Analiza fizjologicznego toczkowania leukocytów zapśredniczonego przez E-selektynę na śródbłonku mikrokrążenia

Podsumowanie

Niniejszy raport przedstawia wizualizację analizy w komorze przepływowej z równoległymi płytkami, służącej do badania oddziaływań leukocytów z śródbłonkiem w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniu roli selektyny E (E-selectin) oraz ligandów selektyny E na leukocytach, które inicjują toczenie się leukocytów po powierzchniach komórek śródbłonka.

Streszczenie

E-selektyna jest białkiem błonowym typu 1 występującym na komórkach śródbłonka mikrokrążenia, które wspomaga inicjację rekrutacji krążących leukocytów do tkanek skóry, kości oraz tkanek zapalnych. Ekspresja E-selektyny jest konstytutywna w mikrokrążeniu skóry i kości, natomiast w mikrokrążeniu tkanek zapalnych jest indukowalna przez cytokiny prozapalne, takie jak IL-1α i TNF-α. Ten receptor lektynowy pośredniczy w słabych oddziaływaniach wiążących z węglowodanowymi ligandami przeciwreceptorowymi na krążących leukocytach, co skutkuje charakterystycznym zjawiskiem toczenia (rolling). Ponieważ oddziaływania te poprzedzają stabilniejsze zdarzenia adhezyjne oraz proces diapedez, charakterystyka aktywności toczenia leukocytów oraz identyfikacja ligandów E-selektyny na leukocytach stanowiły główne cele badań nad migracją leukocytów i stanami zapalnymi, a także prac nad rozwojem leków przeciwzapalnych (1-5). Celem niniejszego opracowania jest przedstawienie kompleksowego opisu wizualnego najszerzej stosowanej technologii do badania oddziaływań E-selektyna–ligand E-selektyny w fizjologicznych warunkach przepływu krwi. Nasze laboratorium, we współpracy z Harvard Skin Disease Research Center, wykorzystuje nowoczesny aparat z komorą przepływową z równoległymi płytkami (parallel-plate flow chamber), wspierany cyfrową wizualizacją oraz nowym oprogramowaniem rejestrującym NIS-Elements. Technologia ta pozwala nam na analizę zdarzeń adhezyjnych w czasie rzeczywistym za pomocą wizualizacji ekranowej, a także na rejestrację aktywności toczenia w formacie wideo. Parametry adhezji komórek, takie jak częstotliwość toczenia, odporność na siły ścinające oraz wydajność wiązania/tetheringu, są obliczane za pomocą oprogramowania NIS-Elements, eksportowane do arkusza Excel i poddawane analizie statystycznej. W zaprezentowanej tutaj demonstracji wykorzystaliśmy komorę przepływową z równoległymi płytkami do zbadania zależnej od E-selektyny aktywności toczenia leukocytów na żywych ludzkich komórkach śródbłonka szpiku kostnego (hBMEC). Jako model leukocytów wykorzystano ludzkie komórki progenitorowe krwiotwórcze KG1a, które wykazują wysoki poziom ekspresji ligandu E-selektyny, natomiast jako model komórek śródbłonka wykorzystano unieśmiertelnioną linię komórkową hBMEC, komórki HBMEC-60 (6). Aby wywołać i zasymulować natywną ekspresję E-selektyny w komorze przepływowej, komórki HBMEC-60 zostały uprzednio aktywowane za pomocą IL-1. Nasza prezentacja wideo wykazała, że analiza w komorze przepływowej z równoległymi płytkami jest odpowiednią metodą badania fizjologicznej aktywności toczenia leukocytów pośredniczonej przez E-selektynę oraz że funkcjonalna charakterystyka ligandu(ów) E-selektyny na leukocytach w komorze przepływowej może zostać ustalona poprzez zastosowanie trawienia proteazami lub glikozydazami.

Protokół

1. Przygotowanie monowarstwy hBMEC (linia komórkowa HBMEC-60) na szalkach Petriego do komory przepływowej

1. Szalki do hodowli tkankowej o wymiarach 35 x 10mm pokryć 2ml fibronektyny w stężeniu 20µg/ml (w PBS) przez noc w temperaturze 4°C lub przez 3 godziny w 37°C.
2. Odssać roztwór fibronektyny z szalek i dodać do nich 1,5 x10⁵ komórek HBMEC-60 [pożywka Medium 199 z HEPES i glutaminą, 10% FBS, 10% surowicy ludzkiej, 5 jednostek/ml heparyny, 1ng/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów, 1% penicyliny i streptomycyny], a następnie pozostawić je do wzrostu do konfluencji >90%. (Zajmuje to 2 dni)
3. Odssać pożywkę wzrostową i, w celu upregulacji ekspresji E-selektyny, dodać świeżą pożywkę z 50ng/mL IL-1β na 4-6 godzin. Monowarstwy komórek są teraz gotowe do testu toczenia. Aby zablokować funkcję E-selektyny, można dodać neutralizujące przeciwciało monoklonalne przeciw ludzkiej E-selektynie (klon BBIG-E4(5D11)) w stężeniu 20µg/ml na ok. 1 godzinę w 37°C.

