Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

Podsumowanie

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania macierzy mikrodrajwerów do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów.

Streszczenie

Przewlekłe rejestrowanie dużych populacji neuronów jest cenną techniką badania funkcji obwodów neuronalnych u czuwających, wykazujących określoną aktywność behawioralną szczurów. Lekkie urządzenia rejestrujące, wyposażone w matryce tetrod o wysokiej gęstości, umożliwiają jednoczesne monitorowanie aktywności od kilkunastu do kilkuset pojedynczych neuronów. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół wykonania matrycy mikro-napędów zawierającej dwadzieścia jeden niezależnie ruchomych mikro-napędów. Urządzenie to było z sukcesem wykorzystywane w naszym laboratorium do rejestracji z neuronów hipokampa i kory mózgowej. Przedstawiamy sposób przygotowania zaprojektowanej na zamówienie, wydrukowanej w technologii 3D plastikowej podstawy, która będzie utrzymywać mikro-napędy. Demonstrujemy, jak skonstruować poszczególne mikro-napędy oraz jak złożyć kompletną matrycę mikro-napędów. Dalsze przygotowanie matrycy do implantacji chirurgicznej, takie jak wykonanie tetrod, ich wprowadzenie do matrycy oraz pozłacanie, zostało omówione w kolejnym artykule wideo.

Protokół

1. Przegląd matrycy mikrozapędów
   
   Kompletna matryca mikrozapędów składa się z kilku głównych komponentów (Rys. 1):
   1. Zaprojektowana komputerowo plastikowa podstawa, w której osadzonych jest 21 niezależnie ruchomych mikrozapędów.
   2. Kaniula u dołu podstawy, w której zgromadzony jest zestaw stacjonarnych prowadnic dla tetrod.
   3. 21 mikrozapędów, z których każdy prowadzi jedną tetrodę i może być indywidualnie przesuwany za pomocą śruby.
   4. Płyta interfejsu elektrod służąca do połączenia tetrod z przedwzmacniaczami.
   5. Stożek ochronny (niewidoczny na Rys. 1)
   6. W w pełni zmontowanej matrycy mikrozapędów plastikowa podstawa utrzymuje wszystkie mikrozapędy. Każdy mikrozapęd prowadzi pojedynczą tetrodę. Tetroda jest połączona elektrycznie z płytą interfejsu elektrod na górze matrycy i przechodzi przez stacjonarną prowadnicę, aby wyjść w stronę mózgu u dołu matrycy. Obracanie śruby każdego mikrozapędu powoduje wysunięcie lub cofnięcie tetrody.


2. Projekt plastikowej podstawy
   
   Podstawę zespołu mikrozapędów projektujemy w oprogramowaniu CAD 3D (SolidWorks). Zaletą tego wewnętrznego procesu projektowania jest szybka realizacja i elastyczność. W laboratorium Wilsona zaprojektowaliśmy wiele wariantów tej części, dostosowanych do specyficznych wymagań każdego eksperymentu. Plik modelu 3D jest przesyłany do biura usług, gdzie jest on drukowany z żywicy ciekłej utwardzanej laserowo przy użyciu stereolitografii. Czas realizacji wynosi zaledwie 2 dni. Powstała część jest lekka, wielorazowa i może być obrabiana w celu wykonania gwintu. W niniejszym protokole użyjemy podstawy zapędowej zaprojektowanej dla jednego miejsca rejestracji, która pomieści 21 mikrozapędów. Projekt SolidWorks jest dostępny na żądanie.



