zauważeniu, że płyn dostaje się do strzykawki o pojemności 60 ml, komora przepływowa i pompa strzykawkowa zostały zalane, a komora przepływowa jest gotowa do użycia. Ta konfiguracja zostanie powtórzona dla każdego uruchomienia wejściowego komórki i dla każdej nowej wymaganej płytki.

4. Przechwytywanie zdarzeń toczących się leukocytów za pomocą NIS

1. Elements Otwórz NIS Elements na komputerze.
2. Naciśnij ikonę "play", aby wyświetlić obraz na żywo. Automatyczna ekspozycja pozwoli na razie łatwiej zobaczyć płytę i jest ważna przy ustawianiu ostrości.
3. Upewnij się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony na monowarstwie komórki.
4. Po ustawieniu ostrości ponownie ustaw ekspozycję na 1 klatkę na sekundę i wyreguluj światło na mikroskopie. Obraz powinien pojawić się na komputerze i nie być już widoczny w wizjerze mikroskopu ze względu na słaby poziom oświetlenia. Histogram światła można następnie dostosować, aby usunąć ekspozycję tła lub poprawić przejrzystość komórek.
5. Kliknij kosz 2X2 lub kosz na żywo, aby uzyskać obraz, który jest idealny do przechwytywania filmów
6. Kliknij "Makro" na pasku menu i wybierz "zapisz do portu"; Wybierz port "COM3" i "Otwórz". (Spowoduje to otwarcie portu w celu koordynacji z pompą strzykawkową.
7. Odpipetuj 1 ml zawiesiny komórek KG1a do probówki o pojemności 5 ml w pobliżu przewodu wejściowego, a następnie umieść przewód wejściowy na dnie probówki.
8. Przejdź do paska menu, kliknij "Przechwyć" ; "Akwizycja poklatkowa".
9. Pojawi się nowe menu. Wybierz protokół trwający 210 sekund, jest to długość programu do zwijania na komórkach HBMEC-60. (Każda faza jest zaprogramowana tak, aby robić zdjęcie co sekundę przez cały czas trwania protokołu pompy. Jest również skonfigurowany do wysyłania polecenia przez port com3 w celu uruchomienia pompy.) Jeśli upływ czasu zostanie przerwany, pompa nie zatrzyma się samoczynnie i musi zostać zresetowana. Naciśnij Anuluj, aby powrócić do obrazu na żywo.
10. Ustaw pompę strzykawkową w "Tryb programu" zgodnie z instrukcją obsługi. (Tryb programu pozwala na ręczne programowanie określonych natężeń przepływu (tj. poziomy naprężeń ścinających), które mają być przenoszone w komorze i dyktować interakcje komórek KG1a nad monowarstwą ogniwa HBMEC-60). Ustawienia dla toczenia komórek KG1a na komórkach hBMEC były następujące: 4,2 dyn/cm² przez 45 s, 0,3 dyn/cm² przez 60 s, a stopniowo zwiększa się co 15 s do maksimum 4,2 dyn/cm²
11. Naprężenie ścinające ścianki (W_st) w komorze obliczono zgodnie z następującym równaniem: W_st = 6μQ/a²b, gdzie μ to szacowana lepkość podłoża (0,0076 P), Q to objętościowe natężenie przepływu w ml/s, a to wysokość kanału (grubość uszczelki) w cm (0,03 cm), a b to szerokość kanału w cm (0,5 cm). Natężenie przepływu było regulowane za pomocą trybu programowego pompy strzykawkowej.
12. Mikroskop i komputer są teraz gotowe do wykonywania zdjęć poklatkowych. Naciśnij "uruchom uruchom" na komputerze, aby rozpocząć pobieranie danych. Podczas uruchamiania programu należy dodać pożywkę do probówki zawierającej komórki KG1a, aby rurka wejściowa/wyjściowa była pełna medium (upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza).