2. Przygotowanie ludzkich komórek progenitorowych krwi KG1a do komory przepływowej

1. Ludzkie komórki progenitorowe układu krwiotwórczego KG1a hoduje się do uzyskania konfluencji (1x10⁶ komórek/ml) w pożywce RPMI-1640 z glutaminą oraz 10% FBS/1% penicyliną-streptomycyną, a następnie pobiera się je pipetą bezpośrednio z kolby do użycia w badaniu w komorze przepływowej.
2. Liczbę komórek wyznacza się za pomocą hemacytometru, a następnie komórki resuspenduje się w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/mL w buforze HBSS z 10mM HEPES (bufor H/H) i 2mM CaCl₂.
3. Komórki przechowuje się w lodzie do momentu użycia w badaniu.

3. Przygotowanie mikroskopu, komory przepływowej z równoległymi płytkami oraz pompy strzykawkowej (Rycina 1)

Rysunek 1.Ilustracja analizy w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. Mikroskop odwrócony, pompa strzykawkowa Harvard, komputer/kamera oraz komora przepływowa z równoległymi płytkami są rozmieszczone w optymalny sposób, aby zapewnić wydajną i powtarzalną analizę komórek.

1. Włącz zasilanie oraz źródło światła mikroskopu odwróconego, zasilanie pompy strzykawkowej i wybierz obiektyw 10X w mikroskopie.
2. Umieść probówkę stożkową 50 mL w uchwycie i napełnij ją roztworem H/H oraz 2 mM CaCl₂.
3. Umieść plastikowe probówki 5 ml w statywie pod probówką stożkową 50 mL.
4. Umieść strzykawkę 60 mL w pompie strzykawkowej (upewnij się, że zarówno tłok, jak i korpus strzykawki są zabezpieczone).
5. Przymocuj trójdrożny kranik do końca strzykawki 60 mL, a następnie przymocuj strzykawkę 5 mL do kranika.
6. Umieść aparat do komory przepływu równoległego (Parallel Flow Chamber, GlycoTech, Inc.) na stoliku mikroskopu tak, aby rurka wlotowa znajdowała się po prawej stronie, rurka wylotowa po lewej, a rurka próżniowa z tyłu.
7. Podłącz przewód próżniowy do pompy próżniowej i otwórz zawór powietrzny, aby aparat do płytek równoległych przylgnął do stolika. (Służy to do sprawdzenia szczelności uszczelki próżniowej komory przepływowej). Zamknij zawór powietrzny.
8. Podłącz linię wylotową (po lewej stronie mikroskopu) do trójdrożnego kranika. Aparat jest teraz przygotowany do umieszczenia na płytce z monowarstwą HBMEC-60.
9. Weź płytkę z monowarstwą HBMEC-60 i umieść ją w centrum mikroskopu.
10. Włącz próżnię i ustaw aparat komory przepływowej nad płytką w taki sposób, aby płytka z monowarstwą znajdowała się w centrum.
11. Ostrożnie opuść aparat komory przepływowej na płytkę z monowarstwą HBMEC-60 i pozwól, aby aparat został zassany. (Nie powinno być słychać uciekającego powietrza; w tym momencie może być konieczne dociśnięcie komory, aby skompresować gumową uszczelkę).
12. Po wytworzeniu próżni umieść rurkę wlotową (po prawej stronie) w probówce stożkowej 50 mL zawierającej H/H z 2 mM CaCl₂.
13. Otwórz trójdrożny kranik, aby umożliwić przepływ do strzykawki 60 mL, i przełącz pompę w tryb „pump mode”.
14. Aby usunąć powietrze z linii wlotowych/wylotowych bez odrywania komórek od płytki, użyj pompy strzykawkowej ustawionej na 2 mL/minutę, aby napełnić rurkę wlotową, a następnie szybko zmień ustawienie na 0,5 mL/minutę tuż przed dotarciem cieczy do aparatu. Niezbędne jest staranne odpowietrzenie układu, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogłyby oderwać monowarstwę od płytki.
15. Gdy ciecz zacznie przemieszczać się do strzykawki 60 ml, oznacza to, że komora przepływowa i pompa strzykawkowa zostały odpowietrzone, a komora przepływowa jest gotowa do użycia. Procedurę tę należy powtórzyć dla każdego cyklu wprowadzania komórek oraz dla każdej nowej potrzebnej płytki.