3. Przygotowanie plastikowej podstawy
   
   Plastikowa podstawa jest obrabiana tak, aby pomieścić mikrozapędy oraz śruby do zamocowania płyty interfejsu elektrod i stożka ochronnego. Ponieważ nie jest możliwe niezawodne wydrukowanie gładkich otworów przelotowych w plastikowej podstawie, projektujemy otwory o zbyt małej średnicy, a następnie powiększamy je poprzez wiercenie. Przed wierceniem przy bardzo niskiej prędkości należy starannie wyrównać wiertło z osią istniejącego otworu. Do tego zadania dobrze nadaje się ręczna wiertarka z regulowaną prędkością i momentem obrotowym.
   1. Wywierć 21 otworów pilotażowych dla śrub mikrozapędów (zewnętrzny pierścień), używając wiertła #61.
   2. Wywierć 21 otworów dla rurek wsporczych mikrozapędów (wewnętrzny pierścień), używając wiertła #65.
   3. Wywierć otwory, które posłużą do zamocowania płyty interfejsu elektrod i stożka ochronnego, używając wiertła 1,55 mm.
   4. Wciśnij na pasowanie tulejkę (cienkościenna rurka ze stali nierdzewnej 20 Ga o długości 5 mm) do każdego otworu w wewnętrznym pierścieniu, używając pęsety lub szczypiec, tak aby była ona zrównana z plastikową podstawą. Tulejki zapewniają płynny ruch rurek wsporczych mikrozapędów.
      
      Następnie wykonuje się gwinty we wszystkich otworach przeznaczonych na śruby. W drukowanych tworzywach sztucznych gwintowniki formujące tworzą trwalsze gwinty niż typowe gwintowniki tnące. Ten rodzaj gwintownika wymaga większych otworów pilotażowych. Używając ręcznego uchwytu do gwintowników:
   
   
   5. Nawierć otwory dla śrub mikrozapędów, używając gwintownika dopasowanego do rozmiaru śruby (M1,2x0,25) oraz suchego smaru. Aby ułatwić wyrównanie gwintownika z otworem pilotażowym, wsuń kawałek rurki 23 Ga do sąsiedniej tulejki.
   6. Projekt naszej plastikowej podstawy zawiera prowadnice startowe dla każdego otworu na śruby mikrozapędów, aby upewnić się, że początkowe gwinty nie zostaną uszkodzone podczas procesu gwintowania. Po wykonaniu wszystkich gwintów prowadnice te można łatwo odłamać za pomocą żyletki.
   7. Nawierć otwory na śruby płyty interfejsu elektrod i stożka ochronnego, używając gwintownika 1-72.


4. Wkładanie prowadnic elektrod
   
   
   1. Aby przygotować kaniulę utrzymującą wszystkie stacjonarne prowadnice elektrod, odetnij kawałek rurki ze stali nierdzewnej 13 Ga o długości 1,5 cm i zmatowij powierzchnię szlifierką Dremel, aby zwiększyć przyczepność akrylu dentystycznego.
   2. Wsuń tę kaniulę do otworu u dołu plastikowej podstawy, upewnij się, że jest ona współosiowa z osią pionową zapędu i zabezpiecz ją akrylem dentystycznym lub epoksydem. Pozostaw od 5 do 7 mm kaniuli wystającej na zewnątrz, aby ułatwić implantację chirurgiczną.
   3. Odetnij żyletką 21 stacjonarnych prowadnic elektrod (elastyczna rurka polimidowa, średnica wewnętrzna: 0,0071", średnica zewnętrzna: 0,0116") do długości 6 cm.
   4. Wsuwaj prowadnice po jednej do tulejek na górze podstawy zapędowej, aż przejdą całkowicie przez kaniulę kolektorską na dole. Wizualnie sprawdź, czy nie ma załamań lub nadmiernych zgięć i w razie potrzeby wymień rurki. Aby ułatwić wkładanie i wyrównanie równoległe prowadnic tetrod, można zacząć od wsunięcia całego pęczka 21 prowadnic do kaniuli kolektorskiej od dołu. Następnie, po jednej, wyciągaj prowadnicę z pęczka i wsuwaj ją od góry plastikowej podstawy przez otwór, który pozostawiła w pęczku.
   5. Wsuń prowadnice w dół, aż będą wystawać tylko 1-2 mm ponad górną krawędź plastikowej podstawy. Nałóż niewielką ilość rzadkiego kleju cyjanoakrylowego na rurki w miejscu, gdzie opuszczają kaniulę kolektorską, uważając, aby klej nie wpłynął do wnętrza prowadnic.
   6. Użyj nowej żyletki, aby odciąć nadmiar pęczka prowadnic u dołu kaniuli kolektorskiej.
   
