Mikrodruk białek w biologii komórki

Podsumowanie

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Streszczenie

Zdolność do nanoszenia białek i innych biomolekuł w określonym wzorze na podłoża jest istotna dla odwzorowania złożoności przestrzennej środowiska pozakomórkowego. Opracowanie druku mikrokontaktowego przez grupę Whitesidesa (http://gmwgroup.harvard.edu/) w połowie lat 90. zrewolucjonizowały tę dziedzinę, udostępniając techniki mikroelektroniki i mikrofabrykacji laboratoriom koncentrującym się na naukach o życiu. Pierwsze implementacje tej metody wykorzystywały stemple z polidimetylosiloksanu (PDMS) do tworzenia wzorów z funkcjonalizowanych substancji chemicznych na powierzchniach materiałów¹Od tego czasu opracowano szereg innowacyjnych podejść do rozmieszczania innych cząsteczek, w tym białek²Niniejszy film demonstruje podstawowy proces tworzenia stempli z PDMS oraz ich wykorzystanie do wzorowania białek, ponieważ kroki te są trudne do precyzyjnego opisania słownie. W ramach konkretnego przykładu wzorowania skupiamy się na nanoszeniu białka macierzy pozakomórkowej, fibronektyny, na szklane szkiełka podstawowe. Ważnym elementem procesu mikrodruku kontaktowego jest matryca topologiczna, z której odlewa się stemple; obszary wypukłe i wklęsłe matrycy są odwzorowywane w stemplu i definiują końcowy wzór. Zazwyczaj matryca składa się z wafla krzemowego pokrytego fotorezystem, a następnie wzorowanego metodą fotolitografii, tak jak zrobiono to w tym przypadku. Tworzenie matryc zawierających konkretny wzór wymaga specjalistycznego sprzętu i najlepiej jest podejść do tego w konsultacji z centrum lub zakładem mikrofabrykacji. Niemniej jednak, niemal każdy podłoże z określoną topologią może służyć jako matryca, np. plastikowe siatki dyfrakcyjne (patrz Odczynniki dla jednego z przykładów), a takie przypadkowe matryce zapewniają łatwo dostępne, proste wzory. Niniejszy protokół rozpoczyna się od momentu posiadania gotowej matrycy.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i materiałów

Powyższe kroki należy wykonać z kilkudniowym wyprzedzeniem.

1. Szklane szkiełka coverglass. Szkiełka oczyszczono poprzez 10-minutowe zanurzenie w roztworze detergentu Linbro 7X i wody w stosunku 1:3, podgrzewanym z mieszaniem do uzyskania przejrzystości. Szkiełka płukano obficie wodą dejonizowaną, a następnie wypalano w temperaturze 450°C przez 6 godzin. Proces ten ułatwiło umieszczenie szkiełek w ceramicznych kasetach do barwienia (patrz: Odczynniki).
2. Roztwór białka do stemplowania. Fibronektynę zrekonstytuowano zgodnie z instrukcją producenta do postaci roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/ml.

2. Odlewanie stempli z matrycy topologicznej

Te kroki można wykonać z kilkudniowym wyprzedzeniem. Przechowywać stemplowane próbki wzorem do góry w przykrytym naczyniu, na przykład w naczyniu do hodowli tkankowej.

1. Usuń luźny kurz z matrycy, używając strumienia sprężonego, filtrowanego powietrza lub gazu obojętnego.
2. Umieść matrycę stroną z wzorem do góry na dnie plastikowego naczynia nieco większego niż sama matryca. Do tego celu odpowiednie są naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 lub 100 mm.
3. W polistyrenowej probówce do wirowania o pojemności 50 ml połącz komponenty Sylgard w stosunku utwardzacza do bazy elastomerowej wynoszącym 1:10 wagowo. Wymieszaj dokładnie za pomocą plastikowego przyrządu, np. jednorazowej pipety. Przygotuj co najmniej 0,2 ml elastomeru na centymetr kwadratowy powierzchni naczynia.
4. Wirować probówkę 50 ml przy 300 G przez 5 min, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
5. Wylej elastomer na matrycę, a następnie umieść go w eksykanie pod próżnią na 30 minut.
6. Utwardzaj elastomer w piecu w temperaturze 65°C przez co najmniej 2 godziny. Utwardzanie w wyższych temperaturach i przez dłuższy czas prowadzi do uzyskania sztywniejszego elastomeru. Pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
7. Oddziel arkusz stempli od matrycy.

