W niniejszej pracy opisujemy sposób unieruchomienia muchy w aparaturze do magnetycznego unieruchomienia węchowego (OMT). Opisujemy sposób ustawienia magnesów ziem rzadkich oraz portów zapachowych, a także sposób konfiguracji przepływów masowych dla podawania bodźca i ssania próżniowego w celu uzyskania optymalnego śledzenia zapachu.
Artykuł metodologiczny
Magnetyczny system wiązania do badania kontroli lotu zapośredniczonej przez wzrok i węch u Drosophila
Otwiera się w nowej karcie
W tym artykule
Podsumowanie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Streszczenie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Od wielu lat wiadomo, że owady wykorzystują wskazówki wizualne do stabilizacji kierunku lotu w strumieniu powietrza. Wiele zwierząt śledzi zapachy przenoszone przez wiatr. W związku z tym wizualna stabilizacja śledzenia kierunku podwiatrowego bezpośrednio wspomaga śledzenie zapachu. Czy jednak sygnały olfaktoryczne bezpośrednio wpływają na zachowanie śledzenia wizualnego niezależnie od wskazówek wiatru? Ponadto ostatni wysyp badań nad neurofizjologią i neurobehawioralną genetyką węchu u Drosophila stał się motywacją do opracowania coraz bardziej zaawansowanych technicznie i ilościowych testów behawioralnych. W niniejszej pracy zmodyfikowaliśmy system magnetycznego uwięzienia, pierwotnie zaprojektowany do eksperymentów nad wzrokiem, poprzez wyposażenie areny w wąskie, laminarne pióropusze zapachowe. Mucha zostaje przyklejona do małego stalowego pinu i zawieszona w polu magnetycznym, które umożliwia jej swobodny obrót wokół osi pionowej. Pióropusze zapachowe pożywienia o małej średnicy są kierowane w dół nad głową muchy, co wywołuje stabilne śledzenie u głodnego owada. W niniejszym opracowaniu skupiamy się na kluczowych aspektach mechanicznych uwięzienia, ustawianiu magnesów, projektowaniu pióropusza zapachowego oraz potwierdzaniu stabilnego śledzenia zapachu.
Protokół
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wstęp
OMT jest adaptacją systemu uwięzi magnetycznej [1], zaprojektowaną w celu włączenia „wirtualnego symulatora pióropusza”. Poniższe protokoły wyjaśnią, jak prawidłowo przywiązywać muchy (Część 1) oraz przedstawią strategie konfiguracji magnesów (Część 2) i systemu dostarczania zapachów regulowanego przepływem masowym (Część 3). Opisane tutaj informacje są zoptymalizowane dla tego konkretnego systemu i mogą różnić się w przypadku komponentów o innych specyfikacjach technicznych.
Część 1: Unieruchamianie much
Kroki mocowania opisane w niniejszym opracowaniu są podobne do wielu wcześniejszych badań [2], lecz zostały dostosowane do zastosowania w OMT [3]. Prawidłowe mocowanie jest kluczowe dla zapewnienia solidnych i powtarzalnych prób doświadczalnych. Znaczenia starannego mocowania nie można przecenić.
- Zebrać muchy od 4 do 6 dni po wykluciu i poddać je głodzeniu przez 4-6 godzin. Do fiolki bez pożywki włożyć zwilżony wodą ręcznik papierowy Kimwipe, aby zapobiec wysuszeniu.
- Przenieść partię much z butelki do małej fiolki i umieścić ją w mosiężnym bloku na platformie chłodzącej Peltiera ustawionej na około 4 °C. Odpowiednia temperatura znieczula muchy w ciągu około 30 sekund.
- Posegregować muchy na zimnej powierzchni platformy chłodzącej. Wilgotny ręcznik Kimwipe zapewnia stałe chłodzenie i odprowadzanie wilgoci z kutykuli. Do unieruchomienia (tethering) wybrać największe samice.
- Za pomocą cienkiego pędzla przesunąć pojedynczą muchę na właściwą pozycję w specjalnie wykonanym sarkofagu, dopasowanym rozmiarem do jednej samicy muszki owocówki typu dzikiego.
Rysunek 1.
Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku. - Ustawić pin minutien (Fines Science Tools) z prętem magnetycznym zamocowanym na mikromanipulatorze. Pin należy wyrównać tak, aby jego tępy koniec dotykał grzbietowej części klatki piersiowej tuż za głową, pomiędzy skrzydłami. Patrząc od przodu w stronę oczu, pin powinien być idealnie pionowy. Nie można dopuścić nawet niewielkiego „przechyłu” (roll) między muchą a pinem. Kąt widoku z boku między pinem a długą osią ciała powinien wynosić 30 stopni w górę względem horyzontu (Rys. 1). Uwaga: Dla optymalnego działania w uchwycie magnetycznym piny mogą wymagać skrócenia. Zależy to całkowicie od odległości między magnesami zawieszenia.
- Po wyrównaniu pinu minutien użyć cienkiego stalowego drutu, aby nanieść małą kroplę kleju utwardzanego promieniami UV (ElectroLite Corp) na tępy koniec pinu.