   
5. Wykonanie mikrozapędów
   
   Każdy mikrozapęd składa się z niestandardowej śruby i pustej rurki wsporczej (Rys. 2). Śruba i rurka wsporcza są połączone tak, że kołnierz śruby jest zatopiony w akrylu, co pozwala śrubie swobodnie się obracać (Rys. 2B). Śruba jest wkręcona w plastikową podstawę, a rurka wsporcza jest przesuwana w górę lub w dół podczas obracania śruby, co powoduje wysunięcie lub cofnięcie prowadzonej tetrody. Dla ułatwienia regulacji na zwierzęciu w trakcie zachowania, łeb śruby ma kształt półcylindra. Wykonaj niestandardowy śrubokręt do tej śruby:
   
   1. Odetnij 5 cm rurki ze stali nierdzewnej 15 Ga.
   2. Weź jedną z niestandardowych śrub i zeszlifuj wystający kołnierz.
   3. Wsuń śrubę do rurki, aż góra śruby zrówna się z końcem rurki.
   4. Zgnieć rurkę wokół gwintów śruby wielokrotnie za pomocą szczypiec nastawnych, tak aby śruba nie mogła obracać się względem kaniuli.
   5. Użyj uchwytu do gwintowników, aby trzymać ten niestandardowy śrubokręt.
      
      Do wykonania mikrozapędów używamy wydrukowanej w 3D plastikowej formy z małymi wgłębieniami (3 mm x 5 mm, głębokość 2 mm). Każde wgłębienie ma dwa otwory w dolnej powierzchni, w odstępie 2 mm, dla rurki wsporczej i śruby. Alternatywnie formy można wykonać z tworzywa technicznego, takiego jak Delrin, używając wiertarki stołowej do wykonania wgłębienia i otworów.
   
   
   6. Przygotuj formę, czyszcząc otwór na kaniulę wsporczą za pomocą igły 23 Ga i wykonując gwint w otworze na śrubę, zgodnie z opisem dla plastikowej podstawy powyżej.
   7. Wyłóż wnętrze wgłębienia smarem teflonowym lub cienką warstwą wazeliny, aby umożliwić wyjęcie utwardzonego akrylu dentystycznego z formy.
   8. Nałóż smar teflonowy na śrubę i wsuń ją do formy za pomocą wykonanego śrubokręta, aż gwinty znajdą się tuż poniżej dna wgłębienia.
   9. Zmatowij górne 2-3 mm rurki wsporczej o długości 14 mm (rurka ze stali nierdzewnej 23 Ga) za pomocą tarczy szlifierskiej, aby zwiększyć przyczepność akrylu dentystycznego. Wsuń ją do formy, aż góra kaniuli znajdzie się w połowie drogi między górą wgłębienia a górą śruby.
   10. Wlej akryl dentystyczny do wgłębienia. Stosuj ruchy mieszające, aby upewnić się, że akryl dentystyczny wypełni wszystkie przestrzenie wokół śruby i rurki wsporczej. Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą małej igły.
   11. Odczekaj, aż akryl dentystyczny całkowicie utwardzi się (15-30 minut), a następnie wyjmij mikrozapęd z formy, obracając śrubę przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
   12. Ważne jest przeprowadzenie kontroli jakości mikrozapędów. Sprawdź utwardzony akryl dentystyczny pod kątem pęknięć i/lub pęcherzyków powietrza, które zazwyczaj są spowodowane zbyt gęstym lub zbyt rzadkim akrylem. Upewnij się również, że śruba i rurka wsporcza są do siebie równoległe i że śruba obraca się płynnie. Śruby i rurki wsporcze mikrozapędów, które nie spełniają tych kryteriów, mogą zostać wyłamane z akrylu dentystycznego i poddane recyklingowi.
   13. Powtarzaj kroki od 5.6 do 5.11, aż uzyskasz 21 mikrozapędów.