4. Rejestracja zdarzeń toczenia się leukocytów przy użyciu oprogramowania NIS Elements

1. Otwórz program NIS Elements na komputerze.
2. Naciśnij ikonę „odtwarzaj”, aby uzyskać obraz na żywo. Automatyczna ekspozycja ułatwi na tym etapie dostrzeżenie płytki i jest istotna dla ustawienia ostrości.
3. Upewnij się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony na monowarstwę komórek.
4. Po ustawieniu ostrości zresetuj ekspozycję na 1 klatka/sekundę i dostosuj oświetlenie mikroskopu. Ze względu na niski poziom światła obraz powinien pojawić się na komputerze i przestać być widoczny w okularze mikroskopu. Następnie można dostosować histogram światła, aby usunąć ekspozycję tła lub poprawić klarowność komórek.
5. Kliknij 2X2 bin lub Live Bin, aby uzyskać obraz idealny do rejestracji filmu.
6. Kliknij „Macro” na pasku menu i wybierz „write to port”; wybierz port „com3” i „open”. (Otwiera to port w celu koordynacji z pompą strzykawkową).
7. Pipetuj 1mL zawiesiny komórek KG1a do probówki 5ml w pobliżu linii rurki doprowadzającej, a następnie umieść rurkę doprowadzającą na dnie probówki.
8. Przejdź do paska menu, kliknij „Capture”, a następnie „time-lapse acquisition”.
9. Pojawi się nowe menu. Wybierz protokół trwający 210 s, co odpowiada długości programu dla rolowania komórek HBMEC-60. (Każda faza jest zaprogramowana tak, aby robić zdjęcie co sekundę przez cały czas trwania protokołu pompy. Jest on również skonfigurowany tak, aby wysłać polecenie przez port com3 w celu uruchomienia pompy). Jeśli sekwencja time-lapse zostanie przerwana, pompa nie zatrzyma się automatycznie i musi zostać zresetowana. Naciśnij Cancel, aby powrócić do obrazu na żywo.
10. Ustaw pompę strzykawkową w trybie „Program Mode” zgodnie z instrukcją obsługi. (Tryb Program Mode umożliwia ręczne programowanie konkretnych szybkości przepływu (tj. poziomów naprężenia ścinającego) wewnątrz komory i dyktuje interakcje komórek KG1a z monowarstwą komórek HBMEC-60). Ustawienia dla rolowania komórek KG1a na komórkach hBMEC były następujące: 4.2 dynes/cm² przez 45 s, 0.3 dynes/cm² przez 60 s oraz stopniowe zwiększanie co 15 s do maksimum 4.2 dynes/cm².
11. Przyścienne naprężenie ścinające (W_st) w komorze obliczono według następującego równania: W_st = 6µQ/a²b, gdzie μ to szacowana lepkość medium (0.0076 P), Q to objętościowa szybkość przepływu w ml/s, a to wysokość kanału (grubość uszczelki) w cm (0.03 cm), a b to szerokość kanału w cm (0.5 cm). Szybkości przepływu regulowano za pomocą trybu Program Mode pompy strzykawkowej.
12. Mikroskop i komputer są teraz gotowe do rejestracji zdjęć w trybie time-lapse. Naciśnij „start run” na komputerze, aby rozpocząć zbieranie danych. Podczas uruchamiania programu pamiętaj o dodawaniu medium do probówki z komórkami KG1a, aby rurki doprowadzające i odprowadzające były pełne medium (Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza).

