Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.
Artykuł metodologiczny
Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W Stanach Zjednoczonych choroba tętnic obwodowych (PAD) dotyka około 10 milionów osób i jest również powszechna na całym świecie. Możliwości terapii medycznych w celu łagodzenia objawów są ograniczone. Interwencje chirurgiczne lub wewnątrznaczyniowe są pomocne u niektórych pacjentów, lecz długoterminowe wyniki są często rozczarowujące. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania nowych metod leczenia PAD. Model niedokrwienia kończyny tylnej myszy jest modelem PAD i jest przydatny do testowania nowych terapii. W porównaniu z innymi modelami niedokrwienia tkanek, takimi jak podwiązanie tętnicy wieńcowej lub mózgowej, podwiązanie tętnicy udowej zapewnia prostszy model tkanki niedokrwionej. Innymi zaletami tego modelu są łatwy dostęp do tętnicy udowej oraz niski wskaźnik śmiertelności.
W tym filmie prezentujemy metodologię tworzenia mysiego modelu jednostronniego niedokrwienia kończyny tylnej. Opisane zostaną konkretne materiały i procedury służące do opracowania i oceny modelu, w tym ocena perfuzji kończyny za pomocą obrazowania laser Dopplerowskiego. Niniejszy protokół może być również wykorzystany do transplantacji i nieinwazyjnego śledzenia komórek, co zostało zademonstrowane przez Huang et al.1.
Protokół
1. Indukcja jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej
- Narzędzia chirurgiczne potrzebne do tej operacji obejmują: pęsetę precyzyjną z ostrymi końcówkami, pęsetę ostrą, nożyczki sprężynowe, nożyczki chirurgiczne, uchwyt igłowy oraz retraktor. Własnoręcznie wykonujemy retraktor z spinacza do papieru, ponieważ jest on mniejszy niż retraktory dostępne w handlu. Narzędzia te należy wysterylizować przed operacją w autoklawie lub sterylizatorze kulkowym. Do zabiegu będą również potrzebne kauteryzator oraz sterylne precyzyjne patyczki bawełniane. Zaleca się ponowną sterylizację końcówek narzędzi w razie potrzeby w trakcie procedury.
- Po przygotowaniu narzędzi umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% izofluranu w 100% tlenu przy przepływie 1L/min.
- Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory. Zaleca się przedwdmuchanie środka znieczulającego z pudełka przed otwarciem pokrywy, aby zmniejszyć ekspozycję operatora na izofluran.
- Następnie ułóż zwierzę w pozycji na plecach na stole przedoperacyjnym i podłącz je do ciągłego przepływu izofluranu. Za pomocą golarki elektrycznej usuń owłosienie z kończyny tylnej. Aby dokładnie usunąć włosy, zastosuj krem do depilacji.
- Umieść mysz w pozycji na plecach na przykrytej podkładce grzewczej na stole operacyjnym i podłącz ją do ciągłego przepływu izofluranu. Wyprostuj i unieruchom kończynę tylną za pomocą kawałka taśmy. Po zabezpieczeniu kończyny tylnej przemyj skórę trzykrotnie, naprzemiennie stosując betadynę i alkohol. W dalszej części procedury chirurgicznej używaj mikroskopu sekcyjnego z powiększeniem 10X lub 20X, aby uzyskać powiększony obraz obszaru kończyny tylnej.
- Za pomocą pęsety precyzyjnej i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry o długości około 1 cm, od kolana w kierunku przyśrodkowym uda.
- Używając precyzyjnych patyczków bawełnianych zwilżonych solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), delikatnie usuń tkankę tłuszczową podskórną otaczającą mięsień uda.
- Następnie zastosuj kauteryzację w poprzek, aby naciąć i rozdzielić tkankę tłuszczową podskórną, odsłaniając leżącą pod nią tętnicę udową.
- Użyj retraktora, aby rozszerzyć ranę i uzyskać lepszy widok na naczynia krwionośne kończyny dolnej.
- Za pomocą pęsety precyzyjnej i precyzyjnego patyczka bawełnianego delikatnie przebij błoniastą pochewkę tętnicy udowej, aby odsłonić pęczek naczyniowo-nerwowy.
- Następnie, używając czystego zestawu pęsety precyzyjnej i patyczka bawełnianego, wypreparuj i oddziel tętnicę udową od żyły udowej i nerwu w miejscu proksymalnym w pobliżu pachwiny. Po dyssekcji przeprowadź nitkę szwu jedwabnego 7-0 pod proksymalnym końcem tętnicy udowej. Zamknij proksymalną część tętnicy udowej za pomocą podwójnych węzłów. Zawiąż naczynie jak najbliżej proksymalnej krawędzi rany, aby pozostawić odpowiednią długość dla drugiego wiązania i intervening segmentu, który zostanie przecięty.
- Oddziel tętnicę udową od żyły udowej w miejscu dystalnym, blisko kolana. Przeprowadź nitkę szwu 7-0 pod dystalnym końcem tętnicy udowej, proksymalnie względem tętnicy podkolanowej. Zamknij naczynie za pomocą podwójnych węzłów.