6. Montaż końcowy matrycy mikrozapędów
   
   
   1. Umieść każdy mikrozapęd w plastikowej podstawie zapędowej. Każda rurka wsporcza mikrozapędu powinna poruszać się płynnie zarówno wewnątrz swojej tulejki, jak i nad stacjonarną prowadnicą. Sprawdź, czy prowadnice nie wyginają się podczas opuszczania mikrozapędu.
   2. Gdy mikrozapędy są całkowicie opuszczone, nałóż cienką warstwę akrylu dentystycznego do wnętrza podstawy zapędowej, aby przymocować prowadnice elektrod na miejscu.
   3. Uwaga: nieopuszczenie mikrozapędów do samego końca przed dodaniem akrylu dentystycznego spowoduje wciągnięcie akrylu w górę tulejek i zablokowanie ruchu mikrozapędów.
   4. Oznacz mikrozapędy numerami 1-21.
   5. Odwróć matrycę zapędową do góry nogami i zrób zdjęcie pęczkowi prowadnic. Zdjęcie to posłuży do zmapowania położenia prowadnicy odpowiadającej każdemu mikrozapędowi.
   6. Podnieś wszystkie mikrozapędy o kilka mm.
   7. Wsuń polimidową rurkę nośną (0,005") do każdej prowadnicy od dołu podstawy zapędowej. Pozwól rurce nośnej wystawać 1-2 mm ponad w pełni opuszczony mikrozapęd i zaznacz na zdjęciu tożsamość odpowiadającego mu mikrozapędu.
   8. Przyklej rurkę nośną do rurki wsporczej mikrozapędu, używając 5-minutowego epoksydu lub kleju cyjanoakrylowego. Pamiętaj, że zbyt rzadki klej lub epoksyd spłynie po kaniuli wsporczej i zablokuje swobodny ruch mikrozapędu lub, co gorsza, przytwierdzi go do kaniuli prowadzącej. Jeśli tak się stanie, dana jednostka mikrozapędu nie może być użyta.
   9. Całkowicie opuść wszystkie mikrozapędy. Odetnij wszystkie rurki nośne równo u dołu kaniuli kolektorskiej za pomocą nowej żyletki.
   10. Na koniec zamontuj płytę interfejsu elektrod Neuralynx do podstawy zapędowej za pomocą dwóch śrub (rozmiar: 1-72, długość: 3/16").

W tym momencie macierz napędów jest gotowa do załadowania tetrodami. Tematami kolejnego artykułu wideo będą wykonanie tetrod, sposób ich ładowania do mikro-napędów oraz przygotowanie macierzy napędów do implantacji chirurgicznej.

Rycina 1. Model gotowego zestawu mikronapędów. Zestaw mikronapędów składa się z kilku głównych komponentów: plastikowej podstawy napędów; kaniuli zbierającej, przez którą tetrody wnikają do mózgu; 21 mikronapędów, z których każdy napędza pojedynczą tetrodę; oraz płytki interfejsu elektrod łączącej się z przedwzmacniaczami.

Rycina 2. Specjalistyczne śruby do mikro-napędu. A. Rysunki techniczne projektu specjalistycznej śruby. Śruba posiada część gwintowaną (M1.2x0.25; średnica 1.2 mm, 0.25 mm / obrót), łeb w kształcie półcylindra dopasowany do naszego specjalistycznego śrubokręta oraz część gładką z kołnierzem (patrz szczegół). B. Model kompletnego mikro-napędu. Rurka wsporcza i specjalistyczna śruba są połączone cementem dentystycznym. Kołnierz na śrubie jest zatopiony w cemencie dentystycznym, co umożliwia swobodny obrót podczas przesuwania rurki wsporczej w górę lub w dół.