5. Zależność toczenia komórek KG1a od terminalnej sialilacji i glikoprotein powierzchniowych w procesie zależnym od E-selektyny (Rycina 2; Klipy wideo 5.1-5.5)

1. Analiza toczenia komórek KG1a na niestymulowanych komórkach HBMEC-60. (Kontrola negatywna) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, niestymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.
2. Analiza toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 wstępnie traktowanych IL-1β. (Kontrola zależności od E-selektyny) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.
3. Analiza toczenia komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 wstępnie traktowanych IL-1β, a następnie neutralizującym przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzką E-selektynę. (Kontrola zależności od E-selektyny) Komórki KG1a przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60, wstępnie traktowanymi neutralizującym przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzką E-selektynę zgodnie z powyższym opisem.
4. Analiza toczenia komórek KG1a trawionych sialidazą na stymulowanych IL-1β komórkach HBMEC-60. Komórki KG1a wstępnie traktowane neuraminidazą z Vibrio Cholerae w stężeniu 0.1U/ml przez 1h w 37°C przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.
5. Analiza toczenia komórek KG1a trawionych proteazą na stymulowanych IL-1β komórkach HBMEC-60. Komórki KG1a wstępnie traktowane proteazą, bromelainą w stężeniu 0.2U/ml przez 1h w 37°C, przygotowano i wprowadzono do komory przepływowej nad żywymi, stymulowanymi IL-1β komórkami HBMEC-60 zgodnie z powyższym opisem.

6. Analiza komórek KG1a wychwyconych przez NIS-Elements oraz wykreślanie danych dotyczących toczenia się komórek KG1a

1. Po pozyskaniu sekwencji czasowej zapisz dane.
2. Przejdź do karty „measure” na pasku menu i wybierz „define threshold”. Przesuń suwaki tak, aby pożądane komórki zostały zaznaczone kolorem czerwonym. Wybierz „all images”, a następnie „Okay”. Cała sekwencja time-lapse powinna zostać zmodyfikowana, wykazując widoczne czerwone komórki toczące się.
3. Przejdź do „Measure” i wybierz „restrictions”. (Ograniczenia pozwalają użytkownikowi wykluczyć obiekty spełniające próg, które nie reprezentują komórek toczących się. Jest to przede wszystkim tło utworzone przez monowarstwę HBMEC-60). Wybierz „area” i wprowadź minimalne oraz maksymalne wartości pola powierzchni dla komórek toczących się. Powtórz ten krok dla „elongation” oraz „circularity”.
4. Wybierz „measure”, a następnie „create binary using restrictions” i ustaw wartości ograniczeń, aby zoptymalizować rozpoznawanie komórek toczących się na monowarstwie komórek HBMEC-60 przez oprogramowanie NIS-Elements.
5. Wróć do „measure”, wybierz „Field data”, a następnie „reset data”. Zamknij to menu.
6. Powróć do „Measure” i wybierz „scan field”.
7. Otwórz „Measure”; „Field data”, wybierz „number or Objects”, a następnie „all fields” i wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel.
8. Wybierz „clear data”, aby przygotować moduł akwizycji komórek NIS-Elements do kolejnego zbierania danych.

Wyniki:

Rycina 3. Analiza aktywności wiązania E-selektyny na komórkach KG1a w komorze przepływowej z równoległymi płytkami. Komórki KG1a traktowane sialidazą lub proteazą poddano analizie wydajności toczenia na monowarstwach komórek HBMEC-60 wstępnie traktowanych IL-1β. Przeprowadzono również eksperymenty kontrolne z toczeniem, analizując toczenie komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych IL-1β lub na komórkach HBMEC-60 stymulowanych IL-1β i traktowanych neutralizującym przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzką E-selektynę (5D11). Częstotliwości toczenia komórek wyznaczono w trzech powtórzeniach i przeanalizowano za pomocą oprogramowania NIS-Elements. (* Istotność statystyczna; p<0.001)

 