- Zamknij dystalną tętnicę udową drugim zestawem podwójnych węzłów tuż proksymalnie od pierwszego zestawu węzłów. Ten drugi zestaw szwów będzie służył do uchwycenia tętnicy podczas procedury przecinania.
- Podobnie, w celu uchwycenia naczynia, zamknij proksymalną tętnicę udową drugim zestawem podwójnych węzłów tuż dystalnie od pierwszego zestawu węzłów.
- Przetnij odcinek tętnicy udowej pomiędzy węzłami dystalnymi a proksymalnymi za pomocą precyzyjnego patyczka bawełnianego i nożyczek sprężynowych. Zachowaj ostrożność, aby nie przebić ściany żyły udowej.
- Usuń retraktor i zamknij nacięcie za pomocą szwów Vicryl 5-0. Szwów tych nie trzeba usuwać w późniejszym czasie, ponieważ rozpuszczają się one samoistnie.
- Po zamknięciu nacięcia umieść zwierzę na przykrytej podkładce grzewczej w klatce regeneracyjnej i monitoruj je不ustannie aż do wybudzenia.
- Po tym, jak zwierzę regenerowało się przez 1 godzinę, przejdź do etapu pomiaru perfuzji krwi metodą laserowego Dopplera, aby potwierdzić indukcję niedokrwienia.
2. Laserowy pomiar przepływu krwi metodą Dopplera
- Aby rozpocząć etap pomiaru perfuzji metodą laserowego dopplera, umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% isofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1L/min.
- Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu utraty reakcji na bodźce zewnętrzne, a następnie wyjmij zwierzę z komory. Zaleca się przed otwarcie pokrywy usunąć środek znieczulający z pudełka, aby zmniejszyć ekspozycję operatora na isofluran.
- Umieść zwierzę na stole przedoperacyjnym podłączonym do ciągłego przepływu isofluranu. Następnie usuń sierść z kończyny tylnej za pomocą golarki elektrycznej, a w razie potrzeby zastosuj krem do depilacji.
- Po usunięciu sierści umieść zwierzę na powierzchni podgrzewanej do 37°C na 5 minut pod ciągłym przepływem isofluranu. Monitoruj temperaturę wewnętrzną, aby zapewnić eutermię, ponieważ zmiany temperatury znacząco wpływają na perfuzję.
- Po 5 minutach ułóż zwierzę w pozycji grzbietowej na powierzchni nieodbijającej i pochłaniającej światło, takiej jak zielone tkanina, podłączając je do ciągłego przepływu isofluranu. Wyprostuj kończyny tylne.
- Następnie włącz obrazowy system laserowego dopplera oraz oprogramowanie do akwizycji i zainicjuj program. Określ rozmiar pola widzenia i rozdzielczość. W celu ułatwienia późniejszej analizy najlepiej zachować spójne pole widzenia i gęstość pikseli dla wszystkich zwierząt.
- Otwórz nowy plik. Naciśnij start, aby rozpocząć zbieranie danych obrazowych. Zazwyczaj urządzenie automatycznie wykrywa odległość myszy, ale jeśli pojawi się prośba, określ odległość zwierzęcia od obrazownika. Laser wyznaczy granice pola widzenia, a następnie rozpocznie akwizycję danych.
- Po zakończeniu akwizycji obraz zacznie wyświetlać zakres kolorów wskazujących poziom perfuzji krwi w kończynach. Kolory można ustawić dla konkretnego zakresu perfuzji, aby lepiej porównać dane między zwierzętami.
- Po zakończeniu zbierania danych zapisz plik.
- Następnie przenieś zwierzę do klatki regeneracyjnej i monitoruj je nieprzerwanie aż do wybudzenia.
- Aby przeanalizować dane, użyj funkcji regulacji progu w oprogramowaniu analitycznym, aby odjąć szum tła. Wartość progu 0,2 jest zazwyczaj odpowiednia. Wyznacz 2 regiony zainteresowania (ROI), które obejmują obszar każdej kończyny tylnej. Do standaryzacji ROI między kończynami i zwierzętami można wykorzystać różne punkty orientacyjne. Następnie wyznacz średnią perfuzję i zmienność w ROI. Można wówczas łatwo określić różnicę w perfuzji oraz stosunek perfuzji między kończyną niedokrwienną a kontrolną.
- Procedurę tę można powtórzyć, aby śledzić zmiany perfuzji kończyn tylnych w czasie. W wybranym punkcie czasowym zwierzę można poddać eutanazji w celu oceny funkcji tkanek i porównania wyników z danymi obrazowymi perfuzji.
