Mikrodruk białek w biologii komórki

Podsumowanie

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Streszczenie

Zdolność do nanoszenia białek i innych biomolekuł w określonym wzorze na podłoża jest istotna dla odwzorowania złożoności przestrzennej środowiska pozakomórkowego. Opracowanie druku mikrokontaktowego przez grupę Whitesidesa (http://gmwgroup.harvard.edu/) w połowie lat 90. zrewolucjonizowały tę dziedzinę, udostępniając techniki mikroelektroniki i mikrofabrykacji laboratoriom koncentrującym się na naukach o życiu. Pierwsze implementacje tej metody wykorzystywały stemple z polidimetylosiloksanu (PDMS) do tworzenia wzorów z funkcjonalizowanych substancji chemicznych na powierzchniach materiałów¹Od tego czasu opracowano szereg innowacyjnych podejść do rozmieszczania innych cząsteczek, w tym białek²Niniejszy film demonstruje podstawowy proces tworzenia stempli z PDMS oraz ich wykorzystanie do wzorowania białek, ponieważ kroki te są trudne do precyzyjnego opisania słownie. W ramach konkretnego przykładu wzorowania skupiamy się na nanoszeniu białka macierzy pozakomórkowej, fibronektyny, na szklane szkiełka podstawowe. Ważnym elementem procesu mikrodruku kontaktowego jest matryca topologiczna, z której odlewa się stemple; obszary wypukłe i wklęsłe matrycy są odwzorowywane w stemplu i definiują końcowy wzór. Zazwyczaj matryca składa się z wafla krzemowego pokrytego fotorezystem, a następnie wzorowanego metodą fotolitografii, tak jak zrobiono to w tym przypadku. Tworzenie matryc zawierających konkretny wzór wymaga specjalistycznego sprzętu i najlepiej jest podejść do tego w konsultacji z centrum lub zakładem mikrofabrykacji. Niemniej jednak, niemal każdy podłoże z określoną topologią może służyć jako matryca, np. plastikowe siatki dyfrakcyjne (patrz Odczynniki dla jednego z przykładów), a takie przypadkowe matryce zapewniają łatwo dostępne, proste wzory. Niniejszy protokół rozpoczyna się od momentu posiadania gotowej matrycy.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i materiałów

Powyższe kroki należy wykonać z kilkudniowym wyprzedzeniem.

1. Szklane szkiełka coverglass. Szkiełka oczyszczono poprzez 10-minutowe zanurzenie w roztworze detergentu Linbro 7X i wody w stosunku 1:3, podgrzewanym z mieszaniem do uzyskania przejrzystości. Szkiełka płukano obficie wodą dejonizowaną, a następnie wypalano w temperaturze 450°C przez 6 godzin. Proces ten ułatwiło umieszczenie szkiełek w ceramicznych kasetach do barwienia (patrz: Odczynniki).
2. Roztwór białka do stemplowania. Fibronektynę zrekonstytuowano zgodnie z instrukcją producenta do postaci roztworu stokowego o stężen....

Dyskusja

Proces mikrodyruków kontaktowych jest koncepcyjnie prosty i bardzo niezawodny, znajdując zastosowanie w nanoszeniu wzorów z szerokiej gamy cząsteczek na różnorodne podłoża. Niemniej jednak proces ten wciąż w pewnym stopniu opiera się na doświadczeniu i intuicji. Na jakość stemplowania wpływają: konkretna geometria tworzonego wzoru, rodzaj nanoszonego białka, przyłożona siła nacisku oraz warunki powlekania i stemplowania. Na przykład zbyt mały nacisk przy dużych elementach wzoru często prowadzi do powstania przerw, co wid.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczacz plazmowy		Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G
Eksykator		Nalge Nunc international	5315-0150
PBS	Odczynnik	Invitrogen	10010-072
Zestaw do znakowania białek	Odczynnik	Invitrogen	A30006
Fibronektyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F2006
Statyw do barwienia	Odczynnik	Thomas Scientific	8542E40
Szkiełka zakrywkowe	Odczynnik	Fisher Scientific	12-544-12
Sylgard 184	Odczynnik	Ellsworth Adhesives	184 Sil Elast Kit
Siatka dyfrakcyjna	Odczynnik	Edmund Scientific	3040267