W niniejszym raporcie w formie wideo przedstawiliśmy wizualizację sposobu analizy oddziaływań między leukocytami a komórkami śródbłonka w fizjologicznych warunkach naprężenia ścinającego. W szczególności przeanalizowano rolę E-selektyny i ligandów E-selektyny w pośredniczeniu w przytwieraniu (tethering) i toczeniu się (rolling) leukocytów, co jest zachowaniem adhezyjnym niezbędnym do zainicjowania wtórnych, bardziej stabilnych aktywności wiążących za pośrednictwem receptorów, takich jak integryny i receptory hialuronianu. Wykorzystując komorę przepływową z równoległymi płytkami przystosowaną do pracy z mikroskopem odwróconym, pompę strzykawkową Harvard, kamerę wideo oraz komputer z sprzętem do akwizycji obrazów komórkowych, przeprowadzono eksperymenty, w których jako model leukocytów wykorzystano komórki KG1a wykazujące obecność liganda E-selektyny, a jako model ludzkich komórek śródbłonka E-selektyna+ wykorzystano komórki hBMEC (HBMEC-60) stymulowane prozapalną cytokiną IL-1β (1-6). Jak raportowano wcześniej, zaobserwowano intensywne toczenie się komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 stymulowanych IL-1β w szerokim zakresie poziomów naprężenia ścinającego w sposób zależny od E-selektyny (Rycina 3) (różnica istotna statystycznie w porównaniu z toczeniem się komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych IL-1β). W celu wykazania zależności aktywności toczenia się od stymulacji cytokiną i ekspresji E-selektyny, równolegle przeprowadzono kontrole negatywne, polegające na badaniu toczenia się komórek KG1a na komórkach HBMEC-60 niestymulowanych IL-1β lub na komórkach HBMEC-60 stymulowanych IL-1β i uprzednio potraktowanych przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzka E-selektyna (Rycina 3). Ponadto analiza toczenia się komórek KG1a uprzednio potraktowanych neuraminidazą z Vibrio cholerae (sialidazą) lub bromelainą – nieswoistą proteazą znaną z trawienia powierzchniowego glikoproteinowego liganda E-selektyny – podkreśliła znaczenie terminalnych reszt kwasu sialowego oraz glikoprotein powierzchniowych dla aktywności liganda E-selektyny (2,3).

Dyskusja

Analiza w komorze przepływowej z równoległymi płytkami to wyspecjalizowany system testów in vitro stosowany do badania oddziaływań adhezyjnych między leukocytami a śródbłonkiem w warunkach naprężenia ścinającego, podobnych do tych występujących na powierzchni żyłki zakapiilarnej. Jak przedstawiono w naszej prezentacji wizualnej, demonstrujemy przydatność tego systemu do badania roli E-selektyny i ligandów E-selektyny w pośredniczeniu w przytwieraniu i toczeniu się leukocytów na powierzchni aktywowanego śródbłonka mikroznaczyniowego. Przedstawiamy również zastosowanie proteaz, glikozydaz oraz przeciwciał blokujących w celu wyjaśnienia roli E-selektyny i jej ligandów w tym systemie. Analizy te są wysoce powtarzalne i stanowią podstawę eksperymentalną do badania funkcji E-selektyny i ligandów E-selektyny in vivo.

Oprócz badania adhezji komórek z wykorzystaniem monowarstw aktywowanych cytokinami mikro naczyniowych komórek śródbłonka (hBMEC lub ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej lub dermalnych mikro naczyniowych komórek śródbłonka), testy można przeprowadzać, stosując oczyszczoną rekombinowaną ludzką E-selektynę lub chimeryczne cząsteczki E-selectin-Ig jako podłoże do adhezji komórek. Inne oddziaływania adhezyjne zapośredniczone przez selektynę leukocytarną (L-selektynę) i selektynę płytkową (P-selektynę) można również badać przy użyciu technologii komory przepływowej z równoległymi płytkami. Poprzez zmianę rodzaju monowarstwy komórek/podłoża białkowego lub modeli komórek leukocytów/transfektantów selektyny, badacze mogą analizować rolę tych oddziaływań w fizjologicznych warunkach naprężenia ścinającego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FBS (płodowa surowica bydlęca)	Sigma-Aldrich	F6178-500ML
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
0,5 M EDTA	GIBCO, by Life Technologies	15575-038
1M HEPES	GIBCO, by Life Technologies	15630
Zestaw do komory przepływowej z równoległymi płytkami	GlycoTech	31-001
Programowalna pompa strzykawkowa PHD2000	Harvard Apparatus	PHD 2000
szalka do hodowli tkankowej 35x10 mm	BD Biosciences	353001
Fibrynogenia z ludzkiej osocza	Sigma-Aldrich	86088-83-7 F2006-2MG
Interleukina-1, ludzka; rekombinowana	Sigma-Aldrich	I9401-5UG
HBSS (roztwór soli buforowej Hanksa)	GIBCO, by Life Technologies	14170
Pożywka Medium 199 z HEPES & Glutamina	Invitrogen	12320-039
Surowica ludzka	Innovative Research, Inc.	IPLA-SER1
Heparyna	Abraxis BioScience	504011
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów	R&D Systems	233-FB
penicylina streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140
Plastikowe probówki	BD Biosciences	352008
Przeciwciało przeciwko ludzkiej E-selektynie, klon BBIG-E4(5D11)	R&D Systems	BBA16
Bromelaina	Sigma-Aldrich	B-4882