3. Mikrodyruk fibronektyny na szkle

1. Wytnij pojedynczą stempelkę. Na początek najłatwiej zastosować stempelki o powierzchni od 4 mm X 4 mm do 1 cm X 1 cm i grubości 1 – 2 mm. Połóż stempelkę stroną z wzorem do góry na szkiełku przedmiotowym lub małym plastikowym naczyniu.
2. Umieść stempelkę w oczyszczaczu plazmowym i poddaj procesowi w próżni przez 30 sekund. Oczyszczacz plazmowy firmy Harrick Scientific (patrz Equipment), ustawiony na maksymalną moc, sprawi, że powierzchnia PDMS stanie się hydrofilowa. Dłuższy czas obróbki prowadzi do pękania elastomeru.
3. Rozcieńcz roztwór fibronektyny wodą dejonizowaną do stężenia stemplowania wynoszącego 50 µg/ml.
4. Nanieś małą kroplę (10 – 50 µl) roztworu do stemplowania na stempelkę. Rozprzestrzeni się on po hydrofilowej powierzchni. Dodaj tylko tyle roztworu, aby kropla pokryła stempelkę, ale nie wypływała poza jej krawędzie. Pozostaw białko do adsorpcji na stempelce przez 5 minut.
5. Za pomocą chusteczki Kimwipe® lub innej czystej papierowej serwetki odsącz większość roztworu białka ze stempelki, nie dotykając obszaru z wzorem.
6. Osusz pozostały na stempelce roztwór strumieniem czystego, suchego gazu obojętnego, np. azotu.
7. Za pomocą pęsety zdejmij stempelkę ze szkiełka, odwróć ją i dociśnij do oczyszczonego szkiełka nakrywkowego (powierzchni, na której ma powstać wzór). Połóż na górze obciążnik, aby zapewnić dobry kontakt. Konkretna masa obciążnika zapewniająca najlepsze stemplowanie zależy od rozmiaru stempelki i wzoru; zacznij od obciążnika 5 g i dostosowuj go między kolejnymi próbami. Pozostaw stempelkę w kontakcie z powierzchnią przez 1 minutę.
8. Ostrożnie rozdziel elementy i oddziel stempelkę od szkiełka nakrywkowego.
9. Intensywnie wypłucz wzorowane szkiełko nakrywkowe w PBS, a następnie w wodzie dejonizowanej, aby usunąć białko, które nie zaadsorbowało się na powierzchni. Osusz szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu.

 Reprezentatywne wyniki

Drukowanie mikroredukcyjne (microcontact printing) jest potężną metodą wzorowania cząsteczek na powierzchniach. Proces ten pozwala na tworzenie struktur o wymiarach od kilkunastu mikrometrów do kilkuset nanometrów; na rys. 1A logotypy po lewej stronie mają wysokość 200 µm, natomiast zielone kropki przedstawione na rys. 1B mają średnicę 1 µm i są rozmieszczone w odstępach 4 µm, mierzonych od środka do środka. Rys. 1B ilustruje również istotną właściwość drukowania mikroredukcyjnego, mianowicie to, że jest to proces addytywny. Wielokrotne cykle drukowania mikroredukcyjnego można zastosować na jednej powierzchni w celu stworzenia systemów wieloskładnikowych³.

Dyskusja

Proces mikrodyruków kontaktowych jest koncepcyjnie prosty i bardzo niezawodny, znajdując zastosowanie w nanoszeniu wzorów z szerokiej gamy cząsteczek na różnorodne podłoża. Niemniej jednak proces ten wciąż w pewnym stopniu opiera się na doświadczeniu i intuicji. Na jakość stemplowania wpływają: konkretna geometria tworzonego wzoru, rodzaj nanoszonego białka, przyłożona siła nacisku oraz warunki powlekania i stemplowania. Na przykład zbyt mały nacisk przy dużych elementach wzoru często prowadzi do powstania przerw, co wid...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczacz plazmowy		Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G
Eksykator		Nalge Nunc international	5315-0150
PBS	Odczynnik	Invitrogen	10010-072
Zestaw do znakowania białek	Odczynnik	Invitrogen	A30006
Fibronektyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F2006
Statyw do barwienia	Odczynnik	Thomas Scientific	8542E40
Szkiełka zakrywkowe	Odczynnik	Fisher Scientific	12-544-12
Sylgard 184	Odczynnik	Ellsworth Adhesives	184 Sil Elast Kit
Siatka dyfrakcyjna	Odczynnik	Edmund Scientific	3040267