Pliki dodatkowe

Zaprojektowaliśmy wydrukowaną podstawę napędu, stożek ochronny oraz formę do konstrukcji mikro-napędów w oprogramowaniu SolidWorks 2008 3D CAD:

• Pobierz plik: DriveBase.sldprt, który zawiera modele podstawy napędu, stożka ochronnego i nakrętki.
• Pobierz plik: MicroDriveMold.sldprt, który zawiera model formy mikro-napędu

Biuro usług druku 3D nie może przetwarzać natywnych plików Solidworks; zamiast tego wymaga plików projektowych w formacie CAD stereolitografii (STL). Dla osób, które nie mają dostępu do oprogramowania Solidworks, a chcą skorzystać z części drukowanych użytych w artykule wideo, udostępniamy również projekty w formacie STL:

• Pobierz plik: DriveBase.stl, który zawiera model podstawy napędu
• Pobierz plik: MicroDriveMold.stl, który zawiera model formy mikronapędu
• Pobierz plik: ProtectionCap.stl, który zawiera model nakrętki stożka ochronnego
• Pobierz plik: ProtectionCone.stl, który zawiera model stożka ochronnego

Poprawki do tych plików oraz dodatkowe modele są śledzone na githubie.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje ogólne cechy procesu budowy mikropopychacza (micro-drive). Został on z powodzeniem zmodyfikowany w celu stworzenia macierzy popychaczy z wieloma punktami rejestracji lub mniejszych macierzy do pomiarów u myszy. Oprócz rejestracji z hipokampa wielu badaczy wykorzystuje te urządzenia do celowania w struktury korowe i podkorowe. W celu rejestracji z głębszych struktur mózgu może być wymagane zastosowanie dłuższych śrub. Dzięki rozbudowanej modyfikacji podstawy popychacza, zamiast modeli obracanych...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plastikowe elementy drukowane w 3D	Materiał	American Precision Prototyping (www.approto.com)
rurki ze stali nierdzewnej	Materiał	Small Parts (www.smallparts.com)
Proszek do cementu dentystycznego	Materiał	A-M Systems (www.a-msystems.com)	525000
Rozpuszczalnik do cementu dentystycznego	Materiał	A-M Systems	526000
Płyta interfejsu elektrod	Materiał	Neuralynx (www.neuralynx.com)	EIB-81
śruby do mikro-napędu	Materiał	Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com)
’Smar do gwintowania Tap-Ease’	Narzędzie	AGS Company	TA-2
Rurki polimidowe	Materiał	IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com)
Wiertarko-wkrętarka akumulatorowa	Narzędzie	DeWalt (www.dewalt.com)	DC750KA
Zestaw narzędzi rotacyjnych o regulowanej prędkości z elastycznym wałem	Narzędzie	Dremel (www.dremel.com)	3956-02
Żyletki	Narzędzie	VWR (www.vwr.com)	55411-050
Szkiełko zegarkowe	Narzędzie	VWR	66112-107
Gwintownik do śrub niestandardowych	Narzędzie	Balax	01302
Gwintowniki	Narzędzie	Small Parts	HSBT-0172, HSBT-0080
Uchwyt precyzyjny	Narzędzie	Vargus	3SHC1--I
Wiertła	Narzędzie	Small Parts
Imadło stołowe	Narzędzie	Panavise	301
Pinceta Dumont nr 2	Narzędzie	Stoelting (www.stoeltingco.com)	52100-27
Epoksyd 5-minutowy	Narzędzie	Allied Electronics (www.alliedelec.com)
Pinceta Accu-Tek z końcówką z włókna węglowego	Narzędzie	Aven (www.aveninc.com)	18768 (Pattern 304)
Mikronożyczki do sekcji	Narzędzie	Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com)	25-1000
Szczypce Xcelite 378M	Narzędzie	Newark	96F8903
mini uchwyt precyzyjny	Narzędzie	MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)	00920314