- Manipulować pinem tak, aby kropla kleju dotknęła klatki piersiowej muchy tuż nad głową. Przy odpowiedniej wielkości kropli klej powinien rozprzestrzenić się z pinu na klatkę piersiową. Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej ilości kleju.
- Utwardzić klej za pomocą dwóch 20-sekundowych impulsów światła UV.
- Odłożyć unieruchomioną muchę na bok i powtórzyć procedurę. Wyciąć małe kwadraty z ręcznika Kimwipe i za pomocą pęsety podać jeden każdej unieruchomionej muszce, aby ograniczyć jej lot.
- Po godzinie regeneracji unieruchomione muchy są gotowe do eksperymentów.
- Niewłaściwe przyklejenie może utrudnić funkcjonowanie muchy w arenie magnetycznej. Przed każdym eksperymentem należy sprawdzić każdą muchę pod kątem płynnej rotacji, aby upewnić się, że jest prawidłowo przyklejona. Można to osiągnąć poprzez rotowanie wzoru paskowego o wystarczająco dużym okresie przestrzennym, aby wywołać silne odpowiedzi optomotoryczne [4]. Jeśli mucha jest przyklejona pod niewłaściwym kątem pochylenia (pitch) lub jest przechylona na pinie względem osi roll, mucha może (i) w ogóle się nie obracać, (ii) mieć ograniczony zakres ruchu lub (iii) obracać się z niestabilną prędkością. W takich przypadkach muchę należy odrzucić i zastąpić nową. Jeśli to rozwiąże problem, przyczyną było najprawdopodobniej nieprawidłowe przyklejenie (jeśli wymiana muchy nie rozwiązuje problemu, należy przejść do części 2.4).
Część 2: Wyrównywanie magnesów
Prawidłowe wyrównanie magnesów (Rare-earth-magnets.com) jest niezbędne, aby mucha mogła uzyskać płynny zakres ruchu o 360 stopni. Należy wykonać poniższe kroki, aby prawidłowo wyrównać magnesy.
- Dolne magnesy pierścieniowe są utrzymywane poziomo przez plastikową tuleję i umieszczone bezpośrednio na przezroczystej komorze próżniowej (Rys. 1; opisano szerzej w części 3). Górny magnes prętowy jest zamocowany pionowo około 3/4" powyżej dolnych magnesów.
- Wstępnie wyrównaj górny i dolny magnes wizualnie, umieszczając górny magnes prętowy bezpośrednio nad punktem centralnym dolnych magnesów pierścieniowych. Przydatne jest zamocowanie górnego magnesu do mikromanipulatora (Siskiyou Inc.) w celu przeprowadzenia precyzyjnej regulacji.
- Przyklej za pomocą epoksydowej żywicy łożysko V-jewel (Small Parts) do dolnej powierzchni górnego magnesu, aby zminimalizować tarcie obrotowe i ustandaryzować pozycjonowanie muchy.
- Umieść muchę w arenie i dostosuj poziome oraz pionowe położenie górnego magnesu, aż mucha będzie mogła płynnie i jednostajnie obracać się o 360 stopni w osi odrywania (yaw). Każdą muchę należy sprawdzić pod kątem płynności obrotu na początku każdego eksperymentu, aby upewnić się, że magnesy są prawidłowo wyrównane i że poszczególne piny minutien nie są uszkodzone (patrz część 1.11). Jeśli magnesy nie są prawidłowo wyrównane, mucha może (i) w ogóle się nie obracać, (ii) mieć ograniczony zakres ruchu, (iii) obracać się z niejednostajną prędkością. Jeśli problem zostanie rozwiązany poprzez zastąpienie muchy nową, wynikało to najprawdopodobniej z problemu z klejeniem (patrz część 1). Jeśli problemy te występują przy każdej musze, prawdopodobnie jest to kwestia wyrównania magnesów i wymagana będzie dalsza regulacja.
- Ostrzeżenie: choć zabawa z magnesami ziemi rzadkich może wydawać się interesująca, są one bardzo niebezpieczne. Niewłaściwe użytkowanie prowadzi do uszkodzenia sprzętu i/lub lekkich obrażeń ciała. Zachowaj szczególną ostrożność przy tych atrakcyjnych, lecz łatwo niedocenianych magnesach.
Część 3: Podawanie zapachów
- System dostarczania zapachów opiera się na rozwiązaniu opisanym wcześniej [5] i jest najtrudniejszą częścią do optymalizacji (Rys. 1). Wymaga on dużej cierpliwości oraz metody prób i błędów. Należy postępować zgodnie z poniższymi krokami, aby uzyskać stabilne śledzenie zapachu.
- Wstępna konfiguracja systemu zapachowego wymaga poprowadzenia wąskich rurek teflonowych (Small Parts) z multipleksera gazów (Sable Systems International) do specjalnie wykonanych fiolek z wodą/zapachem. Wylot tych fiolek łączy się bezpośrednio z rurkami portów hipodermicznych, używając tych samych rurek teflonowych.