5. Zależność końcowej sialinacji i glikoproteiny powierzchniowej dla komórki KG1a za pośrednictwem selektyny E 5. Walcowanie (Rysunek 2; Klipy wideo z 5.1-5.5)

1. Oznaczanie toczenia się komórek KG1a na niestymulowanych komórkach HBMEC-60. (Kontrola ujemna) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywym, niestymulowanym przez IL-1β HBMEC-60, jak opisano powyżej.
2. Oznaczanie toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 wstępnie poddanych działaniu IL-1β. (Kontrola zależności od selektyny E) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywym HBMEC-60 stymulowanym przez IL-1β, jak opisano powyżej.
3. Oznaczanie toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 wstępnie potraktowanych IL-1β, a następnie neutralizacja anty-ludzkiej selektyny E-selektyny moAb. (Kontrola zależności od selektyny E) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej na żywym, stymulowanym przez IL-1β HBMEC-60 wstępnie potraktowanym neutralizującą anty-ludzką selektyną E-selektyny moAb, jak opisano powyżej.
4. Oznaczanie trawionej przez sialidazę komórki KG1a toczącej się na stymulowanym przez IL-1β HBMEC-60. Komórki KG1a wstępnie potraktowane neuraminidazą Vibrio Cholerae 0,1 U/ml przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej na żywym HBMEC-60 stymulowanym przez IL-1β, jak opisano powyżej.
5. Oznaczanie trawionej przez proteazę komórki KG1a toczącej się na stymulowanym przez IL-1β HBMEC-60. Komórki KG1a wstępnie potraktowane proteazą, 0,2 U/ml bromelainy przez 1 godzinę w temperaturze 37 ° C, przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywym HBMEC-60 stymulowanym przez IL-1β, jak opisano powyżej.

6. Analiza komórek KG1a przechwyconych przez NIS-Elements i tworzenie wykresów danych toczenia komórek KG1a

1. Po uzyskaniu sekwencji czasowej zapisz dane.
2. Przejdź do zakładki "pomiar" na pasku menu i wybierz "zdefiniuj próg". Przesuń paski tak, aby żądane komórki były pokolorowane na czerwono. Wybierz "wszystkie obrazy", a następnie "W porządku". Cała sekwencja poklatkowa powinna być teraz zmodyfikowana z widocznymi czerwonymi toczącymi się komórkami.
3. Przejdź do "Pomiaru" i wybierz "ograniczenia". (Ograniczenia umożliwiają użytkownikowi wykluczenie obiektów progowych, które nie reprezentują komórek tocznych. Jest to przede wszystkim tło stworzone przez monowarstwę HBMEC-60. ) Wybierz "obszar" i wprowadź minimalne i maksymalne wartości obszaru dla komórek toczących się. Powtórz ten krok dla "wydłużenia" i "cyrkularności".
4. Wybierz "mierz" i wybierz "utwórz binarny przy użyciu ograniczeń" i ustaw wartości ograniczeń, aby zoptymalizować programowe rozpoznawanie przez oprogramowanie NIS-Elements komórek tocznych na monowarstwie komórek HBMEC-60.
5. Wróć do "pomiaru", wybierz "Dane pola", a następnie wybierz "zresetuj dane". Zamknij to menu.
6. Wróć do "Pomiaru" i wybierz "pole skanowania".
7. Otwórz "Zmierz"; "Dane pola", wybierz "liczba lub Obiekty", a następnie wybierz "wszystkie pola" i wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel.
8. Wybierz opcję "wyczyść dane", aby przygotować akwizycję komórek NIS-Elements do następnego zbierania danych.

Wyniki:

<

p class="jove_content">Rysunek 3. Analiza aktywności wiązania selektyny E w komorze przepływowej z równoległą płytką na komórkach KG1a. Komórki KG1a traktowane sialidazą lub proteazą analizowano pod kątem wydajności walcowania na monowarstwach komórek HBMEC-60 wstępnie potraktowanych IL-1β. Eksperymenty z rolowaniem kontroli ujemnej przeprowadzono również poprzez analizę toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC -60 niestymulowanych przez IL-1β lub na stymulowanych IL-1β komórkach HBMEC-60 traktowanych neutralizującą anty-ludzką selektyną E-selektyny moAb (5D11). Częstotliwości zwijania komórek przeprowadzono w trzech egzemplarzach i przeanalizowano za pomocą oprogramowania NIS-Elements. (* Istotność statystyczna; p<0,001)

 

