Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Podsumowanie

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Streszczenie

Technologia MACS Cytokine Secretion Assay umożliwia wykrywanie wydzielanych cytokin na poziomie pojedynczych komórek oraz czułą izolację żywych komórek wydzielających cytokiny. W celu znakowania komórek wydzielających IL-17 przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek splenocytów mysich, które następnie stymuluje się w temperaturze 37°C za pomocą PMA/ionomycyny w celu indukcji sekrecji cytokin. Aby zatrzymać sekrecję, komórki umieszcza się na lodzie i poddaje działaniu odczynnika IL-17 Catch Reagent – przeciwciała bispecyficznego, które wiąże się z CD45 na powierzchni komórek leukocytów oraz z IL-17 w momencie jej wydzielania, wychwytując ją w pobliżu powierzchni komórki. Następnie sekrecję ponownie uruchamia się poprzez zwiększenie temperatury do 37°C, a IL-17 jest wychwytywana przez Catch Reagent. Kolejnie sekrecję ponownie zatrzymuje się, umieszczając komórki na lodzie. Aby wykryć wychwycone IL-17, komórki inkubuje się z drugim przeciwciałem specyficznym dla IL-17 sprzężonym z biotyną oraz przeciwciałem Anti-Biotin-PE. Komórki mogą teraz zostać poddane bezpośredniej analizie metodą cytometrii przepływowej lub przygotowane do izolacji i wzbogacenia poprzez późniejsze znakowanie MicroBeads sprzężonymi z Anti-PE.

Protokół

Przygotowanie odczynników

1. Przygotować bufor zawierający PBS z BSA (0,5%) oraz 2 mM EDTA. Ponieważ pęcherzyki powietrza mogą blokować kolumny separacyjne MACS, bufor musi zostać odgazowany i przechowywany w temperaturze 2-8°C przed użyciem.
2. Stosujemy pożywkę RPMI 1640 zawierającą 5% surowicy mysiej. Pożywka hodowlana nie powinna zawierać BSA ani FCS, ponieważ związki te zmieniają specyficzność stymulacji komórek.
3. Zestaw do wzbogacania komórek i detekcji wydzielania IL-17 u myszy (Mouse IL-17 Secretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit) firmy Miltenyi-Biotec. Zestaw zawiera następujące komponenty: odczyn wychwytujący IL-17 (IL-17 Catch Reagent), przeciwciało detekcyjne IL-17 (biotynylowane), Anti-Biotin-PE oraz mikrokuleczki Anti-PE.

Stymulowanie splenocytów

1. Protokół ten wykonuje się w obecności kontroli negatywnej i pozytywnej, takich jak nieymulowane splenocyty oraz barwienie kontrastowe dla limfocytów T. Procedurę przeprowadzono z zachowaniem zasad aseptyki.
2. Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek ze splenocytów mysich wyizolowanych za pomocą urządzenia gentleMACS™ Dissociator. Stężenie komórek powinno zostać wcześniej określone poprzez zliczenie komórek. Odwiruj komórki przy 200×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Po odwirowaniu odessać supernatant znad osadu za pomocą pipety. Nie wysypywać zawartości probówki, aby uniknąć utraty osadu.
4. Następnie resuspenduj komórki w medium hodowlanym, a potem przenieś je do studzienki. Dodaj odpowiednią ilość medium, aby uzyskać stężenie dziesięciu milionów komórek na mL i pięć milionów komórek na cm².
5. Aby stymulować odpowiedź immunologiczną w resuspendowanych komórkach, do próbki dodajemy ionomycin (1 μg/mL) i PMA (10 ng/mL), a następnie mieszamy roztwór, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie studzienki są odpowiednio opisane.
6. Teraz inkubujemy komórki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C bez mieszania, aby rozpocząć okres stymulacji. Przejdź do analizy IL-17 3 godziny od rozpoczęcia stymulacji, planując czas odpowiednio.
7. Aby zatrzymać sekrecję, komórki umieszcza się na lodzie, a następnie zbiera stymulowane komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół z użyciem zimnego buforu. Komórki są następnie przenoszone ze studzienki do probówki i płukane po raz drugi.
8. Aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane, warto sprawdzić naczynie pod mikroskopem. Jeśli niektóre komórki nadal pozostają przytwierdzone, można je zebrać, płucząc naczynie zimnym buforem. Wszelkie skupiska komórek w zawiesinie można usunąć za pomocą filtrów do wstępnej separacji.