- Przezroczysta akrylowa komora próżniowa jest umieszczona pod areną w celu podtrzymania magnesów. Stosujemy zamontowaną pod muchą szklaną rurkę o średnicy 4mm, połączoną z komorą próżniową, aby zbliżyć otwór próżniowy do muchy i zmniejszyć średnicę otworu.
- Za pomocą pęsety umieść przymocowaną muchę w arenie.
- Włącz zapach wabiący (dobrze sprawdza się ocet jabłkowy) i wizualnie sprawdź, czy mucha śledzi zapach. Jeśli mucha nie wykazuje preferencji wobec zapachu, wykonaj trzy kolejne kroki. Może to wymagać użycia kilku much i przeprowadzenia kilku prób.
- Koryguj położenie portu zapachowego, aż mucha zacznie śledzić zapach. Porty zapachowe zamontowaliśmy na mikromanipulatorach (Siskiyou Inc.) i ustawiliśmy 4mm grzbietowo oraz 3mm przedniej części względem głowy muchy.
- Dostosuj masowy strumień przepływu, aż mucha zacznie śledzić zapach. Nasze ustawienia to 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
- Dostosuj natężenie przepływu próżni, aż mucha zacznie śledzić zapach. Natężenie przepływu próżni ustawiliśmy na 13l/min za pomocą regulatora przepływu (Cole Parmer). Uwaga: Budynkowe linie zasilania próżnią mogą w czasie wykazywać wahania, co powoduje zmiany w strukturze pióropusza zapachowego. W celu zapewnienia stałych warunków przepływu próżni może być przydatne podłączenie zewnętrznej pompy próżniowej do regulatora przepływu.
- Po ustawieniu pozycji portu i natężeń przepływu, okresowo przełączaj się między dostarczaniem pary wodnej a pary zapachowej za pomocą multipleksera gazów i wizualnie weryfikuj, czy mucha śledzi zapach tylko wtedy, gdy jest on podawany. Czasami resztkowy zapach wewnątrz portu może wywołać śledzenie zapachu po jego wyłączeniu. Można to wyeliminować bez usuwania prawidłowo ustawionego portu zapachowego, napełniając rurki hipodermiczne etanolem i zbierając go na końcówce doprowadzającej za pomocą chusteczki Kimwipe. Za pomocą sprężonego powietrza wydmuchaj pozostały etanol i wznowij eksperymenty.
Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym wykonaniu tych kroków należy zaobserwować dwie rzeczy. Po pierwsze, podczas stałej rotacji bodźców wizualnych, przymocowana mucha umieszczona w OMT powinna płynnie obracać się o 360 stopni w osi odchylenia (yaw). „Szarpane” obroty (zwane sakadami) są charakterystyczne dla spontanicznego zachowania obrotowego w przypadku braku stałych bodźców wizualnych. Jeśli muchy najwyraźniej nie mogą obracać się płynnie, przyczyną może być niewłaściwe przyklejenie (patrz Część 1) lub źle wyrównane magnesy (patrz Część 2). Po drugie, po włączeniu zapachu mucha powinna skierować się w stronę źródła zapachu. Po wyłączeniu zapachu mucha powinna wykonywać spontaniczne sakady, nie wykazując preferencji do żadnej konkretnej pozycji w arenie. Jeśli muchy nie śledzą aktywnie smug zapachowych, konieczna może być regulacja położenia portu zapachowego, szybkości przepływu powietrza i/lub szybkości przepływu próżni (patrz Część 3).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przywiązanie much i wywołanie stabilnego śledzenia zapachu w tej arenie jest stosunkowo proste. Wymaga to jednak praktyki, cierpliwości oraz metody prób i błędów. Wiele elementów tej areny można dodatkowo zoptymalizować lub zastąpić, aby uzyskać warianty o innym potencjale eksperymentalnym. Na przykład nowsze wersje komory próżniowej są znacznie mniejsze i zapewniają więcej miejsca pod areną. Ponadto można nieco zmieniać siłę i rodzaj magnesów ziem rzadkich oraz dodać dodatkowe porty zapachowe, aby zwiększyć liczbę rodza...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Finansowanie zapewnione przez National Science Foundation (M.F.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stopień chłodzenia | Teca | LHP-300CP | |
| Mosiężny blok chłodzący | Wykonany na zamówienie | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarkofag | Wykonany na zamówienie | Skontaktuj się z nami w celu uzyskania szczegółów | |
| Klej utwardzany promieniami UV | Kemxert corp | KOA300 | Butelka 1oz wystarcza na lata |
| System paneli | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Pincety precyzyjne | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Magnesy dolnego pierścienia | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75" średnica zewnętrzna x 0.375" średnica wewnętrzna x 0.125" |
| Magnes górnego pręta | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| Łożysko V-Jewel | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| Regulatory przepływu MFC-4 | Sable Systems International | ||
| Multipleksor gazowy | Sable Systems International | ||
| Przewody teflonowe | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| Igły hipodermiczne 20G | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Rurki szklane | 4mm średnica zewnętrzna | ||
| Regulator przepływu próżni | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
Bibliografia
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie