Magnetyczny system wiązania do badania kontroli lotu zapośredniczonej przez wzrok i węch u Drosophila

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy sposób unieruchomienia muchy w aparaturze do magnetycznego unieruchomienia węchowego (OMT). Opisujemy sposób ustawienia magnesów ziem rzadkich oraz portów zapachowych, a także sposób konfiguracji przepływów masowych dla podawania bodźca i ssania próżniowego w celu uzyskania optymalnego śledzenia zapachu.

Streszczenie

Od wielu lat wiadomo, że owady wykorzystują wskazówki wizualne do stabilizacji kierunku lotu w strumieniu powietrza. Wiele zwierząt śledzi zapachy przenoszone przez wiatr. W związku z tym wizualna stabilizacja śledzenia kierunku podwiatrowego bezpośrednio wspomaga śledzenie zapachu. Czy jednak sygnały olfaktoryczne bezpośrednio wpływają na zachowanie śledzenia wizualnego niezależnie od wskazówek wiatru? Ponadto ostatni wysyp badań nad neurofizjologią i neurobehawioralną genetyką węchu u Drosophila stał się motywacją do opracowania coraz bardziej zaawansowanych technicznie i ilościowych testów behawioralnych. W niniejszej pracy zmodyfikowaliśmy system magnetycznego uwięzienia, pierwotnie zaprojektowany do eksperymentów nad wzrokiem, poprzez wyposażenie areny w wąskie, laminarne pióropusze zapachowe. Mucha zostaje przyklejona do małego stalowego pinu i zawieszona w polu magnetycznym, które umożliwia jej swobodny obrót wokół osi pionowej. Pióropusze zapachowe pożywienia o małej średnicy są kierowane w dół nad głową muchy, co wywołuje stabilne śledzenie u głodnego owada. W niniejszym opracowaniu skupiamy się na kluczowych aspektach mechanicznych uwięzienia, ustawianiu magnesów, projektowaniu pióropusza zapachowego oraz potwierdzaniu stabilnego śledzenia zapachu.

Protokół

Wstęp

OMT jest adaptacją magnetycznego systemu przywiązywania [1], zaprojektowaną w celu włączenia „wirtualnego symulatora pióropusza zapachowego”. Poniższe protokoły wyjaśnią, jak prawidłowo przywiązywać muchy (Część 1), oraz przedstawią strategie konfiguracji magnesów (Część 2) i systemu dostarczania zapachów z regulowanym przepływem masy (Część 3). Opisane tutaj informacje są zoptymalizowane pod kątem tego konkretnego systemu i mogą różnić się w przypadku komponentów o innych specyfikacjach technicznych.

Część 1: Uwiązanie much

Opisane tutaj etapy przymocowania są podobne do wielu wcześniejszych badań [2], lecz zostały dostosowane do zastosowania w OMT [3]. Prawidłowe przymocowanie jest kluczowe dla zapewnienia rzetelnych i powtarzalnych prób doświadczalnych. Znaczenia starannego przymocowania nie można przecenić.

1. zebrać muchy 4-6 dni po wykluciu i poddać je głodzeniu przez 4-6 godzin. W fiolce bez pożywki umieścić zwilżony wodą ręcznik Kimwipe, aby zapobiec wysychaniu.
2. przenieść partię much z butelki do małej fiolki i włożyć ją do mosiężnego bloku na platformie chłodzącej Peltiera ustawionej na około 4°C. Odpowiednia temperatura znieczula muchy w ciągu około 30 sekund.
3. posegregować muchy na zimnej powierzchni platformy chłodzącej. Wilgotny ręcznik Kimwipe zapewnia stałe chłodzenie i odprowadzanie wilgoci z kutykuli. Wybrać największe samice do unieruchomienia (tethering).
4. za pomocą cienkiego pędzelka przesunąć pojedynczą muchę do pozycji w specjalnie zbudowanym sarkofagu, dostosowanym do rozmiarów jednej samicy muszki owocówki typu dzikiego.
   
   Rycina 1.
   Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny.
5. umieścić szpilkę minutien (Fines Science Tools) z prętem magnetycznym zamontowanym na mikromanipulatorze. Szpilka powinna być ustawiona tak, aby tępy koniec dotykał grzbietowej strony klatki piersiowej tuż za głową, pomiędzy skrzydłami. Patrząc od przodu na oczy, szpilka powinna być idealnie pionowa. Niedopuszczalne jest nawet niewielkie odchylenie (roll) między muchą a szpilką. Kąt widoku z boku między szpilką a długą osią ciała powinien wynosić 30 stopni w górę względem poziomu (Ryc. 1). Uwaga: Dla optymalnego działania w uchwycie magnetycznym szpilki mogą wymagać skrócenia. Zależy to całkowicie od odległości między magnesami zawieszenia.
6. po ustawieniu szpilki minutien, za pomocą cienkiego stalowego drutu nanieść małą kroplę kleju aktywowanego promieniami UV (ElectroLite Corp) na tępy koniec szpilki.
7. manipulować szpilką tak, aby kropla kleju dotknęła klatki piersiowej muchy tuż nad głową. Przy odpowiedniej wielkości kropli klej powinien stopić się i spłynąć z szpilki na klatkę piersiową. Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej ilości kleju.
8. utwardzić klej za pomocą dwóch 20-sekundowych impulsów światła UV.
9. odłożyć unieruchomioną muchę i powtórzyć czynność. Wyciąć małe kwadraty z ręcznika Kimwipe i za pomocą pęsety podać jeden każdej unieruchomionej muszce, aby ograniczyć jej lot.
10. po godzinie regeneracji unieruchomione muchy są gotowe do eksperymentów.
11. nieprawidłowe przyklejenie może utrudnić zdolność muchy do funkcjonowania w arenie magnetycznej. Każda mucha powinna zostać sprawdzona pod kątem płynności obrotu na początku każdego eksperymentu, aby upewnić się, że są one prawidłowo przyklejone. Można to osiągnąć poprzez obracanie wzoru paskowego o dostatecznie dużym okresie przestrzennym, aby wywołać silne odpowiedzi optomotorowe [4]. Jeśli mucha jest przyklejona pod złym kątem nachylenia lub jest pochylona na szpilce względem osi obrotu, mucha może (i) w ogóle się nie obracać, (ii) mieć ograniczony zakres ruchu lub (iii) obracać się z niestabilną prędkością. W powyższych przypadkach mucha powinna zostać odrzucona i zastąpiona nowym osobnikiem. Jeśli to rozwiąże problem, najprawdopodobniej wynikało on z nieprawidłowego przyklejenia. (jeśli wymiana muchy nie rozwiązuje problemu, należy przejrzeć Część 2.4)

Część 2: Wyrównywanie magnesów

Prawidłowe wyrównanie magnesów (Rare-earth-magnets.com) jest niezbędne, aby mucha mogła uzyskać płynny zakres ruchu o 360 stopniach. Wykonaj poniższe kroki, aby odpowiednio wyrównać magnesy.