Znakowanie komórek odczynnikiem wychwytującym

1. Należy przede wszystkim zauważyć, że ten test działa optymalnie, gdy obecność komórek wydzielających IL-17 wynosi mniej niż 2%.
2. Jeśli przewiduje się, że stężenie komórek wydzielających IL-17 będzie większe niż 2%, należy odpowiednio dostosować objętości.
   
3. Potencjalną pułapką w tej procedurze jest kontaminacja krzyżowa odczynnika Catch Reagent, która może wystąpić podczas znakowania, gdy przeciwciało bispecyficzne zwiąże się z niewydzielającą limfocytem T i uwięzi IL-17 wydzielone przez sąsiedni limfocyt, generując w ten sposób wyniki fałszywie dodatnie.
4. Aby uniknąć tego problemu, krytyczne jest schłodzenie komórek przed znakowaniem oraz praca z zimnym buforem, aby spowolnić dyfuzję IL-17 i zapobiec tej kontaminacji krzyżowej. Oprócz utrzymywania komórek w niskiej temperaturze, muszą one być utrzymywane w określonym stężeniu.
5. Aby rozpocząć procedurę znakowania, używamy dziesięciu milionów komórek w probówce zamykanej o pojemności 15 ml. Jeśli konieczne jest użycie większej liczby komórek, należy po prostu odpowiednio zwiększyć wszystkie objętości. Po uzyskaniu optymalnego stężenia komórek, należy je przemyć, dodając 10 ml zimnego buforu.
6. Wirować komórki przy 300×g przez 10 minut w wirówce chłodzącej (2–8 °C).
7. Po odwirowaniu całkowicie odessać supernatant za pomocą pipety. Nie należy zlewać supernatantu, ponieważ doprowadzi to do utraty komórek i niedokładności objętości. Powtórzyć etap płukania, który polega na dodaniu 10 ml zimnego buforu, wirowaniu i odessaniu.
8. Po uzyskaniu osadu o pożądanej czystości, zawiesić komórki w 80 μL zimnej pożywki hodowlanej. W celu ich oznakowania dodajemy teraz 20 μL Mouse IL-17 Catch Reagent.
9. Inkubować komórki przez 5 minut na lodzie.
10. Po 5-minutowym okresie inkubacji na lodzie, wyjąć probówkę i rozcieńczyć komórki w 10 ml podgrzanej do 37°C pożywki. Następnie umieścić probówkę w rotatorze MACSmix Tube Rotator i inkubować w temperaturze 37°C przez 45 min przy ciągłym ruchu. Podniesienie temperatury do 37°C wznowi wydzielanie cytokin.

Znakowanie komórek przeciwciałem do wykrywania IL-17 (biotynowanym) oraz przeciwciałem antybiotyna-PE

1. Po 45-minutowym okresie sekrecji w temperaturze 37°C natychmiast umieść probówkę na lodzie. Przerwie to sekrecję cytokin. Od tego momentu krytyczne jest utrzymywanie komórek na lodzie. Praca z zimnym buforem zapobiegnie zanieczyszczeniu krzyżowemu odczynnika Catch Reagent.
2. Napełnij probówkę zimnym buforem i wiruj przy 300xg w temperaturze 2–8 °C przez 10 min. Całkowicie odessij supernatant. Powtórz etap płukania jeszcze raz.
3. Osad komórkowy resuspenduj w 80 μL zimnego buforu i umieść probówkę na lodzie.
4. Aby uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał, zalecamy dodanie 10µl FcR Blocking Reagent i inkubację na lodzie przez 5 min. Następnie dodajemy 20 μL przeciwciała wykrywającego Mouse IL-17 Detection Antibody (Biotin), które jest koniugowane z biotyną, i inkubujemy przez 10 minut na lodzie.
5. Ponownie opłucz komórki w sposób opisany wcześniej, dodając 10 mL zimnego buforu i wirując przy 300xg w temperaturze 2–8 °C przez 10 min.
6. Teraz odessij supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 80 µl zimnego buforu.
7. Dodaj 20 μL naszego przeciwciała wtórnego, Anti-Biotin-PE.
8. Wymieszaj komórki z roztworem przeciwciała wtórnego i ponownie inkubuj probówkę przez 10 minut na lodzie.
9. Po zakończeniu tej drugiej inkubacji opłucz komórki 10 mL zimnego buforu i odwiruj.
10. Osad można teraz resuspender w 500 μL zimnego buforu.
11. Jeśli komórki muszą zostać wyizolowane do dalszych analiz, można je znakować magnetycznie za pomocą Anti-PE-MicroBeads i separować ręcznie lub automatycznie przy użyciu kolumn MACS oraz separatorów MACS.
12. Znakowanie splenocytów zostało zakończone i próbki są gotowe do analizy.