W tym raporcie wideo przedstawiliśmy wizualny obraz tego, jak analizować interakcje między leukocytami a komórkami śródbłonka w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W szczególności przeanalizowaliśmy rolę ligandów E-selektyny – E-selektyny w pośredniczeniu w wiązaniu i walcowaniu leukocytów, zachowaniu adhezyjnym niezbędnym do zaangażowania wtórnych, bardziej stabilnych działań wiążących przez receptory, takie jak integryny i receptory hialuronianowe. Korzystając z komory przepływowej z równoległą płytką przystosowaną do użytku z odwróconym mikroskopem, pompą strzykawkową Harvard, kamerą wideo i sprzętem komputerowym / akwizycyjnym komórek, przeprowadziliśmy eksperymenty, w których komórki ligandu E-selektyny + KG1a zostały użyte jako nasz model leukocytów, a komórki hBMEC (HBMEC-60) stymulowane cytokiną prozapalną, IL-1β, zostały użyte jako nasz model ludzkich komórek śródbłonka E-selectin+ (1-6). Jak wcześniej informowaliśmy, zaobserwowaliśmy solidne zwijanie komórek KG1a na stymulowanych przez IL-1β komórkach HBMEC-60 w zakresie poziomów naprężeń ścinających w sposób zależny od selektyny E (Figura 3) (statystycznie istotna różnica w porównaniu z toczeniem się komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych przez IL-1β). Kontrole negatywne, które składały się z toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych przez IL-1β lub na komórkach HBEMC-60 stymulowanych przez IL-1β wstępnie potraktowanych anty-ludzkim mAb selektyny E, przeprowadzono równolegle, aby wykazać zależność stymulacji cytokin i ekspresji selektyny E dla aktywności toczenia (Figura 3). Ponadto analiza krocząca komórek KG1a wstępnie potraktowanych neuraminidazą Vibrio cholerae (sialidazą) lub bromelainą, niespecyficzną proteazą znaną z trawienia powierzchniowego ligandu glikoproteinowego E-selektyny, podkreśliła znaczenie końcowych reszt kwasu sjalowego i glikoproteiny powierzchniowej dla aktywności liganda E-selektyny (2,3).

Discussion

Analiza w komorze przepływowej z równoległą płytką jest specjalistycznym systemem testów in vitro stosowanym do badania oddziaływań adhezyjnych leukocytów – śródbłonka w warunkach naprężeń ścinających, podobnych do tych, które występują na powierzchni żyłki zakapilarnej. Jak pokazano tutaj w naszej prezentacji wizualnej, pokazujemy wartość tego systemu do badania roli ligandów E-selektyny – E-selektyny w pośredniczeniu w wiązaniu leukocytów i toczeniu się po powierzchni aktywowanego śródbłonka mikronaczyniowego. Ujawniamy również zastosowanie proteazy, glikozydazy i leczenia przeciwciałami blokującymi w celu wyjaśnienia roli E-selektyny i jej ligandów w tym układzie. Analizy te są wysoce powtarzalne i pomagają stworzyć eksperymentalną podstawę do badania funkcji liganda E-selektyna – E-selektyna in vivo.

Oprócz badania adhezji komórek za pomocą monowarstw komórek śródbłonka mikronaczyniowego aktywowanych cytokinami (hBMEC lub ludzka żyła pępowinowa lub skórne komórki śródbłonka mikronaczyniowego), testy można przeprowadzić przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych ludzkich cząsteczek chimerycznych E-selektyny lub E-selektyny-Ig jako substratu do adhezji komórek. Inne oddziaływania adhezyjne, w których pośredniczy selektyna leukocytów (L-) i selektyna płytek krwi (P), można również oznaczyć przy użyciu technologii komory przepływu równoległego. Zmieniając typ monowarstwy komórki/substratu białkowego lub wejściowych modeli komórek transfektujących leukocyty/selektynę, badacze mogą badać rolę tych interakcji w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Sigma-Aldrich	F6178-500ML
DPBS	GIBCO, firmy Life Technologies	14190
0,5 M EDTA	GIBCO, firmy Life Technologies	15575-038
1M HEPES	GIBCO, firmy Life Technologies	15630
Zestaw studzienek przepływowych z płytką równoległą	GlycoTech	31-001
PHD2000 Programowalny Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	PHD 2000
35x10mm Naczynie	hodowli tkankowych BD Biosciences	353001
Fibronektyna , z ludzkiego osocza	Sigma-Aldrich	86088-83-7 F2006-2MG
Interleukina-1_, Człowiek; Rekombinowany	Sigma-Aldrich	I9401-5UG
HBSS (buforowany roztwór soli fizjologicznej Hanka	) GIBCO, firmy Life Technologies	14170
Medium 199 w/ HEPES & Glutamina	Invitrogen	12320-039
Surowica ludzka	Innowacyjne badania, Inc.	IPLA-SER1
Heparyna	Abraxis BioScience	504011
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów	R& D Systems	233-FB
Penicylina Streptomycyna	GIBCO, firmy Life Technologies	15140
Plastikowe probówki	BD Biosciences	352008
Anty-ludzki klon selektyny E BBIG-E4(5D11)R	& D Systems	BBA16
Bromelain	Sigma-Aldrich	B-4882