1. Dolne magnesy pierścieniowe są utrzymywane poziomo przez plastikową tuleję i umieszczone bezpośrednio na przejrzystej komorze próżniowej (Ryc. 1; opisano szczegółowo w części 3). Górny magnes prętowy jest zamocowany pionowo około 3/4" powyżej dolnych magnesów.
2. Wstępnie ustaw górny i dolny magnesy wizualnie, umieszczając górny magnes prętowy bezpośrednio nad punktem centralnym dolnych magnesów pierścieniowych. W celu precyzyjnej regulacji warto przymocować górny magnes do mikromanipulatora (Siskiyou Inc.).
3. Przyklej za pomocą epoksydu łożysko V-jewel (Small Parts) do dolnej powierzchni górnego magnesu, aby zminimalizować tarcie obrotowe i ustandaryzować pozycjonowanie muchy.
4. Umieść muchę w arenie i dostosuj poziome oraz pionowe położenie górnego magnesu, aż mucha będzie mogła płynnie i stabilnie obracać się o 360 stopni w osi odchylenia (yaw axis). Każdą muchę należy sprawdzić pod kątem płynnego obrotu na początku każdego eksperymentu, aby upewnić się, że magnesy są prawidłowo ustawione, a poszczególne piny minutien nie są uszkodzone (patrz Część 1.11). Jeśli magnesy nie są prawidłowo ustawione, mucha może (i) w ogóle się nie obracać (ii) mieć ograniczony zakres ruchu (iii) obracać się z niestabilną prędkością. Jeśli problem zostanie rozwiązany poprzez zastąpienie muchy nowym okazem, najprawdopodobniej wynikało to z błędu w klejeniu (patrz Część 1). Jeśli problemy te występują przy każdej musze, prawdopodobnie jest to kwestia ustawienia magnesów i wymagana będzie dalsza regulacja.
5. Ostrzeżenie: choć zabawa z magnesami ziemskimi może być interesująca, są one bardzo niebezpieczne. Niewłaściwe użytkowanie prowadzi do uszkodzenia sprzętu i/lub lekkich obrażeń ciała. Zachowaj szczególną ostrożność w obchodzeniu się z tymi kuszącymi, lecz często niedocenianymi magnesami.

Część 3: Dostarczanie zapachów

1. System dostarczania zapachu opiera się na rozwiązaniu opisanym wcześniej [5] i jest najtrudniejszym elementem do zoptymalizowania (Rys. 1). Wymaga on dużej cierpliwości oraz metody prób i błędów. Wykonaj poniższe kroki, aby uzyskać stabilne śledzenie zapachu.
2. Wstępna konfiguracja systemu zapachowego wymaga poprowadzenia teflonowych rurek o małej średnicy (Small Parts) z multipleksera gazowego (Sable Systems International) do specjalnie wykonanych fiolek z wodą/zapachem. Wyloty tych fiolek łączą się bezpośrednio z rurkami portu hipodermicznego za pomocą tych samych teflonowych rurek.
3. Przezroczysta akrylowa komora próżniowa jest umieszczona pod areną, aby podtrzymywać magnesy. Stosujemy zamontowaną pod muchą szklaną rurkę o średnicy 4mm, połączoną z komorą próżniową, aby zbliżyć otwór próżniowy do muchy i zmniejszyć średnicę otworu.
4. Za pomocą pęsety umieść przymocowaną muchę na arenie.
5. Włącz atrakcyjny zapach (dobrze sprawdza się ocet jabłkowy) i wizualnie zweryfikuj, czy mucha śledzi zapach. Jeśli mucha nie wykazuje preferencji wobec zapachu, wykonaj kolejne trzy kroki. Może to wymagać użycia kilku much i przeprowadzenia kilku prób.
6. Reguluj położenie portu zapachowego, aż mucha zacznie śledzić zapach. Porty zapachowe zamontowaliśmy na mikromanipulatorach (Siskiyou Inc.) i ustawiliśmy 4mm grzbietowo oraz 3mm przed głową muchy.
7. Reguluj masowe natężenie przepływu, aż mucha zacznie śledzić zapach. Nasze ustawienia to 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
8. Reguluj natężenie przepływu próżni, aż mucha zacznie śledzić zapach. Natężenie przepływu próżni ustawiliśmy na 13l/min, korzystając z regulatora przepływu (Cole Parmer). Uwaga: Budynkowe linie doprowadzające próżnię mogą ulegać wahaniom w czasie, co powoduje zmiany w strukturze pióropusza zapachowego. W celu zapewnienia stałych warunków przepływu próżni warto podłączyć zewnętrzną pompę próżniową do regulatora przepływu.
9. Po ustawieniu pozycji portu i natężeń przepływu, okresowo przełączaj się między dostarczaniem pary wodnej a parą zapachową za pomocą multipleksera gazowego i wizualnie weryfikuj, czy mucha śledzi zapach tylko wtedy, gdy jest on podawany. Czasami pozostałości zapachu wewnątrz portu zapachowego mogą wywoływać śledzenie zapachu po jego wyłączeniu. Można to wyeliminować bez usuwania prawidłowo ustawionego portu zapachowego, wypełniając rurki hipodermiczne etanolem i zbierając go na końcu doprowadzającym za pomocą chusteczki Kimwipe. Używając sprężonego powietrza, wydmuchaj pozostały etanol i wznowij eksperymenty.