Analiza FACS

1. W ramach analizy porównamy stymulowane i nestymulowane splenocyty za pomocą cytometrii przepływowej.
2. Przed analizą cytometryczną komórki barwi się jodkiem propidyny w stężeniu 0,5 μg/mL w celu wykluczenia martwych komórek. Do analizatora MACSQuant™ wprowadzono 200 000 komórek dla każdej próbki; teraz przeanalizujemy wykresy rozrzutu względnej reaktywności przeciwciał w próbkach. Dwie istotne kwestie przy analizie rzadkich komórek – takich jak komórki pozytywne dla IL-17 – za pomocą cytometrii przepływowej to:
   • ustawienie bramki dla limfocytów na wykresie rozrzutu światła przedniego (forward scatter) względem światła bocznego (side scatter)
   • oraz wykluczenie martwych komórek (zbarwionych jodkiem propidyny) i limfocytów B (które mogą powodować nieswoiste barwienie tła), aby zwiększyć czułość detekcji
3. Do wykrywania limfocytów T zastosowano przeciwciało CD4-APC, a do wykrywania limfocytów B przeciwciało CD45R/B220-PerCP. Analizujemy właściwości rozproszenia światła przedniego i bocznego próbek i nakładamy bramkę na populację limfocytów.
4. Zastosowano drugą bramkę, aby zidentyfikować zbarwione martwe komórki oraz zbarwione limfocyty B (oś Y). Komórki te są wykluczane z analizy limfocytów T.
5. W tym przykładzie, który stanowi w istocie naszą kontrolę negatywną, widać, że w próbkach niestymulowanych znajduje się bardzo mało wydzielających IL-17 limfocytów T pozytywnych dla CD4 – około 0,003% (Rycina 4). Analizując populację stymulowanych limfocytów T, obserwujemy znaczną liczbę limfocytów T pozytywnych dla CD4 wydzielających IL-17 – około 0,367% (Rycina 5A) przed separacją oraz 60,76% po separacji magnetycznej z wykorzystaniem technologii MACS (Rycina 5B).

Dyskusja

Komórki TH17 odgrywają istotną rolę w odporności adaptacyjnej i odpowiedzi zapalnej, stanowiąc kluczowy element napędzający zapalenie autoimmunizacyjne.

Niniejszy film dokumentuje sposób użycia zestawu Miltenyi Mouse IL-17 Secretion Assay – Cell Enrichment and Detection Kit (PE). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest oszacowanie częstotliwości występowania komórek wydzielających IL-17 w początkowej preparacji komórkowej. Odpowiednie stężenie komórek podczas etapu znakowania oraz okresu wydzielania cytokin zapobiega kontaminacji krzyżowej przez inne komórki w zawiesinie i zapewnia wiarygodne wyniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do wzbogacania i detekcji komórek w teście wydzielania IL-17 u myszy (PE)	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-094-213	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx
RPMI 1640	Pożywka	Miltenyi Biotec	130-091-440	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx
CD4-APC	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-091-611	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx
CD8a-FITC	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-091-605	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx
Roztwór jodku propidyny	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx
Odczynnik blokujący FcR, mysi	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-092-575	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx
Zestaw do usuwania martwych komórek	Odczynnik	Miltenyi Biotec	130-090-101
Mieszalnik do probówek MACSmix	Urządzenie	Miltenyi Biotec	130-090-753	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Dysocjator gentleMACS™	Urządzenie	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
Zestaw startowy autoMACS Pro	Urządzenie	Miltenyi Biotec	130-092-545	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx
Kolumny MACS	Narzędzie	Miltenyi Biotec		http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx
Separator MACS	Narzędzie	Miltenyi Biotec