3. Reprezentatywne wyniki:
Anatomia naczyń krwionośnych kończyny tylnej przedstawiona jest na Rysunku 12. Reprezentacyjny schemat kończyny tylnej po eksplantacji tętnicy udowej pokazano na Rysunku 2. Aby potwierdzić indukcję niedokrwienia kończyny tylnej, przeprowadzono analizę obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera, która wykazuje gwałtowny spadek przepływu krwi w kończynie niedokrwionej w porównaniu z kończyną kontrolną, co przedstawiono na Rysunku 3.
Rysunek 1. Anatomia naczyń krwionośnych kończyny tylnej. Gwiazdkami oznaczono miejsca podwiązania w celu indukcji niedokrwienia kończyny tylnej.
Rysunek 2. Reprezentatywny schemat przedstawiający anatomię kończyny tylnej po podwiązaniu tętnicy udowej w miejscach proksymalnym i dystalnym po usunięciu tętnicy udowej.
Rysunek 3. Obrazy z laserowej dopplerometrii pokazujące przepływ krwi przed i po wywołaniu niedokrwienia w lewej kończynie tylnej (wskazanej strzałką).
Dyskusja
Podczas planowania i przeprowadzania modeli niedokrwienia kończyn dolnych należy wziąć pod uwagę kilka źródeł zmienności. Po pierwsze, stopień niedokrwienia może różnić się w zależności od miejsca podwiązania w stosunku do odgałęzień bocznych. Dlatego, dla zachowania spójności modelu, zwierzęta powinny zostać poddane podwiązaniu tętnicy na tym samym poziomie. Innym źródłem zmienności w regeneracji niedokrwiennej jest wiek zwierząt; młodsze osobniki (6–8 tygodni) wykazują szybszy i pełniejszy stopień regeneracji niż zwierzęta starsze (8–10 miesięcy), co potwierdzają pomiary hemodynamiczne (np. laserowy pomiar przepływu Dopplerem) lub funkcjonalne (np. testy na bieżni). W badaniach nad czynnikami angiogennymi może być korzystniejsze zastosowanie starszych zwierząt, ponieważ interwencja terapeutyczna może przynieść wyraźniejszą różnicę między grupami. Z kolei w badaniach nad czynnikami antyangiogennymi może być preferowane użycie młodszych zwierząt, aby zmaksymalizować wielkość efektu3.
Przy prawidłowym wykonaniu powikłania, takie jak krwawienie, infekcja czy śmiertelność, powinny być minimalne. W przypadku wystąpienia krwawienia w wyniku przypadkowego uszkodzenia żyły udowej lub innych naczyń, w miejscu krwotoku należy zastosować umiarkowany ucisk za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką lub gazy, aż do czasu ustąpienia krwawienia. Zwierzęta wykazujące objawy infekcji powinny być leczone środkami przeciwinfekcyjnymi. Zwierzęta z istotną gangreną mogą wymagać eutanazji. Powikłanie to występuje częściej u starszych zwierząt oraz u niektórych szczepów, takich jak myszy BALB c4. Ponadto model niedokrwienia kończyn dolnych może powodować lekki lub umiarkowany ból. W związku z tym, zgodnie z zaleceniami IACUC, w razie potrzeby należy podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina lub karprofen, w celu leczenia bólu.
Podsumowując, zaprezentowaliśmy prostą i powtarzalną metodę badania PAD w mysim modelu niedokrwienia kończyny dolnej. Model niedokrwienia kończyny dolnej z analizą obrazowania laserowskim Dopplerem stanowi doskonały system do badania patologii naczyniowych oraz oceny potencjalnych środków terapeutycznych.
Podziękowania
Autorzy dziękują Andreie Axtell, dr. Satoshi Itoh, dr. Jeffowi Velottcie, Grantowi Hoytowi, dr. Robertowi C. Robbinsowi, dr. Jin Yu, dr. Timowi Doyle’owi oraz Stanford Small Animal Imaging Core za pomoc techniczną. Autorzy dziękują również firmie A.M. Bickford, Inc. za wsparcie w zakresie sprzętu weterynaryjnego. Badania te były finansowane z grantów badawczych National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), California Tobacco Related Disease Research Program Uniwersytetu Kalifornijskiego (15IT-0257 i 1514RT-0169) oraz California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183). N.H. otrzymuje wsparcie w ramach stypendium z American Heart Association.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Narzędzia chirurgiczne | Narzędzie | Fine Science Tools | ||
| Patyczki bawełniane Constix | Narzędzie | Contec | SC-4 | |
| Betadine (powidonu jodowy | Odczynnik | PDI | ||
| 70% alkohol | Odczynnik | Kendall | ||
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | Odczynnik | Invitrogen | ||
| Nici jedwabne 7-0 | Narzędzie | Genzyme | ||
| Nici vicryl 5-0 | Narzędzie | Ethicon Inc. | ||
| Golarka elektryczna | Narzędzie | GE Healthcare | ||
| Kauteryzator | Narzędzie | Baxter Internationl Inc. | ||
| System Laser Doppler i PeriScan PIM 3 | Urządzenie | Perimed |
Bibliografia
- Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2008).
- Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).
- Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).
- Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
Przedruki i uprawnienia