Reprezentatywne wyniki:

Przy prawidłowym wykonaniu tych kroków należy zaobserwować dwie rzeczy. Po pierwsze, podczas stałej stymulacji wizualnej rotacyjnej, mucha unieruchomiona w OMT powinna płynnie obracać się o 360 stopni w osi odchylenia (yaw). „Szarpane” obroty (zwane sakadami) są charakterystyczne dla spontanicznego zachowania obrotowego w przypadku braku stałych bodźców wizualnych. Jeśli muchy najwyraźniej nie potrafią obracać się płynnie, przyczyną może być niewłaściwe przyklejenie (patrz Część 1) lub źle ustawione magnesy (patrz Część 2). Po drugie, po włączeniu zapachu mucha powinna skierować się w stronę źródła zapachu. Po wyłączeniu zapachu mucha powinna wykonywać spontaniczne sakady, nie wykazując preferencji do żadnej konkretnej pozycji w arenie. Jeśli muchy nie śledzą aktywnie pióropusza zapachowego, konieczna może być korekta położenia wlotu zapachu, natężenia przepływu powietrza i/lub natężenia przepływu próżni (patrz Część 3).

Dyskusja

Przywiązanie much i wywołanie stabilnego śledzenia zapachu w tej arenie jest stosunkowo proste. Wymaga to jednak praktyki, cierpliwości oraz metody prób i błędów. Wiele elementów tej areny można dodatkowo zoptymalizować lub zastąpić, aby uzyskać warianty o innym potencjale eksperymentalnym. Na przykład nowsze wersje komory próżniowej są znacznie mniejsze i zapewniają więcej miejsca pod areną. Ponadto można nieco zmieniać siłę i rodzaj magnesów ziem rzadkich oraz dodać dodatkowe porty zapachowe, aby zwiększyć liczbę rodza...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stopień chłodzenia	Teca	LHP-300CP
Mosiężny blok chłodzący	Wykonany na zamówienie		~4 x 8 x 2cm
Sarkofag	Wykonany na zamówienie		Skontaktuj się z nami w celu uzyskania szczegółów
Klej utwardzany promieniami UV	Kemxert corp	KOA300	Butelka 1oz wystarcza na lata
System paneli	Caltech	http://www.dickinson.caltech.edu/panels	[4]
Pincety precyzyjne	Fine Science Tools	26002-20
Magnesy dolnego pierścienia	Rare-earth-magnets.com	NSN0615	5 - 0.75" średnica zewnętrzna x 0.375" średnica wewnętrzna x 0.125"
Magnes górnego pręta	Rare-earth-magnets.com	NSN0750	0.125" x 1"
Łożysko V-Jewel	Small Parts, Inc.	VJ-0469-01
Regulatory przepływu MFC-4	Sable Systems International
Multipleksor gazowy	Sable Systems International
Przewody teflonowe	Small Parts, Inc.	STT-20-C
Igły hipodermiczne 20G	Small Parts, Inc.	HTX-20R-06
Rurki szklane			4mm średnica zewnętrzna
Regulator przepływu próżni	Cole-Parmer	EW-32464-52