Sygnały wapniowe odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w ekspresji genów, przeżywalności i różnicowaniu. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić obrazowanie wapnia z wykorzystaniem Fura-2 AM. Obrazowanie wapnia jest cennym narzędziem do badania w czasie rzeczywistym regulacji wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia oraz jego wpływu na kaskady sygnałowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie wapniowe neuronów korowych z użyciem Fura-2 AM
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie wapnia jest powszechną techniką przydatną do pomiaru sygnałów wapniowych w hodowlach komórkowych. Techniki obrazowania wapnia wykorzystują barwniki wskaźnikowe wapnia, które są organicznymi cząsteczkami opartymi na BAPTA, zmieniającymi swoje właściwości widmowe w odpowiedzi na wiązanie jonów Ca2+. Barwniki wskaźnikowe wapnia dzielą się na dwie kategorie: barwniki ratiometryczne, takie jak Fura-2 i Indo-1, oraz barwniki jednofalowe, takie jak Fluo-4. Barwniki ratiometryczne zmieniają swoje widma wzbudzenia lub emisji w odpowiedzi na obecność wapnia, co pozwala na wyznaczenie stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego na podstawie stosunku emisji lub wzbudzenia fluorescencji przy różnych długościach fal. Główną zaletą stosowania barwników ratiometrycznych nad sondami jednofalowymi jest fakt, że sygnał stosunku jest niezależny od stężenia barwnika, natężenia oświetlenia oraz długości drogi optycznej, co umożliwia określenie stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego niezależnie od tych artefaktów. Jednym z najczęściej stosowanych wskaźników wapnia jest Fura-2, który posiada szczyt emisji przy 505 nm i zmienia swój szczyt wzbudzenia z 340 nm na 380 nm w odpowiedzi na wiązanie wapnia. W niniejszym opracowaniu opisujemy zastosowanie Fura-2 do pomiaru wzrostu poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego w neuronach i innych komórkach pobudliwych.
Protokół
hodowla komórkowa
Komórki można hodować przy użyciu uznanych technik, jednak muszą one zostać wysiane na szklanych lamellkach nr 1 pokrytych adhezywem komórkowym (takim jak polilizyna, poliornityna lub laminina), aby zapobiec odrypaniu się lub przemieszczaniu komórek podczas eksperymentów obrazowych.
Roztwory
Eksperymenty z obrazowaniem wapnia można przeprowadzać z użyciem różnych roztworów fizjologicznych, w tym pożywek do hodowli komórkowych. Ważne jest jednak, aby upewnić się, że roztwory są wolne od czerwieni fenolowej, która znacznie zwiększa tło fluorescencyjne. Stosujemy roztwór Ty....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tej prezentacji omówiliśmy wszystkie etapy obrazowania wapnia z wykorzystaniem Fura-2 AM. Jako model wykorzystaliśmy neurony kory mózgowej, jednak obrazowanie wapnia można zastosować do pomiaru stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym w wielu rodzajach komórek. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest stosowanie szklanych szkiełek podstawowych zamiast plastikowych, ponieważ plastik często wykazuje fluorescencję w zakresie fal ultrafioletowych, co utrudnia obrazowanie. Ponadto istotne jest uprze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Nowy element | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Chronić przed światłem |
| Nowy element | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Przechowywać w suchym miejscu, aby zapobiec hydratacji |
| Nowy element | Albuminy z surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Przechowywać w 4° |
| Nowy element | Komora obrazowania | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| Nowy element | Mikroskop | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| Nowy element | Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Nowy element | Zestaw kalibracyjny | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Chronić przed światłem |
Bibliografia
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
